專(zhuān)利名稱(chēng)：聚合物及具有所述聚合物的熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
上述大量的聚氨基酸已商品化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易購(gòu) 買(mǎi)和使用合適的聚氨基酸。此外，也可通過(guò)連續(xù)的肽液相合成法或肽 固相合成法，或N-羧酸酐(NCA)法合成聚氨基酸。
對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料同實(shí)施例2-1中一樣對(duì)PGA-NR的水溶液(濃度為 lmg/mL)進(jìn)行熒光測(cè)量。其激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，且測(cè)量了熒光強(qiáng)度 呈600 - 660nm的最大熒光波長(zhǎng)值。如圖3所示，當(dāng)PAG-NR水溶液 的pH值發(fā)生變化時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。觀察到熒光強(qiáng)度隨著pH值 的降低而增大。與此相比，在pH值^7時(shí)，熒光強(qiáng)度沒(méi)有改變。在pH 值為4時(shí)的熒光強(qiáng)度相比pH值為7.4時(shí)的熒光強(qiáng)度增大了約2.4倍。 因?yàn)镈EAHB不溶于水，未進(jìn)行單獨(dú)染料的焚光測(cè)量。上述結(jié)果表明， 有尼羅紅衍生物(其為溶劑化熒光變色染料)被導(dǎo)入到聚谷氨酸的基 團(tuán)的熒光探針PAG-NR在pH值< 7.4時(shí)表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度增大。因此， 可將所述探針用于檢測(cè)pH值從生理pH值7.4的降低。此外，與 PGA-AN相比，其激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)位于更長(zhǎng)的波長(zhǎng)側(cè)(^550nm)， 發(fā)現(xiàn)這種熒光探針更適用于細(xì)胞和活體組織。 實(shí)施例2-3
對(duì)PGA-AN-Gel在水中的熒光強(qiáng)度的pH依賴(lài)性的測(cè)量 [0069同實(shí)施例2-1中一樣對(duì)PGA-AN-Gel的水溶液(濃度為 lmg/mL)進(jìn)行熒光測(cè)量。其激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，且測(cè)量了熒光強(qiáng)度 呈440 - 470nm的最大熒光波長(zhǎng)值。如圖4所示，當(dāng)PGA-AN-Gel水 溶液的pH值發(fā)生變化時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。觀察到熒光強(qiáng)度隨著pH 值的降低而增大。而在pH值為3時(shí)的熒光強(qiáng)度相比pH值為7.4時(shí)的 熒光強(qiáng)度增大了約1.6倍。
[0070上述結(jié)果證明，可將通過(guò)納米水凝膠化PGA-AN而得到的熒光探針同未經(jīng)水凝膠化的熒光探針一樣用作可檢測(cè)pH值從生理 pH值7.4降低的熒光探針。 實(shí)施例2-4
對(duì)PGA-AN1在10%血清中的熒光強(qiáng)度的pH依賴(lài)性的測(cè)量.
[0071同實(shí)施例2-1中一樣對(duì)PGA-AN1的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)(探針濃度為lmg/mL)進(jìn)行熒光測(cè)量，所述溶液含有10% 的胎牛血清(FCS )。其激發(fā)波長(zhǎng)為350nm,且測(cè)量了熒光強(qiáng)度呈440 -470nm的最大熒光波長(zhǎng)值。如

圖1的黑色圓點(diǎn)所示，當(dāng)PAG-NR水 溶液的pH值發(fā)生變化時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。觀察到熒光強(qiáng)度隨著pH 值的降低而增大。與此相比，在pH值^7時(shí)，熒光強(qiáng)度沒(méi)有改變。在 pH值^4.6時(shí)，觀察到探針沉淀。在pH值為5時(shí)的熒光強(qiáng)度比pH值 為7時(shí)的熒光強(qiáng)度增大了約4倍。作為比較例，圖l中用白色圓點(diǎn)描 繪了對(duì)單獨(dú)染料(即苯胺基萘磺酸)的熒光強(qiáng)度的pH依賴(lài)性。如圖 1所示，未觀察到熒光強(qiáng)度的pH依賴(lài)性。上述結(jié)果表明，可將有苯 胺基萘基(其為溶劑化熒光變色染料)被導(dǎo)入到聚谷氨酸側(cè)鏈上的聚 合物PAG-AN1用作可甚至在10%的血清溶液中維持pH應(yīng)答性功能 的熒光探針。
實(shí)施例2-5
對(duì)PGA-AN1的熒光強(qiáng)度對(duì)血清濃度的依賴(lài)性的評(píng)價(jià) [0072通過(guò)測(cè)量PGA-AN1的熒光強(qiáng)度對(duì)血清濃度的依賴(lài)性來(lái)評(píng) 價(jià)了 PGA-AN1和血清蛋白的相互作用。將單獨(dú)染料(即苯胺基萘磺 酸)用作用于進(jìn)行比較的低分子探針。此外，還將當(dāng)環(huán)境酸化時(shí)焚光 強(qiáng)度以pH依賴(lài)性方式升高的LysoSensorTM Blue DND-167( Invitrogen 公司生產(chǎn)；激發(fā)波長(zhǎng)為373nm，熒光波長(zhǎng)為425nm )用作用于進(jìn)行比 較的低分子pH應(yīng)答性探針。將各探針溶液加入含0、10。/。和100。/。FCS 的PBS中，然后充分混勻以測(cè)量熒光強(qiáng)度。圖5描繪了 FCS濃度與 經(jīng)無(wú)血清PBS溶液中的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化的熒光強(qiáng)度間的關(guān)系。使用低 分子探針時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著血清濃度的增大而增大。此焚光強(qiáng)度的增 大顯然是由所述探針與血清蛋白通過(guò)疏水相互作用結(jié)合所致。與此相比，PGA-AN1甚至在100%的FCS中都觀察不到顯著的熒光強(qiáng)度變 化，這表明，PGA主鏈抑制染料和血清蛋白的相互作用。上述結(jié)果表 明，在本發(fā)明的熒光探針中，多肽主鏈有兩個(gè)作用pH應(yīng)答性和抑 制染料-蛋白相互作用。 實(shí)施例3-1
本發(fā)明的溶劑化熒光變色染料的定義
[0073將共七種熒光染料溶于DMF和PBS中，并測(cè)量它們的熒 光強(qiáng)度，其中所述染料為苯胺基萘磺酸鎂(ANS)和苯胺基萘的衍 生物——苯胺基萘亞胺(ANM)，尼羅紅(NR)和尼羅紅衍生物一 —9-二乙氨基-2-羥基-5H-苯并[al吩碌、溱-5-酮(NROH ) ， Cy5、 Cy5.5 和LysoSensorTM Blue DND-167 ( LS )。所有染料均以0.3 - lmM的 DMSO溶液作為原液，并通過(guò)用PBS或DMF將其稀釋1000倍而得 到測(cè)量樣品。樣品濃度為ANS為3pM， ANM、 NR、 NROH、 Cy5 和LS為lfiM，且Cy5.5為0.6nM。激發(fā)坡長(zhǎng)ex/焚光坡長(zhǎng)emDMF、 emPBS (均以nm表示)如下ANS ( ex350/em468、 em520 ) 、 ANM (ex350/em456 、 em520 ) 、 NR ( ex550/em622 、 em660 ) 、 NROH (ex550/em616、 em659 ) 、 Cy5 ( ex650/em677、 em665 ) 、 Cy5.5 (ex678/em710、 em690 )及LS ( ex373/em439、 em429 )。這些結(jié)果 示于圖10。如圖所示，本發(fā)明的溶劑化熒光變色染料在DMF中的熒 光強(qiáng)度比在PBS中的熒光強(qiáng)度高20倍以上。
[0074這些實(shí)施例證明本發(fā)明提供了新型聚合物探針，當(dāng)所述探 針被置于pH值約為5.5的環(huán)境中時(shí)比被置于pH值約為7.4的環(huán)境中 時(shí)具有更高的熒光強(qiáng)度，并且可產(chǎn)生相對(duì)高的熒光強(qiáng)度。
[0075這些實(shí)施例也證明，可將本發(fā)明的聚合物和熒光探針用于 相對(duì)精確檢測(cè)高度惡性腫瘤位點(diǎn)(即pH值約為5.5的那些位點(diǎn))。
[0076雖然參照例示實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)了解本發(fā)明不僅 限于所公開(kāi)的例示實(shí)施例。需對(duì)以下權(quán)利要求進(jìn)行最款范圍的闡釋?zhuān)?以涵蓋所有可能的修飾，等效結(jié)構(gòu)和功能。
權(quán)利要求
1.具有對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料的聚合物，其中當(dāng)所述聚合物周?chē)膒H值降低至等于或大于5.5并小于7.4的范圍內(nèi)時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲變成螺旋結(jié)構(gòu)，且所述對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料周?chē)氖杷陨摺?br> 2. 具有對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料和聚氨基酸的聚合物，其中當(dāng) 所述聚氨基酸周?chē)膒H值降低至等于或大于5.5并小于7.4時(shí)，所述 聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則巻曲變成螺旋結(jié)構(gòu)，且所述對(duì)疏水環(huán)境敏 感的熒光染料周?chē)氖杷陨摺?br> 3. 權(quán)利要求2的聚合物，其中所述聚氨基酸是聚谷氨酸。
4. 權(quán)利要求l的聚合物，其中所述對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料是 溶劑化熒光變色染料。
5. 權(quán)利要求4的聚合物，其中所述溶劑化熒光變色染料是苯胺基 萘、尼羅紅、丹磺酰、硝基苯并噁二唑、芘和它們的衍生物中的至少 一種。
6. 用于檢測(cè)活體病變位點(diǎn)的焚光探針，其包含權(quán)利要求l的聚合物。
7. 權(quán)利要求l的聚合物，其中當(dāng)所述聚合物周?chē)膒H值降低至 等于或大于5.5并小于6.9時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則巻曲變 成螺旋結(jié)構(gòu)。
8. 權(quán)利要求2的聚合物，其中當(dāng)所述聚合物周?chē)膒H值降低至 等于或大于5.5并小于6.9時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則巻曲變 成螺旋結(jié)構(gòu)。
9. 含對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料的聚合物，其中當(dāng)pH值為7.4 時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則巻曲的機(jī)率比其為螺旋結(jié)構(gòu)的機(jī) 率高；而當(dāng)pH值為5.5時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)為螺旋結(jié)構(gòu)的機(jī) 率比其為無(wú)規(guī)則巻曲的機(jī)率高。
10. 含聚合物和對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料的熒光探針，其中所述探針在pH值為5,5時(shí)的熒光強(qiáng)度高于其在pH值為7.4時(shí)的熒光強(qiáng) 度，這是由所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則巻曲變成螺旋結(jié)構(gòu)所致。
11. 權(quán)利要求10的熒光探針，其中所述聚合物包括糖鏈、聚氨基 酸和它們的書(shū)于生物中的至少一種。
12. 權(quán)利要求10的熒光探針，其中所述對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染 料周?chē)氖杷噪S著所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則巻曲變成螺旋結(jié)構(gòu)而升高o
全文摘要
具有對(duì)疏水環(huán)境敏感的熒光染料的聚合物。當(dāng)所述聚合物周?chē)膒H值降低至等于或大于5.5并小于7.4時(shí)，所述聚合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲變成螺旋結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C09B69/10GK101638523SQ20091016501
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者山內(nèi)文生 申請(qǐng)人:佳能株式會(huì)社