馬齒莧中甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物及其提取分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其涉及從馬齒莧中提取、分離和鑒別出的一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物及其提取分離方法。一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，分子式為C13H18O2，命名為Oleracone B。還提供上述新化合物的提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、ODS中壓柱、及SephadexLH?20，成功的提取分離出甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，該新化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤作用，本發(fā)明所述新化合物及其鹽或衍生物可以作為其他化合物合成先導(dǎo)物，以及新藥開(kāi)發(fā)和藥理活性研究的原料，用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【專利說(shuō)明】
馬齒寬中甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物及其提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其設(shè)及從馬齒寬藥材中提取、分離和鑒別出的 一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物及其提取分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬齒寬(Portulaca oleracea L.)，又名長(zhǎng)命菜、馬寬菜，為馬齒寬科植物。馬齒寬 耐旱耐潰，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關(guān)注，2015版 《中華人民共和國(guó)藥典》中收載馬齒寬的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止頻 等功效，用于熱毒血頻、癡腫療瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲(chóng)咬傷、便血、持血、崩漏下血等。
[0003] 馬齒寬現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧 化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。研究表明馬齒寬中眾多化學(xué)成分，為 其多樣的藥理作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，馬齒寬主要化學(xué)成分包括黃酬類(lèi)、香豆素、祗類(lèi)、醬類(lèi)、 生物堿、氨基酸、各種色素類(lèi)和礦物質(zhì)類(lèi)等。其中生物堿是馬齒寬中一類(lèi)主要的化學(xué)成分， 目前已報(bào)道的生物堿類(lèi)成分有去甲腎上腺素、多己胺、少量多己、腺巧、尿喀晚、腺嚷嶺、N， N-二環(huán)己基脈、尿囊素、N-反式-阿魏酷基酪胺;還有環(huán)二膚生物堿和酷胺類(lèi)生物堿:馬齒寬 酷胺 A-I、K、L、N-S。
[0004] 目前從馬齒寬中分離出的化學(xué)成分大多數(shù)是已知的，且結(jié)構(gòu)新穎性較低，因此，對(duì) 馬齒寬中新化合物的開(kāi)發(fā)和分離是亟待需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供從馬齒寬中提取的一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，經(jīng)研究 發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的作用；同時(shí)提供一種針對(duì)本發(fā)明新化合物的簡(jiǎn)便、快速、環(huán) 保、純度高的提取分離方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，分子式為 Cl出18〇2，命名為Oleracone B，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0007]
0- )
[000引為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明還提供一種馬齒寬中甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的提 取分離方法，具體步驟為。
[0009] 步驟1、取馬齒寬干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液濾過(guò)，合并濾液直接加熱濃 縮，放涼至室溫，得藥液備用。
[0010] 步驟2、將步驟1中藥液用乙酸乙醋反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙醋至浸膏，得到乙酸 乙醋萃取物。
[0011] 步驟3、將步驟2中乙酸乙醋萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離，依次用石油酸-丙酬梯度洗 脫得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫 部位經(jīng)減壓濃縮至干，得到濃縮物備用。
[0012] 步驟4、將步驟3中所得濃縮物再經(jīng)預(yù)處理的0DS柱(Octadecylsilyl，十八烷基娃 燒鍵合硅膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢 巧。，顯色，將各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得到濃縮物備用。
[0013] 步驟5、將步驟4中所得各濃縮物經(jīng)預(yù)處理的S邱hadex LH-20(^丙基葡聚糖凝膠） 層析分離，分別W甲醇-水梯度洗脫，得到一種來(lái)源于馬齒寬的甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物。
[0014] 所述0DS和S邱hadex LH-20凝膠的預(yù)處理過(guò)程為甲醇浸泡過(guò)24小時(shí)，上柱，用甲醇 洗至滴入水中無(wú)混濁，再W初始流動(dòng)相平衡。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0016] 本發(fā)明中所述馬齒寬甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的分離和藥理活性研究未被現(xiàn)有的論 文期刊所報(bào)道;本發(fā)明提供一種來(lái)源于馬齒寬的甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物W及一種針對(duì)本發(fā)明 新化合物的提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙醋萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱、 及S邱hadex LH-20，成功提取分離出甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，該方法操作步驟僅為五步，操作 方法簡(jiǎn)便及快速;提取分離過(guò)程主要采用水提取及乙酸乙醋萃取，工藝方法環(huán)保;且經(jīng)該方 法分離得到的化合物純度較高，均大于90%;此外經(jīng)研究表明W上所述化合物具有抗炎、鎮(zhèn) 痛和抗腫瘤作用，因此本發(fā)明新化合物及其鹽和衍生物可W作為其他化合物合成先導(dǎo)物， W及新藥開(kāi)發(fā)和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的紫外光譜圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的紅外光譜圖。
[0019] 圖3為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的高分辨質(zhì)譜圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B iH-NMR光譜圖。
[0021] 圖5為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B Uc-NMR光譜圖。
[0022] 圖6為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。
[0023] 圖7為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的核磁共振iH-i肥0SY光譜圖。
[0024] 圖8為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的核磁共振HMBC光譜圖。
[0025] 圖9為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的核磁共振服QC光譜圖。
[00%]圖10為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物Oleracone B的核磁共振N0ESY光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1。
[0028] 本發(fā)明提供一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，分子式為打抽18〇2，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為。
[0029]
[0030] 所述甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為Oleracone B，表1為該甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化 合物的核磁數(shù)據(jù):iH-NMR與Uc-NMR在CDC13中。
[0031 ]表1:本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物化合物Oleracone B的核磁數(shù)據(jù)。
[0032]
[0033]
[0034] 請(qǐng)參閱圖1-10,本發(fā)明所述的甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。
[00；3日]Oleracone B:無(wú)色油狀物，[α]% 〇(c 0.1 ,MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微 溶于水。UV(MeOH)Amax:295nm，IRv〇-H 3420,化=0 1760,化=c1659，1625，v〇-h 1310,化=0 1203， 丫=cH 893cm-l，HRESI( + )T0FMS給出m/z:207.1389[M+HΓ的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為 206.1310。結(jié)合iH-NMR，"C-NMR W及DEPT數(shù)據(jù)，推測(cè)該化合物可能的分子式為Ci3出802，不飽 和度為5。"C-NIR譜和DEPT譜顯示13個(gè)碳信號(hào)，分別3個(gè)C也(δ: 23.0，24.3，24.4)、3個(gè)C也(δ; 27.5,27.6,49.1)、2個(gè)CH(S :122.1,123.5)、5 個(gè)季碳(一個(gè)幾基碳，199.7;兩個(gè)雙鍵碳，δ; 149.9,154.1;兩個(gè)脂肪碳，δ :39.8,71.3)。
[0036] iH-NMR 譜顯示3 個(gè)甲基信號(hào)，分別為 δl.00(3H，s)，δl.l3(3H，s)，δl.93(3H，s)。3個(gè) 亞甲基信號(hào)為δ1.75(lH，dd，J = 5.0,1.7)，δ1.97(lH，dd，J = 5.0,1.7) ;S2.17(lH，d，J = 5)， 62.47(^，(1^ = 5)和62.07(^，(1^=15.0)，62.88(^，(1^=15.0)，2個(gè)次甲基信號(hào)為5 5.67(lH，s)，δ6.00αH，s)。由H-HC0SY譜可知，有相互禪合關(guān)系的H為δl.00與δl.l3，δl.93 與δ6.00，δ1.97與δ5.67。其中δ1.93化學(xué)位移較大，說(shuō)明該甲基可能與雙鍵相連。
[0037] 根據(jù)HMBC相關(guān)譜所列如下信息，出-1/與C-3a和C-8;也-2與C-1，C-3a，C-8和C-8a; Hb-2 與 C-6;出-9 與 C-2，C-3，C-3a 和 C-10;出-10 與 C-3，C-3a和C-9;此-4 與 C-3，C-3a和C-5; Hb- 6 與 C-4，C-7，C-8和 C-11; Hi-8 與 C-1，C-3a，C-6，C-fe和C-11;出-11 與 C-6，C-7 和C-8之間的相 互禪合，可W推斷出該化合物基本骨架為多取代的甘菊藍(lán)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合H-H COSY譜所示 信息可知甲基C-11與C-7相連，甲基C-9和C-10均連接在C-3上.由于C-6化學(xué)位移偏高，推斷 其與C-5所在幾基相連接。除上述各基團(tuán)外，由紅外光譜所示V0-H 3420信號(hào)，可知該化合物 有一個(gè)徑基，同時(shí)，C-：3a出現(xiàn)在碳譜高場(chǎng)區(qū)，故推斷該徑基與C-3a相連，綜上所述，可確定該 新化合物為上述結(jié)構(gòu)。
[0038] 本發(fā)明還提供上述甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的提取分離方法，具體步驟為：
[0039] 步驟1:稱取馬齒寬干燥藥材150kg，采用水煎煮提取，水用量為藥材的8~16倍，煎 煮提取兩次，每次煎煮2小時(shí)，水提液濾過(guò)，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備 用。
[0040] 步驟2:將步驟1中所得藥液，用乙酸乙醋反復(fù)萃取3次，乙酸乙醋與濃縮液的體積 比例為l:l(v:v)，4(rcw下減壓回收乙酸乙醋至浸膏，得到乙酸乙醋萃取物。
[0041] 步驟3:將步驟2中所得乙酸乙醋萃取物干法上樣，經(jīng)硅膠柱層析分離，其中硅膠為 200~300目，依次用石油酸-丙酬（l:l、l:2、l:3、l:5，v:v)梯度洗脫，共得到150個(gè)部位（即 共得到150個(gè)瓶，每瓶400mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的90~130洗脫部位（即 合并顯色的90~130瓶，棄去1~89瓶與131~150瓶），將合并后的90~130部位經(jīng)40°CW下 減壓濃縮至干，備用。
[0042] 步驟4:將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的0DS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20~ 40μπι;用甲醇-水（10/90，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脫（加壓，使流速為 1ml/ min,溫度為室溫），得到10個(gè)部位（即梯度洗脫得10個(gè)瓶，每瓶200mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢 巧。，顯色，將顯色的部位分別合并，50°C W下減壓濃縮至干，備用。所述0DS的預(yù)處理過(guò)程為 甲醇浸泡過(guò)24小時(shí)，上柱，用甲醇洗至滴入水中無(wú)混濁，再W初始流動(dòng)相平衡。
[0043] 步驟5:將步驟4中所得各顯色部位經(jīng)預(yù)處理的Se地adex LH-20柱層析，分別W甲 醇-水(70/30，v/v)等度洗脫，得到甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物。經(jīng)超高效液相色譜，歸一法測(cè)定純 度為90~99 %。所述Se地adex LH-20凝膠的預(yù)處理過(guò)程為甲醇浸泡過(guò)24小時(shí)，上柱，用甲醇 洗至滴入水中無(wú)混濁，再W初始流動(dòng)相平衡。
[0044] 本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的抗炎作用。
[0045] 1主要材料。
[0046] 1.1藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó) Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）；LPS(美國(guó)Sigma公司）；IL-6、TNF-a、PGE2 的化ISA試劑盒(美國(guó)化yman公司）；細(xì)胞裂解液、Griess試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司）。
[0047] 1.2細(xì)胞株:RAW264.7巨隧細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）。
[004引 1.3分組:分為對(duì)照組、LPS組和實(shí)驗(yàn)組，各一組。
[0049] 2實(shí)驗(yàn)方法。
[0050] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（lOOU/mL青霉素 和1 OOyg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0化1 ] 2.2MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，上述Ξ組分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨隧細(xì)胞接種 于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1 X ΙΟ4個(gè)/mL，每孔10化L，溫度37°C，5 %C〇2條件下培養(yǎng)過(guò)夜 后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明新化合物oleracone Β(Ι-100μΜ)，解育化后向LPS組和實(shí) 驗(yàn)組分別加入終濃度為化g/mL的LPS，另設(shè)一個(gè)調(diào)零組(含DMS0溶媒的培養(yǎng)液），每組設(shè)3個(gè) 復(fù)孔，考察加入藥物后對(duì)細(xì)胞的影響。上述各組細(xì)胞培養(yǎng)2地后，在各孔細(xì)胞中加入5mg/mL MTT 2化L，溫度37 °C，5 %C〇2條件下繼續(xù)解育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入10化 L二甲基亞諷(DMS0)，振蕩lOmin，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸 光值。
[0052] 2.3格里斯(Griess)法測(cè)定NO的含量:考察本發(fā)明新化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨隧 細(xì)胞RAW264.7的NO產(chǎn)生量的抑制作用。小鼠巨隧細(xì)胞RAW264.7傳代后在含10 %胎牛血清的 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明新化合物oleracone Β(1-50μ Μ)，在37°C，5%C02條件下解育化后用LPS(終濃度為化g/mL)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，24h后收集上清 液，每組處理重復(fù)3孔。Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO的含量，根據(jù)不同濃度本發(fā)明新化合 物對(duì)LI^誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響，用W反映 NO水平。
[0053] 2.4ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-6、TNF-a和炎癥介質(zhì)PGE2:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨 隧細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1 X 105個(gè)/mL，每孔ImL，溫度37°C，5%C02條件下培 養(yǎng)過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)組加入本發(fā)明新化合物oleracone B( 1-50μΜ)，培育化后，在每孔加入LPS(終 濃度為lyg/mL)，共解育24h，每組處理重復(fù)3孔。ELISA法測(cè)定本發(fā)明新化合物處理后的 RAW264.7巨隧細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-a和PGE2的含量。
[0化4] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0055] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明新化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨隧細(xì)胞RAW264.7的增殖無(wú)影響，安 全無(wú)毒;并可有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨隧細(xì)胞RAW264.7所產(chǎn)生過(guò)量炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-a 和炎癥介質(zhì)NO、PGE2,且呈濃度依賴。
[0056] 細(xì)胞相對(duì)存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
[0化7] 表2:本發(fā)明對(duì)RAW264.7巨隧細(xì)胞相對(duì)存活率的影響。
[0化引 [0化9]
[0060] 注:吁<0.05與對(duì)照組比較，高濃度組有顯著性差異。
[0061] 利用格里斯(Griess)法測(cè)定NO的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0062] 表3:本發(fā)明對(duì)LI^誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，η = 3)。
[0063]
[0064] 注:吁<0.05與對(duì)照組比較，咕<0.05與LI^組比較。
[00化]ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-6、TNF-a和炎癥介質(zhì)PGE2結(jié)果如表4所示。
[0066] 表4:本發(fā)明對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-a和PGE2含量的影響（均 數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3)。
[0067]
[006引注:吁<0.05與對(duì)照組比較，咕<0.05與LI^組比較。
[0069] 本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的鎮(zhèn)痛作用。
[0070] 1主要藥品和試劑。
[0071] 實(shí)驗(yàn)所用甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物由上述方法制備，純度為99%，精密稱取，用生理鹽 水稀釋至下述各劑量組所需溶液。致痛劑為0.6 %乙酸，用生理鹽水配制。鹽酸嗎啡注射液 (沈陽(yáng)第一制藥廠），用生理鹽水稀釋至下述劑量溶液。
[0072] 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0073] 昆明種雄性小鼠，體重為20±2g，清潔級(jí)，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、提供。室 溫20~25°C，自由飲食，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。
[0074] 3實(shí)驗(yàn)方法。
[0075] 取健康小鼠，雌雄各半，共50只小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組 (分別為本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物高劑量組(4mg/kg)、本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物中劑 量組(2mg/kg)、本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物低劑量組（Img/kg))、陽(yáng)性藥組(5mg/kg)共計(jì)五 組，每組10只。
[0076] 各組小鼠灌胃給予受試藥物，每日兩次，連續(xù)給藥3天?？瞻讓?duì)照組給予等體積的 生理鹽水，陽(yáng)性藥組給予鹽酸嗎啡注射液。末次給藥1小時(shí)后，各組小鼠腹腔注射0.6%乙酸 (0.1 mL/lOg體重），觀察30分鐘內(nèi)各組小鼠扭體出現(xiàn)時(shí)間、扭體次數(shù)、扭體結(jié)束時(shí)間，與空白 對(duì)照組比較計(jì)算各組鎮(zhèn)痛抑制率。按下式計(jì)算鎮(zhèn)痛抑制率，對(duì)各組小鼠扭體次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，P<〇. 05為有顯著差異。
[0077] 抑制率％ =(空白對(duì)照組平均扭體數(shù)一給藥組平均扭體數(shù))/空白對(duì)照組平均扭體 數(shù) X100%。
[007引 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0079] 空白對(duì)照組小鼠腹腔注射乙酸后表現(xiàn)為顯著的扭體次數(shù)多，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疼痛反 應(yīng);與空白對(duì)照組比較，中、高劑量組及陽(yáng)性藥組扭體次數(shù)及扭體結(jié)束時(shí)間均有減少趨勢(shì)， 本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽(yáng)性藥組潛伏期均有不同程 度延長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果表明本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物對(duì)乙酸致小鼠扭體反應(yīng)有一定的鎮(zhèn)痛作 用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
[0080] 表5:本發(fā)明對(duì)乙酸致扭體反應(yīng)小鼠的鎮(zhèn)痛作用影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 10)。
[0081]
[008^ 注:中<0.05，*午<0.01，**午<0.001與空白對(duì)照組比較。
[0083] 本發(fā)明甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物的抗腫瘤作用。
[0084] 1主要材料。
[0085] 1.1藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó) Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）。
[00化]1.2細(xì)胞株:人結(jié)腸癌細(xì)胞化CO-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺 腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞肥k7402、人宮頸癌細(xì)胞化la-229、卵巢癌細(xì)胞化-8910、人類(lèi) 口腔表皮樣癌細(xì)胞KB (中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。
[0087] 1.3分組:分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和調(diào)零組(含DMS0溶媒的培養(yǎng)液）。
[008引2實(shí)驗(yàn)方法。
[00例 2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（lOOU/mL青霉素 和1 OOyg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0090] 2.2Μ??法檢測(cè)細(xì)胞增殖，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為IX 104個(gè)/mL，每孔l(K)yL，溫度37°C，5%C02條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明 新化合物，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥后置于37 °C，5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她。將含藥培養(yǎng)液吸去， 加入體積比為4:1的無(wú)血清培養(yǎng)液和MTT(終質(zhì)量濃度為5mg/mL)共lOOmL，繼續(xù)解育4h，小屯、 吸去上清液后，每孔加入DMS015化L，放于震蕩器上震蕩W使結(jié)晶完全溶解(5min)，酶標(biāo)儀 在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。然后，計(jì)算各濃度化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，抑 制率公式:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=X 100%，再應(yīng)用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，將抑制率 對(duì)藥物濃度作曲線，計(jì)算IC50值。
[0091] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0092] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明新化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞化CO-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃 癌細(xì)胞BGC-823、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞肥心7402、人宮頸癌細(xì)胞化la-229、卵巢 癌細(xì)胞化-8910、人類(lèi)口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大，抑制 率也明顯升高，即呈濃度依賴。本發(fā)明新化合物對(duì)上述八種腫瘤細(xì)胞IC50值見(jiàn)表6。
[0093] 表6本發(fā)明新化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。 Γ00941
[0095]綜上所述，本發(fā)明提供一種甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物及其提取分離方法，依次采用水 煎煮提取、乙酸乙醋萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱層析、及S邱hadex LH-20柱層析，成功的 提取分離出甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，該方法簡(jiǎn)便，快速，環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物 純度較高，由于所得該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，從常用中藥馬齒寬中提取出來(lái)，其具有抗炎、 鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，因此本發(fā)明新化合物及其鹽和衍生物可W作為天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)中藥新藥， 具有廣闊的前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬齒寬中甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物，其特征在于，分子為Cl抽18〇2，命名為B，化學(xué)結(jié)構(gòu) 式如下。2. 如權(quán)利要求1所述的新化合物的提取分離方法，其特征在于，具體步驟為： 步驟1取馬齒干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液過(guò)濾，合并濾液直接加熱濃縮，放涼 至室溫，得藥液備用； 步驟2將步驟1中所得藥液用乙酸乙醋反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙醋至浸膏，得到乙酸 乙脂萃取物； 步驟3將步驟2中乙酸乙脂萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離，依次用石油酸-丙酬梯度洗脫得 到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位 經(jīng)減壓濃縮至干，備用； 步驟4將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合娃 膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，將 各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得濃縮物備用； 步驟5將步驟5中所得各濃縮物經(jīng)預(yù)處理的S邱hadex LH-20(^丙基葡聚糖凝膠)層析 分離，分別W甲醇-水梯度洗脫得到一種馬齒寬來(lái)源甘菊藍(lán)結(jié)構(gòu)新化合物。3. 如權(quán)利要求2所述提取分離方法，其特征在于，所述步驟1中水煎煮提取兩次，每次煎 煮2小時(shí)，水用量為藥材的8~16倍。4. 如權(quán)利要求2所述的提取分離方法，其特征在于，所述0DS和S邱hadex LH-20的預(yù)處 理過(guò)程為甲醇浸泡過(guò)24小時(shí)，上柱，用甲醇洗至滴入水中無(wú)混濁，再W初始流動(dòng)相平衡。5. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟2中濃縮液用乙酸乙醋萃 取3次，乙酸乙醋與濃縮液的體積比為1:10。6. 如權(quán)利要求1所述的化合物用于制備抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106083556SQ201610393807
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日 公開(kāi)號(hào)201610393807.5, CN 106083556 A, CN 106083556A, CN 201610393807, CN-A-106083556, CN106083556 A, CN106083556A, CN201610393807, CN201610393807.5
【發(fā)明人】英錫相, 英哲銘, 李翠玉, 張文潔
【申請(qǐng)人】遼寧中醫(yī)藥大學(xué)