生物芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種生物忍片。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如帕金森氏綜合癥、ALS、阿爾茨海默病等是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重 大難題。醫(yī)學(xué)研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)可通過(guò)自身內(nèi)源性干細(xì)胞來(lái)修復(fù)。通過(guò)神經(jīng)組織損傷 后釋放各種趨化因子，吸引神經(jīng)干細(xì)胞聚集到損傷部位，并在局部微環(huán)境的作用下分化為 不同種類的細(xì)胞，從而修復(fù)及補(bǔ)充損傷的神經(jīng)細(xì)胞。同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞可W增強(qiáng)神經(jīng)突觸之 間的聯(lián)系，建立新的神經(jīng)環(huán)路。但是由于運(yùn)些原始神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量稀少且處于靜止?fàn)顟B(tài)，缺 乏特異性形態(tài)、表面標(biāo)志和分化抗原，因此至今也不能高度純化分離、并且很難克隆化。因 此外界大量的培養(yǎng)移植神經(jīng)干細(xì)胞是唯一有效的方法。
[0003] 臨床及研究結(jié)果表明，神經(jīng)干細(xì)胞具有較好的生物學(xué)特性，它們能自我復(fù)制并在 體外大量增殖，移植在宿主體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞具有明顯的生存、遷移和分化能力，并能顯著促 進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。目前，神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)多采取細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)孔板等方式。 移植神經(jīng)干細(xì)胞所使用的方法主要包括局部注射移植、經(jīng)腦脊液注射移植、經(jīng)血液循環(huán)注 射移植。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用表明傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法難W提供神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化 所需的復(fù)雜多層次的微環(huán)境，使研究結(jié)果與體內(nèi)真實(shí)情況相差甚遠(yuǎn)，難W滿足干細(xì)胞多方 面研究的需要。傳統(tǒng)的移植方法效率低、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大、危及生命，并且成本高，阻礙了神經(jīng)干 細(xì)胞的應(yīng)用。因此，尋求一種高度模擬、并且可W控制的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，及安全可 靠的移植方法成為神經(jīng)干細(xì)胞研究的難點(diǎn)。
[0004] 微流控技術(shù)是一口設(shè)及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料和生物醫(yī)學(xué)工程的新興交 叉學(xué)科。它將生物和化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的功能，例如細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)等基本操作單元集成在可控 的微小的忍片上，在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，準(zhǔn)確獲取樣品中的大量信息。微流控忍 片是Ξ維培養(yǎng)體系，可W高度模擬生物體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，精確控制物質(zhì)濃度、pH值等細(xì)胞 微環(huán)境要素，可W將多種操作單元靈活組合，使得細(xì)胞進(jìn)樣、培養(yǎng)、捕獲、裂解和分離檢測(cè)等 過(guò)程在一塊忍片上即可完成。微流控忍片能夠提供傳統(tǒng)方法不具備的高精度和可控制的細(xì) 胞研究條件，為細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的飛躍。近年來(lái)，微流控技術(shù)帶來(lái)了在細(xì)胞體外培養(yǎng)的 革新，成功實(shí)現(xiàn)了多種細(xì)胞在體外培養(yǎng)。然而神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境十分復(fù)雜，比普通細(xì)胞 的環(huán)境要求更為苛刻。同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化受一系列因子的影響，如細(xì)胞與細(xì)胞 及細(xì)胞與基質(zhì)間的反應(yīng)，液體剪切力、微通道流場(chǎng)分布、換液速度。制造更適宜神經(jīng)干細(xì)胞 培養(yǎng)的，高集成化、高通量的結(jié)構(gòu)是微流控發(fā)展的核屯、問(wèn)題。同時(shí)，基于微流控忍片的神經(jīng) 干細(xì)胞移植領(lǐng)域也是一片空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 技術(shù)問(wèn)題
[0006] 本發(fā)明是鑒于上述情況而提出的，目的在于提供一種生物忍片，其能夠提供更加 接近于細(xì)胞生長(zhǎng)小生境的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞尤其是神經(jīng)干細(xì)胞的體外可控的、高通量的培 養(yǎng)。
[0007] 為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案。
[0008] 本發(fā)明設(shè)及的生物忍片，其包括細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層和密封微孔膜，所述密封微孔 膜覆蓋在所述細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層之上，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層包括細(xì)胞培養(yǎng)室和分 別設(shè)于所述細(xì)胞培養(yǎng)室兩側(cè)的進(jìn)液口及出液口，所述細(xì)胞培養(yǎng)室由多個(gè)微結(jié)構(gòu)體排列形 成，所述進(jìn)液口與細(xì)胞培養(yǎng)室之間設(shè)有進(jìn)液通道，所述細(xì)胞培養(yǎng)室與出液口之間設(shè)有出液 通道使得所述進(jìn)液口、細(xì)胞培養(yǎng)室和出液口連通。
[0009] 其中，所述所述進(jìn)液口、出液口、進(jìn)液通道、出液通道W及細(xì)胞培養(yǎng)室的深度為80μ m至150皿。
[0010] 其中，所述微結(jié)構(gòu)體為六邊形微結(jié)構(gòu)體，該六邊形微結(jié)構(gòu)體的尺寸為內(nèi)接圓直徑 為10皿至40皿、深度為ΙΟμ至20皿、六邊形微結(jié)構(gòu)體間距為20皿至40皿。
[0011] 其中，所述六邊形微結(jié)構(gòu)體的尺寸為內(nèi)接圓直徑為20皿、深度為10皿、六邊形微結(jié) 構(gòu)體間距為為20]im。
[001。其中，所述密封微孔膜的微孔密度化04-i0ii/cm2、孔徑尺寸為祉m至40皿。
[OOU]其中，所述密封微孔膜的微孔密度化.7x10日/細(xì)2、孔徑尺寸為祉m。
[0014] 其中，所述生物忍片的厚度為0.3至0.7mm、寬度為1至5mm、長(zhǎng)度為3至5mm。
[0015] 其中，所述生物忍片的厚度為0.5mm、寬度為1mm、長(zhǎng)度為3mm。
[0016] 本發(fā)明設(shè)及的生物忍片能夠用于體外高效地細(xì)胞培養(yǎng)，W及用于W生物忍片的形 式進(jìn)行細(xì)胞移植。
[0017]有益效果
[0018] 本發(fā)明的生物忍片具有細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層，能夠?qū)崿F(xiàn)更加接近于細(xì)胞尤其是神經(jīng) 干細(xì)胞生長(zhǎng)小生境的體外微環(huán)境，在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)形成凹凸相間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可W實(shí)現(xiàn)細(xì)胞 尤其是神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)室內(nèi)高密度的生長(zhǎng)分化，從而解決了神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)要求苛 亥IJ，生長(zhǎng)分化密度低的問(wèn)題。
[0019] 由于本發(fā)明的生物忍片具有密封微孔膜，因此能夠保證移植入體內(nèi)生物忍片與體 內(nèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)基液正常進(jìn)行交換，保證細(xì)胞的存活率，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞的存活率。此外，還 能夠提供內(nèi)部神經(jīng)干細(xì)胞與體內(nèi)神經(jīng)組織進(jìn)行搭接的通道，為受損神經(jīng)修復(fù)及信息傳遞構(gòu) 建平臺(tái)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是本發(fā)明的生物忍片的立體圖。
[0021] 圖2是本發(fā)明的生物忍片的側(cè)視圖。
[0022] 圖3是本發(fā)明的生物忍片的俯視圖。
[0023] 圖4是概略性地示出本發(fā)明的生物忍片的細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層的示意圖，其中，下半 部分圖像為細(xì)胞培養(yǎng)室的六邊形微結(jié)構(gòu)體的放大圖。
[0024] 附圖標(biāo)記說(shuō)明：
[0025] 1:細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層2:密封微孔膜11:進(jìn)液口 12:進(jìn)液通道
[0026] 13:細(xì)胞培養(yǎng)室、14:出液通道、15:出液口
【具體實(shí)施方式】
[0027] W下，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] 如圖1至圖4所示，本發(fā)明設(shè)及的生物忍片包括細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層1和覆蓋在所述 細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層上的密封微孔膜2。
[0029] 其中，細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層包括進(jìn)液口 11、出液口 15、進(jìn)液通道12、出液通道14和由 多個(gè)微結(jié)構(gòu)體排列形成的細(xì)胞培養(yǎng)室13。其中，進(jìn)液口 11和出液口 15分別隔著規(guī)定距離位 于細(xì)胞培養(yǎng)室13的兩側(cè)，所述進(jìn)液口 11與細(xì)胞培養(yǎng)室13之間設(shè)有進(jìn)液通道12，所述出液口 11與細(xì)胞培養(yǎng)室13之間設(shè)有出液通道12，運(yùn)樣，使得進(jìn)液口 11、細(xì)胞培養(yǎng)室13和出液口 15連 通起來(lái)。
[0030] 作為細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層，可W使用例如娃、玻璃、石英、聚甲基丙締酸醋、聚二甲基 硅氧烷等材料，其中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)透光率高、透氣性好、化學(xué)穩(wěn)定度高、生物相容 性高，可作為植入材料，因此優(yōu)選聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0031] 為保證培養(yǎng)液在通道內(nèi)部流動(dòng)順楊及更換培養(yǎng)液操作便捷，細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層的 進(jìn)液口、出液口、進(jìn)液通道、出液通道W及細(xì)胞培養(yǎng)室的深度優(yōu)選相同，例如深度可W為80μ m至150皿，優(yōu)選均為100皿。
[0032] 進(jìn)液口、出液口形狀可W相同，優(yōu)選均為圓形。二者的直徑可W相同，例如為0.45 至0.7mm，優(yōu)選均為0.45mm。在滿足已有的細(xì)胞進(jìn)液管的尺寸基礎(chǔ)上，進(jìn)液及出液口的直徑 越小越好，W使制得的生物忍片尺寸滿足植入要求。
[0033] 進(jìn)液通道、出液通道形狀可W相同，優(yōu)選均為長(zhǎng)方形，在運(yùn)種情況下，長(zhǎng)度可W為 250至400μπι，寬度可W為200至300μπι。其中，優(yōu)選長(zhǎng)度均為335μπι，寬度均為240皿。
[0034] 細(xì)胞培養(yǎng)室可W設(shè)計(jì)成各種形狀，例如可W為圓形、多邊形、楠圓形等。本發(fā)明優(yōu) 選具有六邊形結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)室。
[0035] 細(xì)胞培養(yǎng)室還可W設(shè)有多個(gè)微結(jié)構(gòu)體，本發(fā)明優(yōu)選六邊形微結(jié)構(gòu)體。六邊形微結(jié) 構(gòu)體的尺寸為內(nèi)接圓直徑為10皿至40μηι，優(yōu)選為20μηι;深度為1 Ομ至20μηι，優(yōu)選為1 Ομηι;六邊 形微結(jié)構(gòu)體間距為20皿至40μπι，優(yōu)選為20皿。依據(jù)細(xì)胞的大小，在培養(yǎng)室內(nèi)形成凹凸相間網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)，W模擬細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，從而能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞在培養(yǎng)室內(nèi)高密度的生長(zhǎng)分化。
[0036] 根據(jù)需要可W設(shè)置4125至8625個(gè)微結(jié)構(gòu)體，優(yōu)選6895個(gè)六邊形微結(jié)構(gòu)體。運(yùn)樣，能 夠更好地模擬細(xì)胞尤其是神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的復(fù)雜的小生境，為細(xì)胞生長(zhǎng)分化提供更加適宜 的結(jié)構(gòu)。
[0037] 由上述可知，所述微結(jié)構(gòu)體為Ξ維微孔結(jié)構(gòu)。運(yùn)種Ξ維微孔結(jié)構(gòu)物理因素對(duì)細(xì)胞 生長(zhǎng)、發(fā)育存在影響，提供了與常規(guī)培養(yǎng)不同的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，微孔的兩面結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提 供了很好的空間依附。在運(yùn)樣的空間結(jié)構(gòu)幫助下，細(xì)胞有兩個(gè)面與材料表面接觸并能夠更 穩(wěn)定地在材料表面生長(zhǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞尤其是神經(jīng)干細(xì)胞的體外可控的、高通量的培養(yǎng)。
[0038] 作為密封微孔膜，優(yōu)選使用親水性好、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物相容性好的可植入的材 料，例如聚酸諷膜(PES)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇醋膜(PET)、有機(jī)系尼龍膜、親水性聚偏氣乙 締膜(PVDF)等材料，其中更加優(yōu)選親水且穩(wěn)定性高、生物相容性好的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇 醋膜(PET)。并且，由于PET膜中通道呈圓柱狀的直形通孔，幾何形狀規(guī)則并且孔徑大小均 勻，因此能夠?qū)崿F(xiàn)培養(yǎng)液的交換，同時(shí)還提供生物忍片內(nèi)部的細(xì)胞突觸與體內(nèi)組織搭接的 通道。
[0039] 密封微孔膜的微孔密度可W為104-l〇ii/cmM尤選1.7xl05/cm2?？讖匠叽缒軌蚋鶕?jù) 細(xì)胞大小進(jìn)行選擇，只要能夠保證細(xì)胞不會(huì)漏出即可。例如可W為祉m至40μπι，優(yōu)選為祉m。
[0040] 運(yùn)樣，當(dāng)忍片植入體內(nèi)后，本發(fā)明的密封微孔膜能夠與體內(nèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)基液進(jìn)行正 常交換，確保體外植入的細(xì)胞例如神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)可正常生長(zhǎng)分化。進(jìn)而，密封微孔膜在 保證忍片內(nèi)部神經(jīng)干細(xì)胞不會(huì)漏出的情況下，可實(shí)現(xiàn)植入神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)樹突與體內(nèi)神 經(jīng)干細(xì)胞組織進(jìn)行搭接。
[0041] 本發(fā)明的包含細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層和密封微孔膜的生物忍片的厚度可W為0.3至 0.7mm，優(yōu)選為0.5mm，寬度可W為1至5mm，優(yōu)選為1mm，長(zhǎng)度可W為3至5mm，優(yōu)選為3mm。因此， 本發(fā)明的生物忍片的尺寸小于傳統(tǒng)尺寸，可W使體外實(shí)驗(yàn)操作便捷且植入效果好。
[0042] 接下來(lái)，對(duì)本發(fā)明的生物忍片的制造方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。具體地，包括下述步驟。
[0043] <細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層的制造步驟〉
[0044] W采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料為例，如下所示，具體說(shuō)明細(xì)胞培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)層 的制造步驟。
[0045] 1)模具制作。
[0046] 超純水清洗娃片，待未完全干燥時(shí)，采用丙酬超聲清洗1分鐘，再用超純水將娃片 上殘余液體洗凈，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br>[0047] 將忍片置于揮發(fā)干缸中，滴入1至2滴HDMS試劑，修飾3分鐘。
[004引將娃片放置于勻膠機(jī)正中，平