專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌種及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，具體涉及一株枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石油是關(guān)系國民經(jīng)濟命脈的戰(zhàn)略性資源，經(jīng)過經(jīng)過一次、二次兩次常規(guī)采油之后的總采收率一般只能占地下原油的30% 40%。三次采油(EOR)技術(shù)是一項能夠利用物理、 化學(xué)和生物等技術(shù)提高原油采收率的重要油田開發(fā)技術(shù)。在過去數(shù)十年內(nèi)，美國、加拿大和委內(nèi)瑞拉等石油大國都把如何提高原油采收率作為研究工作的重點目標。隨著社會經(jīng)濟持續(xù)快速增長，我國對油氣需求量也不斷增加。因此，運用三次采油技術(shù)來原油提高采收率， 是減緩我國多數(shù)油田產(chǎn)量遞減速度、維持原油穩(wěn)產(chǎn)的戰(zhàn)略需要?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subfilis)即是通過篩選得到的一株驅(qū)油用菌株，可以在油層內(nèi)生長繁殖，代謝產(chǎn)生脂肽類生物活性物質(zhì)及蛋白酶類物質(zhì)，起到剝離原油、油井解堵、提高采收率的功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能改善原油物性、提高采收率的枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subf ilis) CAWB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289o一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subf ilis) CAWB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289 的培養(yǎng)方法，是按5%的接種比例將枯草芽孢桿菌(Macillus subf ilis )CAWB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289接種至液體培養(yǎng)基中，在35°C的溫度條件下恒溫通氣培養(yǎng)；
液體培養(yǎng)基配方為每IOOml水中含，酵母提取物0. 5g，蔗糖2g，磷酸氫二鉀0. 8g，磷酸二氫鉀 0. 05g，pH6. 8。所述的培養(yǎng)時間為48小時； 所述的溶解氧條件為5-7mg/L。所述的一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillussubfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289在低滲透性油田三次開發(fā)中提高采收率中的應(yīng)用。一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289 在制備提高原油采收率生物制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌株CAWB 16-8-3，可以顯著降低接觸角，4 脫油效率可達45%左右；該菌可以有效驅(qū)替出巖心內(nèi)部飽和原油，使巖心驅(qū)替效率增加15%左右。此外，該菌培養(yǎng)方法簡單易操作，生長繁殖迅速，具有擴大化生產(chǎn)的可行性?；谏鲜鎏攸c，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株CAWB 16-8-3可用于油田的三次開發(fā)，提高洗油效率，降低含水，
3解除油井堵塞，增加產(chǎn)油量，提高原油采收率，并可借此開發(fā)出相應(yīng)的生物制劑，用于環(huán)保污水治理，具有較高的科研、應(yīng)用及市場價值。


圖1為枯草芽孢桿菌CAWB 16-8-3的生長曲線。圖2為枯草芽孢桿菌CAWB 16-8-3電鏡照片。圖3為枯草芽孢桿菌CAWB 16-8-3附著在巖芯表面的照片。圖4為枯草芽孢桿菌CAWB 16-8-3枯深入巖芯孔的照片。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subfilis)CAWB 16_8_3，已與2011 年8月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO. M2011289o以下實施例用于說明本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。以下實施例中所涉及的培養(yǎng)基為 所用培養(yǎng)基
X 富集用液體培養(yǎng)基=NaNO3 1. 5g，(NH4) 2S04 1. 5g，K2HPO4 lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KCl 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 0. 002g，蒸餾水 1000ml，原油 5g, pH6. 8。.t分離培養(yǎng)基為富集用液體培養(yǎng)基中添加1瓊脂。f血平板培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基中添加5%新鮮羊血。Z脫脂奶粉培養(yǎng)基牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，NaC10.5g，瓊脂2.0g，進口脫脂奶粉 3g，蒸餾水 100ml，pH7. 0 7. 2。實施例一枯草芽孢桿菌菌株(Bacillussubfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289的分離篩選與純化
1、石油降解菌株的富集與分離將5g油泥樣品加入IOOml培養(yǎng)基I中，35°C、150r/
min搖床培養(yǎng)7d。待培養(yǎng)液混濁后，吸取5ml培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基I.中，與上述培養(yǎng)條件相同連續(xù)轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)3次。采用稀釋平板法進行分離，將培養(yǎng)液系列稀釋后，取 100 μ 1稀釋液涂布于培養(yǎng)基f中，培養(yǎng)48h;待平板長出菌落后選擇不同顏色及形態(tài)的單菌落，分別回接于培養(yǎng)基①和②中，在兩種培養(yǎng)基中均能生長的即為石油降解微生物。
2、表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選由于表面活性劑具有降低表面張力的作用，可使紅細胞破裂并釋放血紅素出現(xiàn)溶血圈，因此采用血平板法篩選。挑取活化好的石油降解菌株一環(huán)，點接于血平板上，35°C培養(yǎng)3d后若有溶血圈出現(xiàn)，證明該菌能產(chǎn)生表面活性劑。3、蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)，因此以脫脂奶粉為蛋白質(zhì)源的
培養(yǎng)基作為篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基。挑去表面活性劑產(chǎn)生菌株一環(huán)，點接于培養(yǎng)基 上，35°C培養(yǎng)3d后若有溶解圈出現(xiàn)，證明該菌能產(chǎn)生蛋白酶。4、純化挑取單菌落，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基1.中，35°C，120r/min振蕩培養(yǎng)，至菌濃度達
到107-108CFU/ml，取100 μ 1涂布于LB固體培養(yǎng)基上，檢測純度，直至獲得純種菌株。實施例二枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289的培養(yǎng)方法
(一)培養(yǎng)基的配方優(yōu)化
1、碳源優(yōu)化考察了枯草芽孢桿菌菌株(Macillus subfilis ) CAffB
16-8-3 CCTCC NO. M2011289對葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、酵母浸膏等幾種碳源的利用情況，具體方法為采取單因素分析試驗，固定氮源成分為酵母提取物5g/L，改變碳源成分為葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、酵母浸膏等(均為20g/L)，接種枯草芽孢桿菌菌株OfeciBm subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289, 35°C，120r/min 振蕩培養(yǎng) 48h，測定 0D_，確定細菌生長情況，試驗結(jié)果顯示，蔗糖為適宜的碳源。2、氮源優(yōu)化考察了枯草芽孢桿菌菌株UaciBm subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC N0.M2011289對蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物這幾種氮源的利用情況， 具體方法為采取單因素分析試驗，固定碳源成分為蔗糖(20g/L)，改變氮源成分為蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物(含量均為5g/L)，接種枯草芽孢桿菌菌株OfeciBm subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289, 35°C，120r/min 振蕩培養(yǎng) 48h,測定 OD600,確定細菌生長情況，試驗結(jié)果顯示，酵母提取物為適宜的氮源。發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交試驗通過正交試驗確定枯草芽孢桿菌OfeciBm subfHisXkm 16-8-3 CCTCC NO. M2011289發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的最佳添加量，被考察因子與水平數(shù)如下
表1發(fā)酵培養(yǎng)基組分察因子與水平數(shù)列表
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289o
2.一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subfilis)CAffB 16-8-3 CCTCC N0.M201U89 的培養(yǎng)方法，是按5%的接種比例將枯草芽孢桿菌UaciBm subfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289接種至液體培養(yǎng)基中，在35°C的溫度條件下恒溫通氣培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基配方為每IOOml水中含，酵母提取物0. 5g，蔗糖2g，磷酸氫二鉀0. 8g，磷酸二氫鉀 0. 05g，pH6. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillussubfilis) CAffB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)時間為48小時；所述的溶解氧條件為5-7mg/L。
4.權(quán)利要求1所述的一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillussubfilis)CAWB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289在低滲透性油田三次開發(fā)中提高采收率中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一株枯草芽孢桿菌菌株(Bacillussubfilis)CAWB 16-8-3 CCTCC NO. M2011289在制備提高原油采收率生物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌是通過篩選得到的一株驅(qū)油用菌株，可以在油層內(nèi)生長繁殖，代謝產(chǎn)生脂肽類生物活性物質(zhì)及蛋白酶類物質(zhì)，起到剝離原油、油井解堵、提高采收率的功效。本發(fā)明是按5%的接種比例將枯草芽孢桿菌(Bacillussubfilis)CAWB16-8-3CCTCCNO.M2011289接種至液體培養(yǎng)基中，在35℃的溫度條件下恒溫通氣培養(yǎng)；液體培養(yǎng)基配方為每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氫二鉀0.8g，磷酸二氫鉀0.05g，pH6.8。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌株CAWB16-8-3，可以顯著降低接觸角，48h脫油效率可達45%左右；該菌可以有效驅(qū)替出巖心內(nèi)部飽和原油，使巖心驅(qū)替效率增加15%左右。
文檔編號C09K8/582GK102409017SQ20111041929
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者孫衛(wèi), 孫葉芳, 薛姝雯, 陳富林 申請人:西北大學(xué), 西安瑞捷生物科技有限公司