一類蔗糖酯型陽離子基因載體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一類蔗糖酯型陽離子類脂及其制備方法。利用該陽離子類脂制備的載體可用于核酸遞送。本發(fā)明運用化學合成的方法制備了蔗糖酯型陽離子類脂，合成方法簡單，產(chǎn)物收率較高。本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂化合物與類脂助劑混合，可制備包括懸浮液，乳濁液，微膠粒和脂質(zhì)體等組合物。利用上述組合物可與核酸制備蔗糖酯型陽離子類脂復合物，其具有制備簡單、低毒、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，是一種新型的高效基因載體。
【專利說明】
一類蔗糖酯型陽離子基因載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類蔗糖酯型陽離子類脂化合物及其制備方 法，該類化合物可制備蔗糖酯型陽離子類脂組合物和復合物并用于核酸遞送。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，人們發(fā)明了很多治療疾病的新方法，但是對于癌癥等疾病的治療還沒有 有效的治療方法。而基因治療作為一種全新的和革命性的治療手段，是治愈癌癥、心血管疾 病和先天性免疫缺陷等疑難疾病的潛在方法。然而，其核心技術(shù)一基因轉(zhuǎn)運的難題一直限 制著基因治療的發(fā)展和臨床試驗，其中，獲得高效、安全的基因轉(zhuǎn)運載體無疑成為基因治療 成功與否的關(guān)鍵。
[0003] 目前，全世界使用的基因轉(zhuǎn)運載體主要為兩大類：一類為病毒載體，另一類為非病 毒載體。病毒基因載體是利用病毒侵染細胞的能力，以病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的一種運載基因的 載體，與此相對應，不使用病毒進行基因轉(zhuǎn)運的載體統(tǒng)稱為非病毒基因載體。雖然病毒基因 載體用于基因的轉(zhuǎn)運具有效率高的優(yōu)點，但存在免疫原性高、容量小、變異性和致癌性等缺 點。而非病毒基因載體以其設計靈活、低毒性、低免疫原性、低致腫瘤性、易制備及可以實現(xiàn) 細胞特異性和長期基因表達的優(yōu)點，為基因治療開辟出一條新的道路。到目前為止，在2000 余例的基因治療臨床試驗中，有接近三分之一是通過非病毒基因載體來實施的。然而，非病 毒基因載體的轉(zhuǎn)染效率與病毒載體相比還有一定的差距，成為制約其臨床試驗的瓶頸。開 發(fā)高效、低毒的非病毒基因載體已成為基因治療的重要研究內(nèi)容之一。
[0004] 陽離子脂質(zhì)體作為非病毒基因載體中的一類因其制備簡便，無免疫原性、 可重復轉(zhuǎn)染和易于商品化等優(yōu)點，近年來得到了迅速的發(fā)展。1987年Feigner等人 (PNAS1987, 84:7413 - 7417)首次將陽離子類脂D0TMA制備成陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運DNA，開創(chuàng) 了陽離子脂質(zhì)體在基因治療領(lǐng)域的先河。由陽離子類脂所形成的脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與生物膜相 似，用它作為一種載體可包裹外源基因。陽離子脂質(zhì)體在生理pH值下帶有正電荷，能夠借 助靜電作用與核酸分子中的帶有負電性的磷酸基團自組裝形成脂質(zhì)體/基因復合物，再通 過靜電作用吸附于細胞表面，進而通過細胞內(nèi)吞作用或其他作用將外源基因?qū)爰毎?，?而發(fā)揮基因的治療作用。自1987年以來，人們已經(jīng)設計合成了許多陽離子類脂并用于核酸 遞送（Focus 1993,15:73 - 83)。但是現(xiàn)有陽離子類脂毒性較高，且轉(zhuǎn)染效率有待提高。
[0005] 眾所周知，糖類化合物在自然界中分布較為廣泛，安全性高。蔗糖為原料制備成 的蔗糖酯在水相中能形成囊泡狀或雙片層結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和降解性。但是由 于蔗糖中羥基基團很多，所以很難通過化學合成方法得到單一結(jié)構(gòu)的蔗糖酯化合物（J. Am. Oil Chem. Soc. 2014, 91:1891-1901.)，到目前為止尚未有蔗糖酯型基因載體應用于基因載 體的相關(guān)研究。因此，研究和開發(fā)生物相容性好、高效和低細胞毒性的蔗糖酯型基因載體， 對于開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因載體具有重要的科學意義和經(jīng)濟價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一類安全高效的蔗糖酯型陽離子基因載體及其制備方法， 其主要包括：一類蔗糖酯型陽離子類脂化合物及其制備方法、一類蔗糖酯型陽離子組合物 及其制備方法及一類蔗糖酯型陽離子類脂復合物及其制備方法。
[0007] 除了另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。
[0008] 本文中使用的術(shù)語"烴基"包括烷基、烯基和炔基。
[0009] 本文中使用的術(shù)語"烷基"包括直鏈烷基和支鏈烷基。例如4烷基"包括甲基、 乙基、正丙基、異丙基、正丁基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其他基團。
[0010] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"鹵素"包括氟、氯、溴和碘。
[0011] 一、本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂化合物，具有通式I的結(jié)構(gòu)：
[0012]
[0013] 其中：
[0014] R選自C1Q 2。經(jīng)基酯、膽汁酸基和膽固醇酯基；
[0015] 其中所述膽固醇酯基（B1)結(jié)構(gòu)如下：
[0016]
[0017] 在優(yōu)選的技術(shù)方案中，R優(yōu)選選自C12 18烷基酯、十八烯基酯（C17H34C00_)、膽汁酸基 和膽固醇酯基。更優(yōu)選R選自c 12烷基酯、C14烷基酯、十八烯基酯（C17H34C00_)和膽固醇酯 基。
[0018] Y選自-NRaRb和-N +RaRVx _，其中Ra、Rb和R。相同或不同，并且選自氫、C i 6烴 基、C16羥烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或葉酸酯基；X _選自F 'Cl'Br' Γ。在優(yōu)選的 技術(shù)方案中，Y優(yōu)選選自NRaRb，其中Ra和R b優(yōu)選選自C i 6烷基、C i 6羥烷基、C 6Hn06-(半乳 糖基）、C6H n06-(甘露糖基）和葉酸酯基（C1SH1SN70 4C00CH2CH2-);更優(yōu)選Ra和Rb選自甲基、 乙基、羥甲基、羥乙基、半乳糖基和葉酸酯基；其中所述半乳糖基（B2)、甘露糖基（B3)、葉酸 酯基（B4)的結(jié)構(gòu)如下：
[0019]
[0020] 二、上述一類蔗糖酯型陽離子類脂化合物的制備方法，包括如下步驟：
[0021] (1)三氯蔗糖和式i的化合物按照摩爾比1:1~50反應，制備化合物A :
[0022]
[0023] 反應溫度為10~100°C，反應時間為10~50h，反應溶劑為如N，N-二甲基甲酰胺、 吡啶、乙腈、哌啶、三乙胺等含氮溶劑，反應物與溶劑的質(zhì)量體積比為1:1~50 ;
[0024] 在一個優(yōu)選的實施方案中，反應溫度為10~70°C，反應時間為10~35h，反應溶 劑為N，N-二甲基甲酰胺和吡啶，三氯蔗糖和式i的化合物的摩爾比1:1~1:20 ;在一個更 優(yōu)選的實施方式中，反應溫度為30~60°C，反應時間為20~30h，反應溶劑為N，N-二甲 基甲酰胺和吡啶，三氯蔗糖和式i的化合物的摩爾比1:1~1:10。
[0025] (2)化合物A和式ii的化合物按照摩爾比1:1~8反應，制備化合物B :
[0026]
[0027] 具體操作如下：
[0028] a分別在容器中加入三氯蔗糖酯，再取一定量式ii化合物加入容器中，反應溫度為 10~120°C，反應時間為10~40h，反應壓力為1.0~5.0atm，溶劑為N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)、甲醇、乙醇、異丙醇或異丁醇，反應物與溶劑的質(zhì)量體積比為1:1~50 ;
[0029] b反應結(jié)束后，減壓蒸餾除去未反應的原料，所得即為反應粗產(chǎn)物。
[0030] c將粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離提純得到產(chǎn)物后以溶劑溶解結(jié)晶數(shù)次，得到淡黃色粉末 狀固體，即為化合物B。
[0031] 在一個優(yōu)選的實施方式中，反應溫度為50~110°C，反應時間為10~35h，反應壓 力為1. 0~3. Oatm，反應溶劑為DMF、乙醇或異丙醇，化合物A和式ii的化合物的摩爾比為 1:1~1:6 ;在一個更優(yōu)選的實施方式中，反應溫度為80~105°C，反應時間為15~25h， 反應壓力為1. 0~2. Oatm，反應溶劑為乙醇或異丙醇，化合物A和式ii的化合物的摩爾比為 1:1 ~1:3〇
[0032] 當所合成的產(chǎn)物為季銨鹽時，平衡陰離子F' Br' ?？梢酝ㄟ^離子交換柱替換 C1獲得。
[0033] 上述對本發(fā)明的一類蔗糖酯型陽離子類脂化合物的制備方法的描述中，各個取代 基的定義，均與上述對化合物的描述中的定義相同。
[0034] 三、本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂組合物，該組合物是由上述的蔗糖酯型陽離子 類脂化合物和類脂助劑組成，所述的蔗糖酯型陽離子類脂化合物與類脂助劑的質(zhì)量比為 10:1~1:10。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，蔗糖酯型陽離子類脂化合物與類脂助劑的質(zhì)量比為 5:1~1:5,更優(yōu)選的質(zhì)量比為3:1~1:3。
[0035] 所述類脂助劑選自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、糖脂、二油酰磷脂酰氯（D0PC)、棕櫚酰 油酰磷脂酰乙醇胺（POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、膽固醇（Choi)、殼聚糖、蔗糖酯 中的一種或兩種以上的混合物。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，類脂助劑選自卵磷脂、D0PC、DOPE、 Choi、殼聚糖、蔗糖酯，更優(yōu)選選自DOPE、Choi、殼聚糖、蔗糖酯。
[0036] 上述蔗糖酯型陽離子類脂組合物外觀為懸浮液、乳濁液、微膠?；蛑|(zhì)體。
[0037] 四、本發(fā)明的陽離子類脂復合物，其是由蔗糖酯型陽離子類脂組合物與所述核酸 形成的陽離子類脂復合物，兩者的質(zhì)量比20:1~1:20,在優(yōu)選的技術(shù)方案中，蔗糖酯型陽 離子類脂化合物與核酸的質(zhì)量比為5:1~1:15,更優(yōu)選的質(zhì)量比為1:1~1:10。
[0038] 上述復合物中所述核酸為pDNA、microRNA、siRNA中的一種或兩種以上的混合物。
[0039] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：
[0040] 1、本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂化合物在制備上利用三氯蔗糖代替蔗糖作為原 料，與蔗糖相比減少了三個羥基，只有一個伯羥基，可以與酸類化合物通過酯化反應，獲得 單一結(jié)構(gòu)的蔗糖酯型類脂化合物。該制備方法簡單、環(huán)保、安全，適于實驗室制備以及工業(yè) 化生產(chǎn)。
[0041] 2、本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂組合物（如脂質(zhì)體），具有良好的生物相容性和 降解性，細胞毒性低于目前常用的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和D0TAP。
[0042] 3、本發(fā)明的蔗糖酯型陽離子類脂組合物（如脂質(zhì)體），用于核算遞送，其轉(zhuǎn)染效率 優(yōu)于目前常用的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和D0TAP。
[0043] 綜合上述結(jié)果可知，本發(fā)明制備的蔗糖酯型陽離子載體，具有制備簡單、毒性低、 轉(zhuǎn)染效率高的特點，作為基因載體有著良好的應用前景。
【附圖說明】
[0044] 圖1是本發(fā)明的一類蔗糖酯型陽離子類脂化合物的結(jié)構(gòu)通式I。
[0045] 圖2是實施例1的核磁氫譜圖。
[0046] 圖3是實施例1的核磁碳譜圖。
[0047] 圖4是實施例5的陽離子脂質(zhì)體的粒徑圖。
[0048] 圖5是實施例5的陽離子脂質(zhì)體zeta電位圖。
[0049] 圖6是實施例7的陽離子脂質(zhì)體-DNA復合物的電泳圖譜。
[0050] 圖7是實施例8的陽離子脂質(zhì)體-DNA復合物對!fep-2細胞轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白 檢測結(jié)果圖。
[0051] 圖8是實施例8的陽離子脂質(zhì)體-DNA復合物對Η印-2細胞轉(zhuǎn)染后熒光素酶檢測 結(jié)果圖。
[0052] 圖9是實施例9用ΜΤΤ法測定的Η印-2細胞存活率圖。
【具體實施方式】
[0053] 本發(fā)明采用上述方法合成的蔗糖酯型陽離子類脂化合物，采用核磁共振譜Oh NMR和13C NMR)或質(zhì)譜來確認其結(jié)構(gòu)。
[0054] 實施例1三氯蔗糖月桂酸酯季銨鹽（TSI12)的制備
[0055] (1)三氯蔗糖月桂酸酯的合成
[0056] 在裝有溫度計和回流管的250mL容器中加入3. 9g的三氯蔗糖、3g無水碳酸鉀、5mL 吡啶和N，N-二甲基甲酰胺（DMF，10mL)，油浴恒溫75°C，磁力攪拌下充分溶解后滴加5mL 月桂酸，反應24h后得到淡黃色濾液，將其減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得到琥珀色粘稠油狀液體。 用柱層析純化后，即得白色無定形狀的酯化產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)表征如下NMR(400MHz，⑶Cl 3) δ : 5. 44 (t, J = 124. 9, 2H) , 6. 37 - 4. 56 (m, 6H) , 6. 37 - 4. 28 (m, 1 OH) , 6. 37 - 3. 89 (m, 20H), 6. 37 - 3. 59 (m, 26H), 6. 37 - 2. 37 (m, 28H), 2. 32 (t, J = 14. 7, 4H), 2. 0 7 (s, 2H), 1. 99 (s, 2H), 1. 77 (s, 2H), 1. 74 - 1. 58 (m, 6H), 1. 42 - 1. 15 (m, 33H), 1. 52 -0· 58 (m, 39H)，1. 43 - 0· 58 (m, 39H)，1. 11 - 0· 53 (m, 6H) · 13C NMR (400MHz, CDC13) δ : 174 .44(s), 107. 88(s), 94. 90(s), 82. 14(s), 80. 40 (s), 74. 63(s), 74. 02(s), 73. 37(s), 71 .64(s), 65. 88(s), 64. 52(s), 44. 29 (s), 42. 93 (s), 33. 92 (s), 31. 73 (s), 29. 07 (t, J = 7. 9), 25. 42(s), 23. 16 (s), 14. 00 (s). ESI-MS, m/z: Found [M+3H]3+, 581. 10, [M+2H-C1]+, 545 .1, C24H41Cl309calcd for[M] = 578. 1816, [M+3H] = 581. 1894, [M+2H-C1] = 545. 2127.
[0057] (2)三氯蔗糖月桂酸酯季銨鹽的合成
[0058] 在裝有具N2保護、溫度計、回流管和滴液漏斗的250mL容器中加入10g三氯蔗糖 酯和30mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，量取30mL的三甲胺溶液，水浴恒溫100 °C，壓力為 latm，反應24h后，減壓蒸餾除去溶劑。所得即為反應粗產(chǎn)物，將其經(jīng)柱色譜分離提純得到 產(chǎn)物后以溶劑溶解結(jié)晶數(shù)次，得到淡黃色粉末狀固體。紅外快速干燥箱中干燥2h，得三氯蔗 糖月桂酸酯季銨鹽，其結(jié)構(gòu)表征如下： 111匪1?(4001抱，〇)(：13)6:5.40 - 5.53((1，1!1)，4.54- 4. 56 (t, 1H), 4. 43 (d, 1H), [4. 35 (d, 1H), 4. 23 (d, 1H) ], 4. 28 - 4. 30 (d, 1H), 4. 30 - 4. 33 (d, 1H), 4. 10 (s, 1H), 4. 07 (s, 1H), 3. 95 - 3. 99 (m, 1H), [3. 84 (d, 1H), 3. 65 (d, 1H) ], 3. 61 -3. 78 (d, 2H)，3. 22 - 3. 30 (s, 9H), 2. 36 - 2. 41 (t, J = 7. 6Hz, 2H)，1. 60 ~1. 66 (dd, J = 14. 6, 8. 2Hz, 2H), 1. 28 - 1. 30 (m, J = 8. 9Hz, 16H), 0. 88 - 0. 89 (t, J = 6. 4Hz, 3H). 13C 匪R (400MHz, CDC13) δ : 172. 97 (s)，103. 57 (s)，92. 22 (s)，75. 12 (s)，74. 94 (s)，74. 44 (s ),71. 14 (s), 68. 03 (s), 67. 43 (s), 66. 91 (s), 63. 53 (s), 63. 06 (s), 52. 94 (s), 42. 93 (s) ,32. 95 (s), 31. 05 (s), 28. 19 - 28. 72 (m), 23. 99 (s), 21. 71 (s), 12. 43 (s). Q-T0F-MS, m/ z:Found[M-C1]+, 602. 2856, C27H50Cl3N09calcd for[M] = 637. 2551, [Μ-Cl] = 602. 2863.
[0059] 實施例2膽汁酸-蔗糖酯型陽離子類脂（TSB-2I)的制備
[0060] (1)三氯蔗糖膽汁酸酯的制備
[0061] 在裝有溫度計和回流管的250mL容器中加入3. 9g的三氯蔗糖、3g無水碳酸鉀、 5mL乙腈和20mL哌啶，油浴恒溫75°C，磁力攪拌下充分溶解后滴加 lOmmol膽汁酸，反應 24h后得到淡黃色濾液，將其減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得到琥珀色粘稠油狀液體。用柱層析純化 后，即得白色無定形狀單酯化產(chǎn)物。蟲匪1?(4001抱，〇)(：13)5 :4.86 - 4.29(111，4!1)，4.86-3. 92 (m, 8H), 3. 89 - 3. 68 (m, 3H), 3. 68 - 3. 41 (m, 2H), 3. 37 - 3. 18 (m, 2H), 2. 38 (t, J =16. 1, 2H), 2. 38 (t, J = 16. 1, 2H), 3. 08 - 1. 78 (m, 5H), 3. 08 - 0. 98 (m, 29H), 3. 08 - 0. 91(m，35H)，3.08 - 0.44(m，39H).13C NMR(400MHz，CDC13) δ :174.51(s), 107.88(s)，94.9 0 (s), 82. 14 (s), 80. 40 (s), 74. 63 (s), 74. 09 (d), 73. 56 (s), 73. 37 (s), 71. 64 (s), 70. 69 (s), 67. 02 (s), 65. 88 (s), 64. 52 (s), 50. 15 (s), 47. 48 (s), 45. 82 (s), 44. 29 (s), 42. 93 (s), 41. 84 (s), 40. 62 (s), 40. 36 (s), 38. 98 (s), 35. 64 (s), 34. 24 (s), 31. 84 (d, J = 16. 2), 30. 78 (s), 2 9. 76 (s)，29. 33 (s)，28. 14 (s)，24. 87 (s)，18. 78 (s)，17. 69 (s)，11. 94 (s) · Q-TOF-MS，m/z : Fo und[M+Na]+, 825. 2860, C36H57Cl3013calcd for[M] = 802. 2865, [M+Na] = 825. 2865.
[0062] (2)膽汁酸-蔗糖酯型陽離子類脂的合成
[0063] 在裝有N2保護、溫度計、回流管和滴液漏斗的250mL容器中加入5mmol的三氯 蔗糖膽汁酸酯的異丙醇（20mL)溶液、0.7g無水碳酸鉀。水浴恒溫60°C，磁力攪拌下滴加 lOmmol二乙醇胺的乙醇（10mL)溶液，滴加時間約lh，滴完后，水浴溫度升至100°C，反應 6h。過濾反應混合物，得到濾液，將其減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得到混合物，最后通過制備色譜純 化可獲得純度較高的膽汁酸-蔗糖酯型陽離子類脂。 1H NMR(400MHz，⑶Cl3) δ:5. 57(d，J =14. 8, 2H), 4. 77 (d, J = 14. 2, 2H), 4. 56 - 4. 35 (m, 7H), 4. 30 - 4. 05 (m, 6H), 3. 81 - 3. 60 (m, 4H), 3. 59 - 3. 37 (m, 10H), 3. 37 - 3. 18 (m, 4H), 2. 92 - 2. 40 (m, 12H), 2. 35 (t, J =15. 7, 4H) , 2. 15 - 1. 82 (m, 10H) , 1.82 - 1. 28 (m, 43H) , 1. 24 (s, 6H) , 1. 18- 1. 03 (m, 2H) , 0. 96 (s, 12H) , 0. 88 (d, J = 1 2. 8, 6H) , 0. 75 - 0. 44 (m, 2H) . 13C NMR (400MHz, CDC13) δ : 174. 51 (s), 107. 88 (s), 94. 90 (s), 80. 40 (s), 78. 39 (s), 78. 09 (s)，7 4. 09 (d), 73. 56 (s), 73. 37 (s), 71. 64 (s), 70. 69 (s), 67. 02 (s), 65. 88 (s), 64. 52 (s), 59. 18 (s), 58. 37 (s), 57. 48 (s), 50. 15 (s), 47. 48 (s), 45. 82 (s), 44. 29 (s), 41. 84 (s), 40. 62 (s), 4 0. 36 (s), 38. 98 (s), 35. 64 (s), 34. 24 (s), 31. 84 (d), 30. 78 (s), 29. 76 (s), 29. 33 (s), 28. 14 (s), 24. 87 (s), 18. 78 (s), 17. 69 (s), 11. 94 (s). Q-T0F-MS, m/z: Found [M+Na]+, 894. 3891, C40 H67Cl2N015calcd for[M] = 871. 3888, [M+Na] = 994. 3888.
[0064] 實施例3膽固醇-蔗糖酯型陽離子類脂（TSD-2D)的制備
[0065] (1)三氯蔗糖膽固醇酯的制備
[0066] 在裝有溫度計和回流管的250mL容器中加入3. 9g的三氯蔗糖、3g無水碳酸 鉀、5mL三甲胺和20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，油浴恒溫75°C，磁力攪拌下充分溶 解后滴加 lOmmol膽固醇順丁烯二酸，反應24h后得到淡黃色濾液，將其減壓蒸干溶 劑，得到琥珀色粘稠油狀液體。用柱層析純化后，即得淡黃色無定形狀的酯化產(chǎn)物。 1Η 匪R (400MHz，CDC13) δ : 6. 31 (s，4Η)，4. 73 - 4. 56 (m，6Η)，4. 55 - 4. 37 (m，6Η)，4. 26 (ddd，J =23. 6, 19. 1, 12. 2, 4H) , 3. 79 - 3. 57 (m, 5H) , 2. 66 - 0. 61 (m, 87H) , 1. 82 - 0. 61(m，71H), 1.73 - 0.88 (m，65H) ,0.82 (s，6H).13C NMR (400MHz，CDC13) δ :168. 13 (s)，167 .08 (s), 140. 62 (s), 132. 99 (s), 131. 80 (s), 121. 95 (s), 107. 88 (s), 94. 90 (s), 82. 14 (s), 80 .40 (s), 74. 89 (s), 74. 63 (s), 74. 02 (s), 73. 37 (s), 71. 64 (s), 66. 85 (s), 64. 52 (s), 55. 26 (s ),51. 39 (s), 50. 92 (s), 44. 29 (s), 42. 93 (s), 42. 59 (s), 39. 59 (s), 39. 43 (s), 39. 19 (s), 37. 80 (s), 37. 22 (s), 32. 76 (d), 32. 25 (s), 30. 45 (s), 28. 55-28. 27 (m), 27. 55 (s), 24. 28 (s), 22 .74(s), 21. 49(s), 18. 73(s), 12. 92 (s). Q-TOF-MS, m/z: Found [M+Na]+, 971. 3435, C42H63C1 3011calcd for[M] = 848.3436,[M+Na] = 971.3436.
[0067] (2)膽固醇-蔗糖酯型陽離子類脂的合成
[0068] 在裝有N2保護、溫度計、回流管和滴液漏斗的250mL容器中加入5. 2mmol的三氯 蔗糖膽固醇酯的異丁醇（20mL)溶液、l.Og無水碳酸鉀。水浴恒溫60°C，磁力攪拌下滴加 16. 5mmol二乙胺的甲醇（20mL)溶液，滴加時間約lh，滴完后，水浴溫度升至100°C，加壓到 2atm下反應6h。過濾反應混合物，得到濾液，將其減壓蒸干溶劑異丁醇，得到混合物，最后 通過制備色譜純化可獲得純度較高的膽固醇-蔗糖酯型陽離子類脂。
[0069] NMR (400MHz, CDC13) δ : 6. 3 1 (s, 4H) , 5. 0 1 - 4. 24 (m, 1 OH) , 5. 01 -3. 73 (m, 24H), 2. 85 (ddd, J = 23. 3, 12. 5, 6. 7, 6H), 2. 39 (q, J = 6. 3, 4H), 2. 24 -2. 14 (m, 4H), 2. 00 - 1. 83 (m, 8H), 2. 68 - 0. 75 (m, 107H), 2. 46 - 0. 75 (m, 105H) ,1.72- 1. 4 5 (m, 2OH) , 1.44 - 1. 3 5 (m, 6H) , 1. 3 4 - 0. 88 (m, 5 3H) , 0 . 8 2 ( s , 6H) . 13C NMR (400MHz, CDC13) δ :168. 13 (s), 167. 08 (s), 140. 62 (s), 132. 99 (s), 131. 80 (s), 121. 95 (s), 107. 88 (s), 94. 90 (s), 80. 40 (s), 78. 39 (s), 78. 09 (s), 74. 89 (s), 74. 02 (s), 73. 37 (s) ,71. 64 (s), 66. 85 (s), 64. 52 (s), 58. 25 (s), 55. 26 (s), 51. 39 (s), 50. 92 (s), 48. 12 (s), 44 .29 (s), 42. 59 (s), 39. 59 (s), 39. 43 (s), 39. 19 (s), 37. 80 (s), 37. 22 (s), 32. 76 (d), 32. 25 (s), 30. 45 (s), 28. 55-28. 27 (m), 27. 55 (s), 24. 28 (s), 22. 74 (s), 21. 49 (s), 18. 73 (s), 12 .92 (s), 12. 32 (s). Q-T0F-MS, m/z: Found [M+Na]+, 908. 4565, C46H73Cl2N0ncalcd for[M]= 885. 4561, [M+Na] = 908. 4561.
[0070] 實施例4陽離子脂質(zhì)體的制備
[0071] 上述實施例1、2和3得到的蔗糖酯型陽離子類脂TSI12、TSB-2I、TSD-2D、 TSI14(三氯蔗糖肉豆蔻酸酯季銨鹽）和TSI16(三氯蔗糖棕櫚酸酯季銨鹽）在紫外燈下照 lh，稱取lmg的陽離子類脂與一定量的DOPE(陽離子類脂與DOPE的摩爾比為2:1、1:1和 1:2)或膽固醇〇1〇1(陽離子類脂與〇1〇1的摩爾比為5:1、4:1、3:1、2:1和1:1)加入到11^ 氯仿中充分溶解，均勻氮氣流吹干，形成薄膜，真空干燥l〇h，除凈有機溶劑。加入lmL無菌 去離子水，恒溫55°C下超聲l_3h，至透明澄清，制備成終濃度為1. 00mM的陽離子脂質(zhì)體。
[0072] 實施例5陽離子脂質(zhì)體的粒徑以及Zeta電位的測定
[0073] 取約20 yL實施例4制備的陽離子脂質(zhì)體加入約lmL水中，利用Zeta-sizer-1000 型激光粒徑分析儀測定陽離子脂質(zhì)體的粒徑大小及分布（日本，H0RIBA Scientific公司， 激光波長630nm，散射角90°~173° )，結(jié)果如圖4所示。利用Zetaplus ζ -電位分析儀 (日本，H0RIBA Scientific公司）測定陽離子脂質(zhì)體的Zeta電位，結(jié)果如圖5所示。圖4和 圖 5 中 Lipofectamine 2000 (美國 Invitrogen 公司）和 D0TAP (N- (2, 3-二油酰氧基-1-丙 基）三甲基甲磺酸銨，瑞士 Roche公司）是目前本領(lǐng)域中常使用的陽離子脂質(zhì)體試劑。圖 4的結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體的粒徑在100~350nm之間，粒徑范圍在有效轉(zhuǎn)染粒徑范圍 (〈1 μL?)內(nèi)。圖5的結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體的Zeta電位在25~90mV之間，商品試劑 DOTAP 的 Zeta 電位為 29. 8mV 和 Lipofectamine 2000 的 Zeta 電位為 46. 4mV，具有結(jié)合負 電性尚子的能力（包括核酸等分子）。
[0074] 實施例6脂質(zhì)體-DNA復合物的制備
[0075] 首先將一定量的質(zhì)粒DNA (pGFP-N2或pGL-3)稀釋于DMEM中，制成25 μ L的體系； 再取一定體積的濃度為lmg/mL實施例4制備的陽離子脂質(zhì)體稀釋于DMEM中，制成25 μ L 的體系，然后將25 μ L脂質(zhì)體稀釋液滴加到25 μ L質(zhì)粒DNA的稀釋液中，使得脂質(zhì)體和DNA 的質(zhì)量比（yg/yg)分別為1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8 :1和10:1，用旋渦振蕩器充分混勻，室 溫溫育20min，使其形成50 μ L脂質(zhì)體-DNA復合物。
[0076] 實施例7陽離子脂質(zhì)體與DNA的結(jié)合能力檢測
[0077] 取20 μ L實施例6制備的復合物溶液與1. 6 μ L的上樣緩沖液（loading buffer， 日本Takara公司）混勻，加入到1. 2%瓊脂糖凝膠中，90V電泳lh。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察 DNA電泳圖譜并照相，如圖6所示。圖6a為單獨的TSI14脂質(zhì)體的結(jié)合DNA的能力測試結(jié) 果；圖6b，圖6c和圖6d分別為TSI14與DOPE分別以2:1、1:1和1:2混合制備的脂質(zhì)體的 結(jié)合DNA的能力測試結(jié)果。
[0078] 圖 6a、圖 6b、圖 6c 和圖 6d :第 1 泳道為 2kb DNA marker(ADNA/EcoR I+Hind III Markers，購自SABC)，第2泳道為裸DNA，第3-10泳道為脂質(zhì)體與DNA比例分別是1:1、2:1、 3:1、4 :1、6:1、8:1和10:1的脂質(zhì)體-0嫩復合物。在未加入脂質(zhì)體時（裸0嫩)，出現(xiàn)典型 的質(zhì)粒條帶。在加入脂質(zhì)體后，DNA條帶明顯減弱，隨著脂質(zhì)體的加入量的增加，DNA的延滯 能力明顯增強，說明本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體具有與DNA結(jié)合的能力。
[0079] 實施例8轉(zhuǎn)染效率的測定
[0080] 取實施例6制備的脂質(zhì)體-DNA復合物在細胞系Η印-2 (人喉癌上皮細胞）中進行 條件實驗，考察不同條件下的轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化試劑的使用條件。
[0081] 將細胞種植于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種適量的細胞，細胞培養(yǎng)液（含血清和 抗生素）總體積100 μ L。將細胞放置在37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中孵24h使在轉(zhuǎn)染日細胞密 度達到1~1. 5X104。
[0082] 移去生長培養(yǎng)基，用等量（100 μ L，無血清和抗生素）培養(yǎng)基替換。直接將50 μ L 實施例6的脂質(zhì)體-DNA復合物樣品加入板孔中，每個樣品設3個平行孔，搖動培養(yǎng)板，輕輕 混勻。在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，更換含血清和抗生素的培養(yǎng)基，培育48h后進行 基因表達分析。
[0083] 基因表達分析：
[0084] (1)綠色熒光蛋白檢測：用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。陽性細胞發(fā) 出明亮的綠色熒光，而陰性細胞則無，結(jié)果如圖7所示。
[0085] (2)螢光素酶檢測：先用PBS洗3次，然后每孔加入100 μ L裂解緩沖液，收集溶胞 產(chǎn)物，在12000rpm、4°C離心5min，取20 μ L上清液用于熒光素酶活力的檢測，用熒光素酶檢 測試劑，在Luminometer上進行檢測相對光單元（RUL)值，測量發(fā)光時間為10s，結(jié)果如圖8 所示。
[0086] 實驗結(jié)果如圖7和8所不，本發(fā)明制備的脂質(zhì)體均具有轉(zhuǎn)運DNA的能力，其中脂質(zhì) 體TSI14+C3/1與DNA比例為6/1和8/1時以及脂質(zhì)體TSI14+D 1/1與DNA比例為10/1時 的轉(zhuǎn)染效率要高于商品試劑Lipofectamine2000和DOTAP。
[0087] 實施例9MTT毒性測定
[0088] 在96孔細胞培養(yǎng)板上種植Η印-2 (人喉癌上皮細胞），平行3孔，取平均值。每 孔種植1.5Χ104個細胞/lOOyL培養(yǎng)液，在37°C，5% C02環(huán)境下培養(yǎng)至90%匯合度。移 去培養(yǎng)基，用D-Hank' s洗1次。質(zhì)粒DNA(pGFP-N2)0. 5 μ g和轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于DMEM 25 μ L中，然后將實施例6所制備的脂質(zhì)體-DNA復合物加入到96孔細胞培養(yǎng)板里；同樣 Lipofectamine2000(Lipo)(與質(zhì)粒的質(zhì)量比為3 : 1)和D0TAP (與質(zhì)粒的質(zhì)量比為6 : 1) 的復合物作為陽性對照加入到96孔細胞培養(yǎng)板里；采用不含陽離子脂質(zhì)體的100 μ L培養(yǎng) 基（無血清和無抗生素）作為陰性對照。在37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后 向每孔加入20yL 3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT)溶液（5mg/mL inPBS，pH 7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)511，移除培養(yǎng)基。生成的甲臜結(jié)晶用15(^1^二甲基亞砜（0130) 溶解，劇烈混合使甲臜溶解。在酶標儀上進行讀數(shù)，吸收波長570nm，酶標儀用無細胞的培養(yǎng) 基調(diào)零。陽離子脂質(zhì)體相對于對照細胞的相對存活率按下式計算：
[0089] [A]樣品/[A]對照 X100
[0090] [A]#s為測試孔的吸光值，[A]g為陰性對照孔的吸光值。
[0091] 實驗結(jié)果如圖9所示，本發(fā)明所制備的蔗糖酯型陽離子脂質(zhì)體在Hep-2細胞中的 細胞存活率普遍較高，均高于商品試劑Lipofectamine2000和D0TAP。
[0092] 實施例10陽離子微膠粒的制備
[0093] 將lmg的TSD-2D與一定量的蔗糖酯（陽離子類脂與蔗糖酯的摩爾比為2:1、1:1 和1:2)、殼聚糖（陽離子類脂與殼聚糖的摩爾比為2:1、1:1和1:2)或棕櫚酰油酰磷脂酰乙 醇胺（陽離子類脂與棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為5 :1、4:1、3:1、2:1和1:1)加入 溶于DMF中，制成濃度為lmg/mL的溶液。在劇烈攪拌的條件下逐滴加入去離子水，直至 溶液輕度變渾，得到穩(wěn)定的膠束溶液。將其轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于去離子水中透析，透析 過程中多次更換去離子水3d后，配成一定濃度為lmg/mL水溶液。
[0094] 實施例11微膠粒-siRNA復合物的制備
[0095] 首先將一定量的siRNA稀釋于DMEM中，制成25 μ L的體系；再取一定體積的濃度 為lmg/mL實施例10制備的陽離子微膠粒稀釋于DMEM中，制成25 μ L的體系，然后將25 μ L 微膠粒稀釋液滴加到25 μ L質(zhì)粒DNA的稀釋液中，使得微膠粒和siRNA的質(zhì)量比（μ g/ μ g) 分別為1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8:1和10:1，用旋渦振蕩器充分混勻，室溫溫育20min，使其 形成50 μ L微膠粒-siRNA復合物。
[0096] 實施例12陽離子微膠粒與siRNA的結(jié)合能力檢測
[0097] 取20 μ L實施例11制備的微膠粒-siRNA復合物溶液與1. 6 μ L的上樣緩沖液 (loading buffer，日本Takara公司）混勾，加入到1. 2%瓊脂糖凝膠中，90V電泳lh。在凝 膠成像系統(tǒng)中觀察siRNA電泳圖譜并照相。
【主權(quán)項】
1. 一類薦糖醋型陽離子類脂化合物，其特征在于：具有通式I的結(jié)構(gòu)： 其中：R選自。。2。控基、膽汁酸基和膽固醇醋基； Y選自-NR3R哺-N^ITRbR中，其中r3、r哺R。相同或不同，并且選自氨、Ci-e控基、Cie 徑烷基、半乳糖基、甘露糖基和/或葉酸醋基；X選自F \ cr、化、I。2. 權(quán)利要求1的薦糖醋型陽離子類脂化合物的制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) S氯薦糖和式i的化合物按照摩爾比1:1~50反應，制備化合物A :反應溫度為10~l〇〇°C，反應時間為10~50h，反應溶劑為如N，N-二甲基甲酯胺、化 晚、乙臘、贓晚、=乙胺等含氮溶劑，反應物與溶劑的質(zhì)量體積比為1:1~50 ; 式i的化合物選自Cie-2。控基酸、膽汁酸或膽固醇基酸。 r別化會物A巧古ii的化會物格昭藤戊hk 1 ? 1~S厲獻.曲I么化會物R .反應溫度為10~120°c，反應時間為10~40h，壓力為1.0~5. Oatm,反應溶劑為 N，N-二甲基甲酯胺、甲醇、乙醇、異丙醇或異下醇，反應物與溶劑的質(zhì)量體積比為1:1~ 50 ； 式ii的化合物中R3、R哺RE相同或不同，并且選自氨、Ci-e控基、Cie徑烷基、半乳糖基、 甘露糖基和/或葉酸醋基，化合物B中Y為-NITRb或-N +RaRbREX -，X-為F \ cr、化\ To3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的薦糖醋型陽離子類脂化合物的制備方法，其特征在于：當所 合成的產(chǎn)物為季錠鹽時，平衡陰離子F\化\ r可W通過離子交換柱替換Cl獲得。4. 一種陽離子類脂組合物，其特征在于：該組合物是由上述薦糖醋型陽離子類脂化 合物和類脂助劑組成，所述的薦糖醋型陽離子類脂化合物與類脂助劑的質(zhì)量比為10:1~ 1:10。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種陽離子類脂組合物，其特征在于：所述類脂助劑選自卵 憐脂、憐脂酷乙醇胺、糖脂、二油酷憐脂酷氯、棟桐酷油酷憐脂酷乙醇胺、二油酷憐脂酷乙醇 胺、膽固醇、殼聚糖、薦糖醋中的一種或兩種W上的混合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的陽離子類脂組合物，其特征在于：所述組合物為懸浮液，乳濁 液，微膠?；蛑|(zhì)體中的一種或兩種W上的混合物。7. -種陽離子類脂復合物，其特征在于：其是由上述陽離子類脂組合物與核酸結(jié)合組 成的物質(zhì)，并且陽離子類脂組合物與核酸的質(zhì)量比為20:1~1:20。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的陽離子類脂復合物，其特征在于：向細胞內(nèi)傳遞核酸為pDNA、 microRNA、SiRNA中的一種或兩種W上的混合物。
【文檔編號】C07J17/00GK105985386SQ201510071065
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發(fā)明人】張樹彪, 支德福, 崔韶暉, 趙軼男, 周泉
【申請人】大連民族學院