一個(gè)調(diào)控柑橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)因子的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一個(gè)調(diào)控柑橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)因子CitERF6(SEQ：NO.1)，該基因含有一個(gè)保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域和Pat4(RKRK)核定位信號(hào)。在柑橘果實(shí)采后乙烯處理過(guò)程中，CitERF6的表達(dá)受外源乙烯誘導(dǎo)增強(qiáng)。CitERF6在柑橘果皮中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)葉綠素的降解，加快果皮脫綠。本發(fā)明利用PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、柑橘果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，克隆并鑒定出柑橘乙烯響應(yīng)因子CitERF6可參與調(diào)控葉綠素降解，可應(yīng)用到植物顏色修飾的基因工程育種中，尤其在調(diào)控柑橘果皮脫綠中的應(yīng)用。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和果皮著色技術(shù)提供理論依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-個(gè)調(diào)控巧橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙稀響應(yīng)因子
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，設(shè)及一個(gè)調(diào)控相橘果皮脫綠的關(guān) 鍵乙締響應(yīng)因子(CUERF6)，W及在植物色澤修飾的基因工程育種和在調(diào)控相橘果皮脫綠 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 相橘屬于蕓香科（Rutaceae)相橘亞科（Aurantioideae)，分為積屬（Poncirus Raf )、金相屬(Fortnoella Swing)和相枯屬(Citrus L.)，是世界第一大果樹(shù)品種，其種植 面積和產(chǎn)量均居首位，也是我國(guó)原產(chǎn)水果之一。相橘果肉風(fēng)味獨(dú)特且具有抗癌和抗腫瘤等 功能，而果皮富含芳香物質(zhì)和天然色素（葉綠素和類(lèi)胡蘿h素）。相橘果實(shí)常在綠熟期被采 收，為促使果實(shí)外觀著色均勻，提高果品商品性和價(jià)值，商業(yè)上常采用乙締煙熏法或乙締利 浸薩法加速果皮葉綠素降解。
[0003] 葉綠素是地球生物圈中最豐富的色素，它既參與光合作用，又為動(dòng)物和人類(lèi)提供 食物，還具有造血、治病和解毒等功能。盡管葉綠素如此重要，但是它的降解發(fā)生在植物衰 老和果實(shí)成熟整個(gè)過(guò)程中，并且還受環(huán)境刺激，如極端光照、低溫和乙締等。正因?yàn)槿绱耍~ 綠素的降解不僅造就了運(yùn)個(gè)窠紛多彩的世界，而且增加了大多數(shù)果實(shí)的商品性，如相橘、香 蕉、雜猴桃、番茄和梨等。
[0004] 乙締作為一種重要的植物激素，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，同時(shí)也是果實(shí)成 熟進(jìn)程中最重要的調(diào)控者之一。它能促進(jìn)果實(shí)軟化、糖分累積和酸的降解、芬芳物質(zhì)的散發(fā) 和果皮脫綠。乙締響應(yīng)因子化RF)位于乙締信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的末端，其序列中含有一個(gè)AP2/ ERF結(jié)構(gòu)域，可轉(zhuǎn)錄調(diào)控各種乙締響應(yīng)的目標(biāo)基因，進(jìn)而產(chǎn)生廣泛的乙締生物學(xué)效應(yīng)。但是 在相橘果皮脫綠過(guò)程中，ERFs家族成員調(diào)控葉綠素降解的生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一個(gè)調(diào)控相橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙締響應(yīng)因子(CUERF6)，其 核巧酸序列如SEQ:N0.1所示。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的乙締響應(yīng)因子(CUERF6)在植物色澤修飾的基 因工程育種中的應(yīng)用，尤其是在調(diào)控相橘果皮脫綠中的應(yīng)用。研究表明，本發(fā)明提供的相橘 乙締響應(yīng)因子CitERF6(SEQ:N0.1)可調(diào)控葉綠素降解，因此可應(yīng)用到植物色澤修飾的基因 工程育種和調(diào)控相橘果皮脫綠中。
[0007] 本發(fā)明提供的乙締響應(yīng)因子(CitERF6)的特征功能如下：
[000引 1.基因序列特征
[0009 ]從已報(bào)道的擬南芥A P 2 / E R F基因與相橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（h t t P : / / WWW. c i trusgenome化.org)進(jìn)行BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析獲得Ci 巧RF6 (沈Q: NO. 1)。利 用PCR技術(shù)，結(jié)合引物對(duì)SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4擴(kuò)增得到該基因，并采用測(cè)序手段進(jìn)一步驗(yàn) 證。序列分析結(jié)果顯示，該基因含有一個(gè)保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合功 能，屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，還含有一個(gè)化t4(服服)核定位信號(hào)，說(shuō)明其在細(xì)胞中定位細(xì)胞 核內(nèi)。
[0010]基因克隆中，將已報(bào)道的擬南芥AP2/ERF基因與相橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp:// WWW. C i trusgenome 化.org)進(jìn)行 BLAST (TBLASTN和 BLASTP)分析獲得 Ci 巧 RF6，Ci 巧RF6 含有 一個(gè)化t4(服服)核定位結(jié)構(gòu)域由60-70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合功能。 [00川 2.基因表達(dá)特征
[001^ 運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)技術(shù)，W相橘e-actin(SEQ:N0.7)作為內(nèi)參（QPCR引物對(duì) 為沈Q:NO. 8和沈Q: NO. 9)，利用引物對(duì)沈Q: NO. 10和沈Q: NO. 11分析不同相橘樣品中Ci巧RF6 表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在紐荷爾廝澄果實(shí)采后乙締處理材料中，與空氣處理相比，經(jīng)乙 締處理的采后椎相果實(shí)，4化后相橘色澤指數(shù)(CCI)明顯上升，而葉綠素含量則顯著降低。與 之一致的是，CUERF6的表達(dá)受到外源乙締的顯著增強(qiáng)，且在處理4h時(shí)即出現(xiàn)表達(dá)高峰，先 于果皮葉綠素的降解。
[0013] 基因表達(dá)分析中，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量AACt的方法，將紐荷爾廝 澄乙締處理初始點(diǎn)(Oh)的表達(dá)量設(shè)為1，結(jié)果顯示與空氣處理相比，經(jīng)乙締處理的采后椎相 果實(shí)4她后相橘色澤指數(shù)(CCI)明顯上升，葉綠素含量則顯著降低，CUERF6的表達(dá)受到乙締 誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)，且在處理地時(shí)即出現(xiàn)表達(dá)高峰，先于果皮葉綠素的降解。
[0014] 上述基因表達(dá)結(jié)果說(shuō)明CitERF6參與了相橘果皮葉綠素的降解過(guò)程，可調(diào)控相橘 果皮的脫綠。
[001引 3.基因功能特征
[0016] 利用引物對(duì)沈Q: NO. 3和沈Q: NO. 4，結(jié)合PCR技術(shù)克隆Ci巧RF6 (SEQ: NO. 1)的開(kāi)放性 閱讀框，搭載到pGreen II 0029 62-SK載體上，構(gòu)建成Ci巧RF6-SK重組表達(dá)載體，并通過(guò)電 擊法將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101: : pSoup中。W椎相為試材，將含有Ci巧RF6-SK和空表達(dá)載體 的農(nóng)桿菌菌株分別注射到相橘果皮中，培養(yǎng)5天后結(jié)果顯示Ci巧RF6在椎相果皮中瞬時(shí)過(guò)量 表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)其葉綠素的降解，加快果皮脫綠，表現(xiàn)在CCI值的上升和葉綠素含量的降低。 Ci巧W6的運(yùn)一功能可應(yīng)用于修飾植物色澤的基因工程育種和調(diào)控相橘果皮脫綠中。
[0017] 基因功能分析中，表達(dá)載體的構(gòu)建是將Ci巧W6的開(kāi)放閱讀框采用Roche公司高保 真酶擴(kuò)增搭載到pGreen II 0029 62-SK載體上，并通過(guò)電擊法將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101:: pSoup中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[001引基因功能分析中，應(yīng)用滲透液（lOmM MgCl2、10mM MES、150mM乙酷下香酬、pH為 5.6)將含有Ci巧RF6-SK或空表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株調(diào)整為00600 = 0.75，用帶針頭的注射器 分別注射到同一相橘果實(shí)果皮的赤道面對(duì)立部位，其結(jié)果顯示過(guò)量表達(dá)5天后，注射含有 Ci巧W6基因菌液后其果皮顏色CCI值更高，顏色更偏黃色，葉綠素含量更低。
[0019] 該基因在其他方面的應(yīng)用同樣屬于本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范疇。
[0020] 本發(fā)明利用相橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)化1：1口:/7懸￥.(3；[化113邑6]101116化.0'邑)信息，結(jié)合紐 荷爾廝澄采后乙締處理材料中ERF基因表達(dá)量的變化，W及在相橘果皮中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)的 表型，得出1個(gè)與相橘果皮脫綠相關(guān)的ERF基因 Ci巧RF6(SEQ:N0.1)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī) 制和果皮著色技術(shù)提供理論依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是紐荷爾廝澄采后乙締處理CCI和葉綠素含量變化w及Ci巧RF6和CitERFS在 其處理下的表達(dá)模式。紐荷爾廝澄采后乙締處理CCI(A)、葉綠素含量變化（B)、CitERF6 (SEQ:N0.1)在其處理下的表達(dá)模式(C)W及CitERF8(SEQ:N0.2)在其處理下表達(dá)模式(D)。 LSD代表最小顯著差異法。
[0022] 圖2是CitERF6在椎相果皮中過(guò)量表達(dá)及其CCI和葉綠素含量變化。CitERF6(SEQ: 肋.1)在椎相果皮中過(guò)量表達(dá)表型（4)、此1(8)^及葉綠素含量變化（〇。巧<0.05，**口< 0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，W不具有調(diào)控相橘果皮脫綠的Ci巧RF8(SEQ:N0.2)， W及Ci tERF6 (SEQ: NO. 1)為例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0024] 下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第=版）。
[00巧]實(shí)施例1:基因克隆
[0026] 基于相橘甜澄和克林曼下基因組數(shù)據(jù)庫(kù)化ttpV/Ww.citrusgenomedb.org)獲得 CUAP2/ERF基因家族成員。一方面直接根據(jù)注釋下載可能屬于AP2/ERF的基因，另一方面通 過(guò)已報(bào)道的擬南芥AP2/ERF基因進(jìn)行BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析，將運(yùn)兩種方式所獲得 的序列利用AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行一一篩選，再用CAP3序列裝配程序（http:// pbil.univ-lyonl.fr/cap3.地 P)去除重復(fù)序列，獲得 Ci 巧 RF6(沈 Q:N0.1)和Ci 巧 RF8(SEQ: NO.2)。
[0027] 結(jié)合引物對(duì)沈Q:N0.3和沈Q:N0.4,及SEQ:N0.5和SEQ:N0.6,利用PCR技術(shù)，分別擴(kuò) 增所得兩個(gè)基因，其中30山PCR體系為：10XBuffer化l，dNTP 2.化1，上/下游引物各0.化 1，酶 0.15iil，DEPC-此 0 21.化l，50mM MgS〇4 1.化l，cDNA 0.75iil;PCR 程序?yàn)椋?5°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 個(gè)熱循環(huán);72°C 延伸 10min，4°C 保 存。PCR產(chǎn)物采用測(cè)序手段（Invitrogen)進(jìn)一步驗(yàn)證。
[002引實(shí)施例2:基因表達(dá)分析 [0029](-)實(shí)驗(yàn)方法
[0030] 1.果實(shí)材料收集
[0031] 盛花期后150天的廝澄果實(shí)采后當(dāng)天抵運(yùn)實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻，成熟度相對(duì)一致 的果實(shí)開(kāi)展試驗(yàn)。將果實(shí)隨機(jī)分成兩組(每組100個(gè)），每組平均放置于3個(gè)密閉容器，一組通 4化L ? [1乙締氣體12h，而另一組通空氣12h，然后轉(zhuǎn)貨架放置于20°C環(huán)境。分別于0,4,8，12 和4她取樣。每次取9個(gè)果實(shí)，分為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
[0032] 2.相橘果皮色澤指數(shù)(CCI)的測(cè)定:采用色差計(jì)MiniScan XE Plus化unterLab，美 國(guó)）測(cè)定，計(jì)算公式為CCI = 1000 X a*/L* X b*。
[0033] 3.葉綠素含量測(cè)定：葉綠素提取采用80%丙酬分S次抽提，每次抽提后于4°C， 12000 X g離屯、5分鐘吸取上清液，最后定容至10ml體積，用分光光度計(jì)測(cè)定其663皿和645皿 吸光度值，計(jì)算公式為：畑1 a(mg/ml) = 9.78 X A663-0.99 X A64日；Chi b(mg/mL) = 21.4 X A645 - 4.65XA663 0
[0034] 4.RNA提取:相橘果皮切成下后迅速用液氮冷凍，保存于-80°C備用。提取RNA時(shí)，稱(chēng) 取Ig凍樣加液氮充分研磨后，加入到有4ml 65°C預(yù)熱的CTAB/e-琉基乙醇提取緩沖液的離 屯、管中，滿旋混合使細(xì)胞徹底破裂，65°C加熱3-5min;然后向離屯、管中加入4ml氯仿:異戊醇 (24:1)抽提液，充分滿旋混合；15 °C 1000化pm離屯、lOmin，吸取上清液到新的離屯、管，重新抽 提一次;得到的上清液小屯、吸取到新的離屯、管中，加入1/4體積的lOmol/1的LiCl，4°C放置 過(guò)夜；第二天，4°C100(K)rpm離屯、20min，倒掉上清液，將離屯、管倒置于紙巾上W去除多余的 溶液;加入40化1 65 °C SSTE，溶解沉淀;再加入40化1氯仿:異戊醇(24:1)抽提液，滿旋混合； 將液體徹底吸入1.5ml離屯、管中20°C 1000化pm離屯、lOmin，吸上清液到新的離屯、管中加入2 倍體積的-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，-80°C放置30min W上;4 °C 1000化pm離屯、 25min，倒掉上清液，短暫離屯、后吸出殘余液體，將沉淀在通風(fēng)楓驚干(約5-lOmin);每管加 入20iU DEPC水溶解沉淀，得到總RNA樣品；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得樣品完整性，結(jié) 果顯示樣品有兩條帶，亮度為上條:下條= 2:1，說(shuō)明RNA樣品完整無(wú)降解;用紫外分光光度 計(jì)檢測(cè)所得樣品純度，吸取化1 RNA樣品用49山DEPC水稀釋后，檢測(cè)OD26日和0〇28日，分析得到 0化6日/(脫8日=1.8-2.0，說(shuō)明RNA純度符合標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)公式OD260 X 40 (RNA濃度系數(shù)）X 50 (樣品 稀釋倍數(shù))即可計(jì)算出樣品RNA的濃度(ng/iil)，進(jìn)行下一步研究。
[0035] 5.CDNA 合成
[0036] 提取的總RNA采用TURBO面ase Kit(Ambion，美國(guó)）去除基因組DNA污染，取l.Oiig RNA按iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0037] 6.基因表達(dá)分析:使用Primers在線軟件化ttp: //打odo . wi .mit. edu/primerS/) 設(shè)計(jì)QPCR引物，W相橘e-actin(沈Q:N0.7)作為內(nèi)參，引物為沈Q:N0.8和沈Q:N0.9，Ci巧RF6 引物為SEQ: NO. 10和SEQ: NO. 11，Ci巧RF8引物為沈Q: NO. 12和沈Q: NO. 13。QPCR反應(yīng)體系為20 yl，含有 lOyl Ssofast EvaGreen S 叫 e;rmix(Bi〇-Rad，美國(guó)），上下游引物（lOuM， Invitrogen)各化 1，化 1 cDNA(23<Ct<24)，6iil DEPC-H2O,每次QPCR檢測(cè)都包括不含反應(yīng)模 板的陰性對(duì)照。QPCR反應(yīng)程序?yàn)?5 °C 3min; 95 °C 10s，60 °C 30s，45個(gè)循環(huán);95 °C 10s;從65 °C到 95°C，每上升0.5°C讀取一次巧光信號(hào)值。所用儀器為CFX96實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀(Bio-Rad， 美國(guó)）。QPCR檢測(cè)的數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量A Act的方法，將紐荷爾廝澄乙締處理初始點(diǎn)(Oh)的 表達(dá)量設(shè)為1。
[003引（二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 在紐荷爾廝澄采后乙締處理(4化L，l/i，12h，2(TC)材料中，乙締處理加速了果實(shí) 葉綠素降解，48h果實(shí)色澤指數(shù)CCI和葉綠素含量分別達(dá)到了-8.0和59.38g g-中W，而對(duì)照組 分別為-10.4和108.72g g-iFW(附圖1A，B) Xi巧RF8不受乙締誘導(dǎo)，在乙締處理后表達(dá)水平 仍與空氣處理保持相對(duì)一致，而Ci巧W6對(duì)乙締敏感，乙締處理4h后被誘導(dǎo)約6.80倍，（附圖 1C，D)，說(shuō)明其可能對(duì)相橘果皮脫綠有調(diào)控效應(yīng)。
[0040] 實(shí)施例3:基因功能驗(yàn)證
[OOW (-)實(shí)驗(yàn)方法
[0042] 1.重組載體構(gòu)建
[0043] 根據(jù)已驗(yàn)證的Ci巧RF6(SEQ:N0.1)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物(SEQ:N0.3和SEQ:N0.4)擴(kuò)增 其開(kāi)放性閱讀框。W相橘果皮cDNA為模板，參照Roche公司高保真酶體系稍加改動(dòng)，配制終 體積30山PCR體系：10XBuffer化l，dNTP 2.化1，上/下游引物0.化1，酶0.15山，DEPC-H20 21.化l，50mM MgS〇4 1.化l，cDNA 0.7化1。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min;95°C變性lOsec， 58°C退火5sec，72°C延伸2.5min，35個(gè)熱循環(huán);72°C延伸10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物回收后連 接于pGEM-T easy載體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆重 提質(zhì)粒采用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后重新連接到pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體上 克隆測(cè)序。將最終確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體通過(guò)電擊導(dǎo)入GV3101: :pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì) 胞中，菌液均勻涂布于含25μg/ml慶大霉素、5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素的LB固體培 養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。用20%甘油保存于-80°C備用。
[0044] 2.相橘瞬時(shí)表達(dá)
[0045] 將存放于-80°C的甘油菌接種活化后，刮取生長(zhǎng)良好的菌落，用lOmM MgCl2，lOmM MES(生物緩沖液），150mM乙酷下香酬，抑為5.6的滲透液懸浮，使其ODs日日為0.75。用帶針頭注 射器將滲透液注入相橘果皮，每次實(shí)驗(yàn)中，都要設(shè)計(jì)嚴(yán)格的陰性對(duì)照，即注入含pGreen II 0029 62-SK空載體的農(nóng)桿菌菌株滲透液。注射5天后測(cè)定果皮菌液滲透區(qū)域的CCI后取樣液 氮速凍，-80°C保存W備測(cè)定葉綠素含量所用。
[0046] (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0047] Ci巧RF6(SEQ:N0.1)在相橘果皮中過(guò)量表達(dá)5天后，同一個(gè)果實(shí)注射含有CitERF6 基因菌液后其果皮顏色相對(duì)于注射空載體更黃，葉綠素降解更迅速，經(jīng)測(cè)定其生理指標(biāo)CCI 和葉綠素含量（附圖2)，結(jié)果也證明過(guò)量表達(dá)Ci巧RF6后果皮葉綠素含量更低。綜合上述結(jié) 果，表明Ci巧W6具有調(diào)控相橘果皮脫綠的功能。
[0〇4引本發(fā)明利用PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、相橘果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，克隆并鑒定出相橘乙締響 應(yīng)因子CitERF6(SEQ:N0.1)可調(diào)控葉綠素降解，可應(yīng)用到植物顏色修飾的基因工程育種和 調(diào)控相橘果皮脫綠中。該基因在其他方面的應(yīng)用同樣屬于本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范疇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一個(gè)調(diào)控柑橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)因子，其特征在于，名稱(chēng)為CUERF6,其核苷 酸序列如SEQ:NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)調(diào)控柑橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)因子，其特征在于，獲 得CUERF6的特征步驟包括： (1) 基因克隆：將已報(bào)道的擬南芥AP2/ERF基因與柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www. citrusgenomedb. org)進(jìn)行 BLAST 分析獲得 CitERF6 和 Ci tERF8，核苷酸序列分別為 SEQ: NO. 1 和SEQ: NO. 2，結(jié)合引物對(duì)SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4，及SEQ: NO. 5和SEQ: NO. 6擴(kuò)增所得兩個(gè) 基因，并采用測(cè)序手段進(jìn)一步驗(yàn)證； (2) 基因表達(dá)分析:應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，以柑橘β-actin作為內(nèi)參，序列為SEQ:N0.7， QPCR引物對(duì)為SEQ:NO. 8和SEQ:NO. 9，利用引物對(duì)SEQ:NO. 10和SEQ:NO. 11，以及SEQ:NO. 12和 SEQ: NO. 13，分析不同柑橘樣品中Ci tERF6和Ci tERF8的表達(dá)模式，所有QPCR引物特異性經(jīng)熔 點(diǎn)曲線分析、凝膠電泳分析和QPCR產(chǎn)物再測(cè)序驗(yàn)證； (3) 基因功能驗(yàn)證:利用引物對(duì)SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4，結(jié)合PCR技術(shù)克隆Ci tERF6的開(kāi)放 性閱讀框，搭載到pGreen II 0029 62-SK載體上，構(gòu)建成CUERF6-SK重組表達(dá)載體，并通過(guò) 電擊法將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101: :pSoup中，以櫳柑為試材，將含有CUERF6-SK和空表達(dá)載 體的農(nóng)桿菌菌株分別注射到柑橘果皮中，培養(yǎng)5天后分別測(cè)定兩種果皮菌液滲透區(qū)域的柑 橘色澤指數(shù)和葉綠素含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)調(diào)控柑橘果皮脫綠的關(guān)鍵乙烯響應(yīng)因子在植物色澤修飾 的基因工程育種中的應(yīng)用，尤其是在調(diào)控柑橘果皮脫綠中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/08GK106047890SQ201610410029
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】陳昆松, 謝秀蘭, 劉曉芬, 殷學(xué)仁
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)