人源化抗激肽釋放酶-2抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了對人激肽釋放酶?2(hK2)具有結(jié)合特異性的抗體多肽，其中所述抗體多肽包含(a)包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和/或(b)包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，且其中所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包含來自一種或多種人抗體的框架氨基酸序列。本發(fā)明進一步提供了所述抗體多肽在診斷和治療前列腺癌中的用途。
【專利說明】人源化抗激肽釋放酶-2抗體 發(fā)明領域
[0001] -般而言，本發(fā)明屬于治療和診斷劑和方法的領域，具體而言在前列腺癌的領域 中。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 目前，前列腺癌是男性中最常見的癌癥形式。前列腺是男性中的一種核桃大小的 腺，其生成作為精液中的組分的流體。前列腺具有以組織外層包圍的兩個或更多個葉或部 分。前列腺位于直腸前面并且就在膀胱下方，并且圍繞尿道。
[0004] 前列腺癌的發(fā)生在歐洲西北部和美國是最高的。腫瘤的生長通常是長時間段期間 發(fā)生的過程。前列腺癌通常是癌癥的輕度形式。實際上，大多數(shù)診斷出前列腺癌的男性存活 并恢復，僅少數(shù)男性遇到前列腺癌的較具攻擊性的形式，其在早期階段中轉(zhuǎn)移。前列腺癌的 此種攻擊性形式僅當它在早期階段時，在癌癥已經(jīng)擴散至囊外組織前得到診斷時可以能治 愈。
[0005] 現(xiàn)今，通常通過測量患者血液中的前列腺特異性抗原(PSA)的濃度實施前列腺癌 的診斷和監(jiān)測。若PSA的濃度在不同時間點時實施的幾次連續(xù)測量中明顯較高，則評估是有 前列腺癌的可能性。在此時間點時，可以實施活組織檢查以確認前列腺癌。
[0006] PSA(又稱為激肽釋放酶III)是一種由237個氨基酸的單鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其在前 列腺的分泌細胞中生成。可以在整個前列腺腺體中找到這些分泌細胞。PSA是就前列腺癌而 言完善建立并且徹底研究的標志物。通過與健康細胞比較，PSA的生成在惡性細胞中更低并 且在增生細胞中更高。相當矛盾的是，實際上，PSA的濃度在患有前列腺癌的男性的血液中 較高。然而，一種解釋可以是惡性細胞具有惡化的細胞結(jié)構(gòu)，并且因此對PSA更能透過。
[0007] 適合作為前列腺癌療法的靶物的另一種重要的絲氨酸蛋白酶是人腺激肽釋放酶2 (hK2)。編碼hK2的基因與編碼PSA的基因一起位于染色體19上。就像PSA-樣，hK2主要在前 列腺組織中表達。在前列腺中，PSA以無活性的原形式存在，并且經(jīng)由hK2的肽酶作用活化。 就hK2而言的免疫組織化學研究已經(jīng)顯示了 hK2相對于分化水平表達。這意味著hK2在低分 化的組織(諸如經(jīng)受前列腺癌的組織）中以較高的產(chǎn)率表達，而在高分化的組織(諸如經(jīng)受 良性前列腺增生(BPH)的組織，所述良性前列腺增生是另一種常見的前列腺問題）中以較低 的產(chǎn)率表達。
[0008] 現(xiàn)今的前列腺癌療法是手術(例如根治性前列腺切除術）、放射療法(包括近程療 法和外部束放射療法、高強度聚焦超聲(HIFU))、化學療法、口服化學治療藥物、冷凍手術 (冷凍腫瘤）、激素療法(諸如抗雄激素療法）、去勢或前述項的組合。
[0009] 然而，這些療法(手術和外部放射療法）中的大多數(shù)僅(或主要)可用于治療原發(fā)性 腫瘤和大轉(zhuǎn)移?；瘜W療法用于癌癥的播散性，但是對于這些患者中的大多數(shù)，它是姑息效果 和/或延長的存活。因此，其它或互補的治療形式是必需的，以實現(xiàn)播散性惡性疾病的相當 大的改善，特別是在微轉(zhuǎn)移的情況中。
[0010] 使用靶向性分子(諸如抗體和片段)療法，諸如免疫療法或放射性免疫療法可以給 出治療播散性疾病的可能性。
[0011]如此，需要用于治療和診斷前列腺癌的新的治療劑和方法。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 因而，本發(fā)明尋求單一或以任何組合緩和、減輕或消除本領域中的一個或多個上 文鑒定的缺陷和缺點，并且通過提供依照所附專利權利要求書的治療劑和方法至少解決上 文提及的問題。
[0014] 本發(fā)明的第一個方面提供了對人激肽釋放酶-2 (hK2)具有結(jié)合特異性的抗體多 肽，其中所述抗體多肽包含：
[0015] (a)包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
[0016] CDRH1:SDYAWN SEQ ID NO:1
[0017] CDRH2:YISYSGSTTYNPSLKS SEQ ID NO :2
[0018] CDRH3:GYYYGSGF SEQ ID NO :3
[0019] 和/或
[0020] (b)包含SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，
[0021] CDRL1:KASESVEYFGTSLMH SEQ ID NO :4
[0022] CDRL2:AASNRES SEQ ID NO:5
[0023] CDRL3:QQTRKVPYT SEQ ID NO:6
[0024] 且其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包含來自一種或多種人抗體的框架氨基酸序列。 [0025]上文的6種氨基酸序列代表本發(fā)明的抗體多肽的互補決定區(qū)（CDR)，如依照Kabat et al.，（1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，NIH，Bethesda，MD(通過提 及將其公開內(nèi)容收入本文)定義的。
[0026]通過"抗體多肽"，我們包括基本上完整的抗體分子、單鏈抗體、雙抗體、雙特異性 抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、及其抗原結(jié)合片段和 衍生物。
[0027]如本文中使用的，術語"氨基酸"包括標準的20種遺傳編碼氨基酸及其相應的"D" 形式(與天然的"L"形式相比）的立體異構(gòu)體、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨 基酸(例如α，α_雙取代的氨基酸、N-烴基氨基酸，等等)和化學衍生化的氨基酸(見下文）。 [0028]在明確列舉氨基酸諸如"丙氨酸"或"Ala"或"Α"時，術語指L-丙氨酸和D-丙氨酸兩 者，除非另有明確敘述。其它非常規(guī)氨基酸也可以是適合于本發(fā)明的多肽的組分，只要期望 的功能特性由多肽保留。對于顯示的肽，每種編碼的氨基酸殘基在適當?shù)那闆r中以單字母 名稱代表，所述單字母名稱對應于常規(guī)氨基酸的俗名。
[0029]在一個實施方案中，如本文中定義的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸組成。
[0030]本發(fā)明的抗體多肽對hK2展現(xiàn)出特異性。
[0031] 一種例示性的沾2序列描述為轉(zhuǎn)錄物：1(1^2-201^舊1'00000325321 )，基因 ENSG00000167751的產(chǎn)物，如在Ensemble數(shù)據(jù)庫中給出的，所述數(shù)據(jù)庫可以參見下述萬維網(wǎng) 地址：
[0032] ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g= ENSG00000167751；r=19:51376689-51383822；t=ENST00000325321
[0033] 并且具有以下序列：
[0035] [SEQ ID N0:7](其中成熟的活性hK2蛋白的序列是加下劃線的，所述序列在其N端 前面有信號肽和前肽序列）。
[0036] 精漿中找到的大部分hK2是無活性并且與蛋白C抑制劑(PCI)復合的。也可能的是， hK2與其它胞外蛋白酶抑制劑形成復合物。體外研究顯示了 hK2能結(jié)合α2_抗纖維蛋白溶酶 (a2-AP)、ACT、AMG、抗凝血酶ΙΙΙ(ΑΤΠΙ)、C1-滅活劑和纖溶酶原激活物抑制劑-l(PAI-l)。 [0037]在一個實施方案中，與hK2的復合同等型相比，抗體多肽對hK2的游離(也就是說非 復合）同等型具有特異性。對hK2的游離同等型具有特異性的結(jié)合模塊可以對在hK2的游離 同等型上暴露，但在hK2的復合同等型上未暴露的表位具有結(jié)合特異性，并且這可以是線性 或構(gòu)象性(也就是說非線性)表位。例如，抗體多肽可以對包含一個或多個氨基酸殘基的表 位具有特異性，所述氨基酸殘基是游離的hK2中暴露并且在復合同等型(諸如在hK2與PCI復 合時存在于精液中的形式）中未暴露的h K 2的催化裂縫的部分。h K 2的表位定位記載于 Vlisiinenet al，Clinical Chemistry 50:9,1607-1617(2004)，通過提及將其公開內(nèi)容收 入本文。
[0038] 通過以下登錄號鑒定hK2蛋白的別的例子：
[0039] (a)GenBank：AAF08277.1；
[0040] (b)GenBank:AAF08275.1;和
[0041 ] (c)UniProtKB/Swiss-Prot:Ρ20151·1〇
[0042]重組hK2的生成記載于Lovgren et al ·，1999，Eur · J.Biochem. 266:1050-5(通過 提及將其公開內(nèi)容收入本文）。
[0043]通過"特異性"，我們意指抗體多肽能夠在體內(nèi)（即在hK2存在于人身體內(nèi)的生理學 條件下)結(jié)合hK2。優(yōu)選地，抗體多肽在體內(nèi)不結(jié)合任何其它蛋白質(zhì)。
[0044] 可以通過本領域中公知的方法，諸如ELISA、免疫組織化學、免疫沉淀、Western印 跡和使用表達hK2的轉(zhuǎn)染細胞的流式細胞術測定此類結(jié)合特異性。有利地，抗體多肽能夠選 擇性結(jié)合hK2,即它比對另一種蛋白質(zhì)(特別地，其它激肽釋放酶，諸如前列腺特異性抗原或 PSA)強烈至少10倍結(jié)合hK2。優(yōu)選地，抗原多肽在體內(nèi)不結(jié)合PSA。
[0045] 對hK2具有特異性的鼠抗體是本領域中已知的。例如，Vdisiinenet al.，2004， Clinical Chemistry 50(9) :1607-1617描述了對hK2具有特異性的小鼠中的單克隆抗體的 生成(通過提及將其公開內(nèi)容收入本文）。敘述了抗體中稱作"11B6"和"7D7"的兩種對hK2是 選擇性的。
[0046] 在國際專利申請No.PCT/GB2012/052675(W0 2013/061083;通過提及將其公開內(nèi) 容完整收入本文）中披露了鼠抗體11B6的組分重和輕鏈的氨基酸序列;特別參見其中的SEQ ID N0:4和5。
[0047] 本發(fā)明的抗體多肽基于11B6抗體的選定的人源化型式，其展現(xiàn)出意料不到的有利 特性。
[0048]特別地，本發(fā)明的人源化抗體與衍生其CDR序列的親本鼠11B6抗體(mllB6)相比展 現(xiàn)出增強的治療比率(見實施例6)。
[0049] 通過"增強的治療比率"，我們意指本發(fā)明的抗體多肽（11B6抗體的人源化形式)在 對前列腺腫瘤患者施用時提供比親本鼠11B6抗體(在相同放射性和施用路徑時比較)更高 的腫瘤吸收劑量與(健康)骨髓吸收劑量的比率。可以使用實施例6中描述的方法計算腫瘤 與骨髓吸收劑量的比率。
[0050] 本發(fā)明的抗體的好得意料不到的治療概況容許使用較高的放射劑量(吸收劑量）， 從而在不增加對健康組織和器官的副作用或"附帶損傷"的情況下導致前列腺癌治療中的 較大效力。
[0051] 人源化(又稱作重塑或CDR嫁接)是一種用于降低來自異種來源(通常來自嚙齒類， 諸如小鼠）的單克隆抗體的免疫原性并且用于改善其對人免疫系統(tǒng)的激活的技術（參見 Almagro&Fransson，2008,Frontiers in Bioscience 13:1619-1633的綜述；通過提及將其 公開內(nèi)容收入本文）。臨床試驗中有幾種人源化的單克隆抗體，并且已經(jīng)對幾種給予要作為 藥物使用的批準。雖然使用分子生物學技術生成工程化單克隆抗體的機械學是相對直截了 當?shù)?，但是將嚙齒類互補決定區(qū)（CDR)簡單嫁接入人框架中不總是重建初始單克隆抗體的 結(jié)合親和力和特異性。為了使抗體人源化，人源化抗體的設計在再現(xiàn)初始分子的功能中是 一個至關重要的步驟。
[0052] 人源化抗體的設計包括幾個關鍵的選擇，包括要使用的CDR和要使用的人框架的 程度。然而，為了保留親本抗體的特異性，也可能至關重要的是將來自嚙齒類單抗的一個或 多個殘基替代入人框架區(qū)中（所謂的回復突變）。鑒定必需的回復突變的位置需要詳細的序 列/結(jié)構(gòu)分析。最近，已經(jīng)使用噬菌體文庫來改變選定位置處的氨基酸。類似地，已經(jīng)使用許 多方法來選擇接受嚙齒類CDR嫁接的最合適的人框架。早期實驗使用有限亞組的完全表征 的人單克隆抗體(經(jīng)常在結(jié)構(gòu)可用的情況中），不管與嚙齒類單克隆抗體的序列同一性(所 謂的固定框架方法）。一些小組使用與嚙齒類可變區(qū)具有高氨基酸序列同一性的可變區(qū)（同 源性匹配或最佳擬合）；其它小組使用共有或種系序列，而又一些小組選擇來自幾種不同人 單克隆抗體的每種輕或重鏈可變區(qū)內(nèi)的框架序列的片段。還有用人單克隆抗體中找到的最 常見的殘基替換表面嚙齒類殘基的開發(fā)的人源化方法（"表面重修"或"鑲面"）和那些使用 ⑶R程度的不同定義的方法。
[0053] 然而，盡管抗體人源化的廣泛研究，一些嚙齒類單克隆抗體已經(jīng)證明難以人源化。 [0054]本發(fā)明的抗體多肽的開放需要不僅在框架區(qū)中，而且還在一些CDR中的回復突變 (見下文的實施例1)。如此，上文以SEQ ID N0:1至6表示的6種⑶R序列自鼠抗hK2抗體11B6 衍生，但是相對于親本鼠抗體含有CDRH2(SEQIDN0:2)和CDRL1(SEQIDN0 :4)中的突變。 做出⑶R中的這些突變以對11B6的人源化型式賦予最佳的特異性和穩(wěn)定性。
[0055]在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體多肽以大于0.1xl0_9M的KD結(jié)合hK2。
[0056] 用于測量相互作用（諸如抗體和配體之間的相互作用）的總體親和力（KD)和結(jié)合 速率(ka)和解離速率(kd)的方法是本領域中公知的。下文的實施例3中描述了例示性的體 外方法。也想得到使用基于流式細胞術的方法（Sklar et al.，2002，Annu Rev Biophys Biomol Struct，31:97-119;通過提及將其內(nèi)容收入本文）。
[0057] 有利地，本發(fā)明的抗體多肽具有低于1.0xl0_1()M的對hK2的親和力(KD)，例如低于 9.0x10- ηΜ、8·0x10-ηΜ、7·0x10-ηΜ、6·0x10-ηΜ、5·0x10- ηΜ、4·0x10-ηΜ、3·0x10-ηΜ、2·0x10 -ηΜ 或低于 1.0x10-ηΜ 的 Kd。
[0058] 本領域技術人員會領會，本發(fā)明的抗體多肽可以構(gòu)成抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重 和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、和抗原結(jié)合片段及其衍生物。
[0059] 在一個實施方案中，抗體多肽包含完整（即完全)抗體或由完整（即完全)抗體組 成，諸如 IgA、IgD、IgE、IgG或IgM分子。
[0060] 有利地，抗體多肽包含完整IgG分子、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，或者由完整IgG 分子、或其抗原結(jié)合片段或衍生物組成。
[0061 ] IgG分子可以是任何已知亞型的，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。
[0062] 通過抗體的"抗原結(jié)合片段和衍生物"，我們包括Fv片段(例如單鏈Fv和成二硫鍵 的Fv)、Fab樣片段(例如Fab片段、Fab'片段和F(ab) 2片段)和域抗體(例如單一VH可變域或VL 可變域）。
[0063] 例如，抗體多肽可以包含scFv或Fab片段或由scFv或Fab片段組成。
[0064] 本發(fā)明的抗體多肽的進一步表征特征是重和輕鏈可變區(qū)中存在來自一種或多種 人抗體的框架氨基酸序列。
[0065] 通過"框架序列"，我們包括重和輕鏈可變域中除了CDR外的區(qū)域。通常，每個可變 域會包含4個框架區(qū)，稱作FR1至FR4,⑶R序列位于所述框架區(qū)內(nèi)：
[0066] FR1--CDR1--FR2--CDR2--FR3--CDR3--FR4。
[0067] 應當領會，框架區(qū)的氨基酸序列可以是完全人的或者可以含有一處或多處回復突 變(即，人框架中存在的氨基酸序列可以用衍生CDR的親本嚙齒類可變域內(nèi)的相應位置處找 到的氨基酸取代）。因此，本發(fā)明的抗體多肽的重和/或輕鏈可變域的FR1、FR2、FR3和/或FR4 的序列可以是非天然存在的。
[0068] 在一個實施方案中，抗體多肽的框架序列與來自一種或多種人抗體的框架區(qū)共享 至少70%序列同一性，例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。如 此，抗體多肽可以包含與人抗體的FR1區(qū)共享至少70%序列同一性的重鏈FR1區(qū)。然而，會領 會抗體多肽的重和輕鏈可以與不同人抗體的框架區(qū)共享序列同一性。
[0069] 可以通過例如在Expasy設施站點（http : //www · ch · embnet · org/sof tware/ LALIGN_form. html)的 LALIGN程序（Huang and Miller，Adv .Appl .Math .(1991)12:337-357)使用全局比對選項、評分矩陣BL0SUM62、開放缺口罰分-14、延伸缺口罰分-4作為參數(shù) 測定百分比同一性?；蛘?，可以使用合適的計算機程序，例如威斯康辛大學遺傳計算組 (University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序測定兩種多肽間的百 分比序列同一性，并且會領會，就已經(jīng)最佳對比其序列的多肽而言計算百分比同一性。
[0070] 或者，可以使用Clustal W程序（如記載于Thompson et al ·，1994，Nucl · Acid Res. 22:4673-4680,通過提及將其收入本文)實施比對。使用的參數(shù)可以如下：
[0071 ]-快速成對比對參數(shù):K-元組(字)大??；1，窗口大小;5，缺口罰分;3，頂部對角線數(shù) 目；5.評分罰分:x百分比。
[0072] -多重比對參數(shù):缺口開放罰分;10,缺口延伸罰分;0.05。
[0073] -評分矩陣：BL0SUM。
[0074] 或者，可以使用BESTFIT程序來測定局部序列比對。
[0075]在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體多肽的重可變域的框架序列由人免疫球蛋白 VH4基因家族編碼。
[0076] 例如，框架序列可以至少部分由VH4-28種系基因編碼（例如FR1、FR2和FR3可以由 VH4-28編碼，并且FR4可以由JH1編碼）。
[0077] 如此，在一個實施方案中，抗體多肽可以包含重鏈可變區(qū)或者由重鏈可變區(qū)組成， 所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或由SEQ ID N0:8的氨基酸序列組成：
[0079] [SEQ ID N0：8]〇
[0080] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體多肽的輕可變域的框架序列由人免疫球蛋白κ V4基因家族編碼。
[0081 ] 例如，框架序列可以至少部分由IgkV4-B3種系基因編碼（例如FR1、FR2和FR3可以 由IgkV4-B3編碼，并且FR4可以由JK2編碼）。
[0082]如此，在一個實施方案中，抗體多肽可以包含輕鏈可變區(qū)或者由輕鏈可變區(qū)組成， 所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或由SEQ ID N0:9的氨基酸序列組成：
[0084] [SEQ ID N0：9]〇
[0085] 通過"至少部分"，我們包括框架序列包含由參照基因編碼的至少10個連續(xù)氨基 酸，例如至少20個連續(xù)氨基酸。我們還包括一個或多個，但不是所有FR區(qū)由參照基因編碼 (例如，F(xiàn)R1和FR2可以由參照基因編碼，但FR3不然）。
[0086] 在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體多肽包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或由SEQ ID N0:8的氨基酸序列組成，所述輕鏈可變區(qū) 包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或由SEQ ID N0:9的氨基酸序列組成。
[0087] 任選地，本發(fā)明的抗體多肽進一步包含重鏈恒定區(qū)或其部分。
[0088] 在一個實施方案中，抗體多肽包含IgG重鏈(諸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重鏈）的 CH1、CH2和/或CH3區(qū)。如此，抗體多肽可以包含部分或整個來自IgGl重鏈的恒定區(qū)。例如，抗 體多肽可以是包含CH1和CL恒定區(qū)的Fab片段。
[0089] 在一個實施方案中，抗體多肽可以包含抗體Fc區(qū)。技術人員會領會，F(xiàn)c部分可以來 自IgG抗體，或者來自不同類的抗體(諸如IgM、IgA、IgD或IgE)。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是 來自 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
[0090] Fc區(qū)可以是天然存在的（例如內(nèi)源生成的抗體的一部分)或者可以是人工的（例如 包含相對于天然存在的Fc區(qū)的一處或多處點突變和/或?qū)H2域內(nèi)的碳水化合物模塊的修 飾）。具有改善其結(jié)合FcR的能力的點突變的Fc區(qū)可以是有利的，例如通過改變血清半衰期 或者通過調(diào)控(即增強或降低)牽涉ADCC和⑶C的對Fc γ受體(Fc γ R)的結(jié)合實現(xiàn)。
[0091] 有利地，抗體多肽可以包含SEQIDN0:10的氨基酸序列，或其部分：
[0093] [SEQ ID N0:10]。
[0094] 任選地，本發(fā)明的抗體多肽進一步包含輕鏈恒定區(qū)或其部分。
[0095] 在一個實施方案中，抗體多肽包含IgG輕鏈(諸如κ或λ輕鏈)的CL區(qū)。
[0096]例如，抗體多肽可以包含SEQ ID Ν0:11的氨基酸序列或其部分：
[0098] [SEQ ID N0:11]。
[0099] 有利地，抗體多肽包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列組成，所述輕鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列組成。
[0100] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體多肽包含：
[0101] (a)重鏈，其包含SEQ ID N0:12的氨基酸序列或由SEQ ID N0:12的氨基酸序列組 成(其中可變區(qū)為粗體，并且CDR序列為有框的斜體字）：
[0103] [SEQ ID NO：12],
[0104] 和/或
[0105] (b)輕鏈，其包含SEQ ID N0:13的氨基酸序列或由SEQ ID N0:13的氨基酸序列組 成(其中可變區(qū)為粗體，并且CDR序列為有框的斜體字）：
[0108] [SEQ ID N0:13]。
[0109] 例如，抗體多肽可以包含兩個SEQ ID NO: 12的重鏈和兩個SEQ ID NO: 13的輕鏈或 者由兩個SEQ ID NO: 12的重鏈和兩個SEQ ID NO: 13的輕鏈組成，所述兩個SEQ ID NO: 12的 重鏈和兩個SEQ ID NO: 13的輕鏈通過二硫化物橋連接在一起以形成典型的IgG抗體結(jié)構(gòu)。
[0110] 本發(fā)明的抗體多肽可以包含已經(jīng)修飾或衍生化的一個或多個氨基酸或者由已經(jīng) 修飾或衍生化的一個或多個氨基酸組成。
[0111] 可以通過與官能性側(cè)基反應實現(xiàn)一個或多個氨基酸的化學衍生物。此類衍生化的 分子包括例如已經(jīng)衍生化游離的氨基基團以形成胺氫氯酸鹽(amine hydrochlorides)、對 甲苯磺酰基基團、羧基苯甲酰氧基（carboxybenzoxy)基團、叔丁基氧基羰基（t-butyloxyearbonyl)基團、氯乙酰基(chloroacetyl)基團或甲?；鶊F的那些分子?？梢匝?生化游離的羧基基團以形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯和酰肼?？梢匝苌坞x的羥 基基團以形成〇-酰基或〇-烴基衍生物。還以化學衍生物包括含有20種標準氨基酸的天然存 在的氨基酸衍生物的那些肽。例如:可以用4-羥脯氨酸替代脯氨酸;可以用5-羥賴氨酸替代 賴氨酸;可以用3-甲基組氨酸替代組氨酸;可以用高絲氨酸替代絲氨酸，并且用鳥氨酸替代 賴氨酸。衍生物還包括含有一處或多處添加或刪除的肽，只要必要的活性得到維持。其它包 括的修飾是酰胺化、氨基端?；?例如乙?；蛄虼掖妓狨０坊?、末端羧基酰胺化(例如 用氨水或甲胺)和類似的末端修飾。
[0112] 本領域技術人員會進一步領會，肽模擬物化合物也可以是有用的。術語"肽模擬 物"指模擬作為治療劑的特定肽的構(gòu)象和期望特征的化合物。
[0113] 例如，所述多肽不僅包括氨基酸殘基通過肽(-C0-NH-)連接而連接的分子，而且還 包括反轉(zhuǎn)肽鍵的分子。可以使用本領域中已知的方法，例如諸如那些記載于Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159,3230-3237(通過提及將其收入本文）的方法生成此類逆反 (retro-inverso)肽模擬物。此方法牽涉生成含有牽涉主鏈，而非側(cè)鏈取向的變化的假肽。 逆反肽(其含有NH-C0鍵而非C0-NH肽鍵)對蛋白水解有多得多的抗性。或者，所述多肽可以 是肽模擬物化合物，其中替換常規(guī)酰胺連接，通過-y(CH 2NH)_鍵連接一個或多個氨基酸殘 基。
[0114] 在一個別的備選中，可以總體上分配肽鍵，只要使用保留氨基酸殘基的碳原子間 的間隔的合適接頭模塊;可以有利的是接頭模塊與肽鍵具有基本上相同的電荷分布和基本 上相同的平面性。
[0115] 會領會，所述多肽可以在其N或C端方便封閉，從而幫助降低對外切蛋白水解消化 的易感性。
[0116] 也已經(jīng)使用多種未編碼的或經(jīng)修飾的氨基酸，諸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸來修 飾哺乳動物肽。另外，可以通過共價修飾，諸如環(huán)化或者通過摻入內(nèi)酰胺或其它類型的橋穩(wěn) 定化假設的生物活性構(gòu)象，例如見Veber et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636 和Thursell et al ·，1983，Biochem.Biophys .Res ·Comm· 111: 166，通過提及將其收入本文。
[0117] 本領域技術人員會領會，可以用功能性模塊提升本發(fā)明的抗體多肽以促進其意圖 的用途，例如作為體內(nèi)成像劑或治療劑。
[0118] 如此，在一個實施方案中，抗體多肽與治療性模塊直接或間接連接。
[0119]可以使用任何合適的治療性模塊。合適的治療性模塊是能夠降低或抑制前列腺癌 細胞的生長或者特別殺死前列腺癌細胞的模塊。例如，治療劑可以是細胞毒性模塊。細胞毒 性模塊可以包含一種或多種放射性同位素或由一種或多種放射性同位素組成。例如，一種 或多種中的每一種放射性同位素可以獨立選自下組:β-發(fā)射體、俄歇-發(fā)射體、轉(zhuǎn)換電子-發(fā) 射體、α-發(fā)射體、和低光子能量-發(fā)射體?？梢云谕环N或多種中的每一種放射性同位素獨 立具有在藥劑附近創(chuàng)建高吸收劑量的局部吸收能量的發(fā)射樣式。例示性的放射性同位素可 以包括:長程β-發(fā)射體，諸如 9°Y、32P、186Re/186Re; 166Ho、76As/77As、89Sr、 153Sm;中程β-發(fā)射體， 諸如1311、1'1!、67〇 1、161113、1°5此低能量|3-發(fā)射體，諸如 4心或355;轉(zhuǎn)換或俄歇-發(fā)射體，諸 如 510、676&、991'。1\ 111111、1141"111、1231、1251、 2°11'1;和€[-發(fā)射體，諸如21也、21也、 221。、225八。、 21懷、255伽、 2231^、149113和22^。其它放射性核素是可用的，并且會可能用于療法。
[0120]在另一個實施方案中，可以期望治療性模塊或細胞毒性模塊不是如在W0 2006/ 087374 Α1中，特別是在其第11頁，第7-15行以"示蹤劑"披露的模塊。
[0121] 在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體多肽與放射性同位素 mLu連接(或用放射性同位 素177!^以其它方式標記）。
[0122] 或者，治療性模塊可以包含一種或多種治療性(諸如細胞毒性)藥物或者由一種或 多種治療性(諸如細胞毒性)藥物組成，例如細胞抑制性藥物;抗雄激素藥物;可的松及其衍 生物；膦酸鹽/酯；睪酮-5-α-還原酶抑制劑；硼附加物；細胞因子；毒胡蘿卜素 (thapsigargin)及其代謝物；毒素（諸如皂草素（saporin)或加利車霉素 (calicheamicin));化學治療劑(諸如抗代謝物）；或可用于治療前列腺癌的任何其它治療 劑或細胞毒性藥物。
[0123] 例示性的治療劑/細胞毒性藥物可以例如包括：
[0124] ?細胞抑制劑，特別是那些具有劑量限制副作用的細胞抑制劑，包括但不限于環(huán) 磷酰胺(cyclophosamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil )、異環(huán)磷酰胺（ifosfamide)、白消安 (busulphane，busulfan)、洛莫司?。╨Omustine )、紫杉燒（taxanes)、磷酸雌莫司汀 (681：瓜1]11181：；[116口1108口1^丨6)和其它氮芥、抗生素(包括多柔比星((1(?01'1113；[0；[116)、加利車霉 素和針棘霉素(esperamicine))、長春花生物喊(vinca alkaloids)、楝喊(azaridines)、含 鉬化合物、內(nèi)皮他?。╡ndostatin)、烷基磺酸鹽（alkyl sulfonates)、亞硝基脲 (nitrosoureas)、三氮稀(triazenes)、葉酸類似物、啼啶類似物、噪呤類似物、酶、取代尿素 (substituted urea)、甲基餅(methyl-hydrazine)衍生物、柔紅霉素（daunorubicin)、兩親 性胺（amphipathic amines)，
[0125] ?抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)和比卡魯胺(bikalutamide)及其代謝物；
[0126] ?可的松及其衍生物；
[0127] ?膦酸鹽/酯，諸如二膦酸鹽/酯（diphophonate )和雙膦酸鹽/酯 (buphosphonate)；
[0128] ?睪酮-5-α-還原酶抑制劑；
[0129] ?硼附加物；
[0130] ?細胞因子；
[0131] ?毒胡蘿卜素及其代謝物；
[0132] ?可用于治療前列腺癌的其它藥物。
[0133] 或者，細胞毒性模塊可以包含一種或多種模塊或者由一種或多種模塊組成，所述 模塊適合于在活化療法，諸如光子活化療法、中子活化療法、中子誘導的俄歇電子療法、同 步加速器照射療法、或低能量X-射線光子活化療法中使用。
[0134] 例如，憑借本發(fā)明的抗體多肽，會有使用同步加速器放射(或低能量X-射線）以推 進放射療法的潛力，所述放射療法主要聚焦于所謂的光子活化放射療法(PAT)，其中通過與 預施用的高Z腫瘤靶向劑相互作用在癌癥組織中增強來自外部X-射線照射的局部能量沉 積。
[0135] PAT臺療形式利用來自同步加速器來源的單色X-射線，諸如由格勒諾布爾 (Grenoble)的歐洲同步加速器放射設施（European Synchrotron Radiation Facility， ESRF)的ID17生物醫(yī)學束線提供，并且如預期在未來的其它設施，諸如新的瑞典同步加速器 設施（Swedish synchrotron facility)Max_IV可用。
[0136] 作為別的潛在治療形式，關于"誘導的俄歇電子腫瘤療法"的研究是在隆德(Lund) 的即將到來的歐洲散裂源(European Spallation Source，ESS)，和有希望地醫(yī)學實驗站。 已經(jīng)長期使用反應器產(chǎn)生的熱和半熱中子進行硼中子俘獲療法(Boron-Neutron-Capture-Therapy)BNCT，既用于臨床前實驗又用于用給出高局部吸收能量的誘導的α-顆粒和反沖核 ( 7L)治療腦腫瘤。類似的方法是使用中子和適合于中子的用高橫截面的穩(wěn)定核標記的腫瘤 靶向性分子?？贵w或肽可以例如用穩(wěn)定的釓( 157Gd)標記，并且起中子的靶分子作用，所述中 子被Gd-核俘獲，所謂的釓中子俘獲療法(GdNCT)。通過蒙特卡洛(Monte Carlo)技術，計算 腫瘤和周圍組織中的劑量分布，因為它源自γ-光子、中子、核反沖、以及特征性X-射線、來 自釓或其它潛在元素的內(nèi)部轉(zhuǎn)換和俄歇-電子。
[0137] 如上文討論的，治療性模塊(諸如放射性同位素、細胞毒性模塊等)可以與結(jié)合模 塊(諸如抗體或其片段)直接或間接連接。合適的接頭是本領域中已知的，并且包括例如輔 基、非酚接頭(Ν-琥珀酰亞胺基-苯甲酸酯的衍生物;十二硼酸鹽(dodecaborate))、大環(huán)類 (macrocyclics)和無環(huán)螯合劑兩者的螯合模塊，諸如1，4,7,10-四氮雜環(huán)十二燒-1，4,7， 10,四乙酸(D0TA)的衍生物、去鐵胺(DF0)、二乙撐三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-異 硫氰酸芐基)-1，4,7_三氮雜環(huán)壬烷-1，4,7-三乙酸(ΝΟΤΑ)的衍生物和1，4,8，11_四氮雜環(huán) 十二烷-l，4,8，ll-四乙酸(TETA)的衍生物、3,6,9，15-四氮雜二環(huán)[9.3.1]-十五-l(15)， 11，13-三烯-4-(5)-(4-異硫氰酸芐基）-3,6,9-三乙酸（？0^)的衍生物、5-5-(4-氨基芐 氧)-1_氧雜-4,7，10-三氮雜環(huán)十二烷-4,7，10-三（乙酸）（D03A)的衍生物和其它螯合模塊。 此類接頭的使用在下述情況中可以是特別合適的，其中藥劑包含經(jīng)由接頭與作為治療性模 塊的放射性同位素連接的作為結(jié)合模塊的抗體或其片段或由經(jīng)由接頭與作為治療性模塊 的放射性同位素連接的作為結(jié)合模塊的抗體或其片段組成。
[0138] 一種優(yōu)選的接頭是DTPA，例如如mLu-DTPA-[本發(fā)明的抗體多肽]中使用的。
[0139] 別的優(yōu)選接頭是去鐵胺DF0,例如如89Zr-DF〇-[本發(fā)明的抗體多肽]中使用的。
[0140] 任選地，本發(fā)明的抗體多肽可以（或不可以）進一步包含可檢測模塊。例如，可檢測 模塊可以包含放射性同位素或由放射性同位素組成，諸如選自下組的放射性同位素 :99mTc 、111111、6^1、686&、 7：^8、892^1231和2()11'1。任選地，藥劑可以包含一對可檢測且細胞毒性的放 射性核素，諸如 86Y/9°y或124I/211At?；蛘?，藥劑可以包含能夠以多模式方式以可檢測模塊及 也以細胞毒性模塊同時起作用以提供所謂的"多模式治療診斷學"的放射性同位素。如此， 可以偶聯(lián)結(jié)合模塊與納米顆粒，所述納米顆粒具有多重成像(例如SPECT、PET、MRI、*#S 超聲）的能力以及使用細胞毒性藥物(諸如放射性核素或化學療法劑）的治療能力。在本發(fā) 明的情況中還包括通過使用高頻交替磁場的過熱的治療和伴隨的超聲成像的可能性。
[0141] 或者，可檢測模塊可以包含順磁性同位素或由順磁性同位素組成，諸如順磁性同 位素選自下組: 157Gd、55Mn、162Dy、52Cr 和 56Fe。
[0142] 若抗體多肽包含可檢測模塊，則可檢測模塊可以通過成像技術，諸如SPECT、PET、 MRI、光學或超聲成像可檢出。
[0143] 可以使用本領域中公知的方法將治療性且可檢測的模塊與抗體多肽綴合或以其 它方式組合(例如，現(xiàn)存的免疫綴合物療法吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin) [商品名：Mylotarg?]包含與細胞毒素加利車霉素(calicheamicin)連接的單克隆抗體）。
[0144] 在別的實施方案中，以包含抗體多肽分子群體的配制劑的形式使用本發(fā)明的抗體 多肽治療前列腺癌。在一個選項中，群體中的所有(或基本上所有，諸如按重量計大于90%、 95%、99%、99.9%或更多)抗體多肽分子包含相同治療性模塊。在另一個選項中，群體包含 具有不同治療性模塊的其它藥劑的混合物。此選項會給出增強使用各種藥劑(諸如化學治 療劑、激素治療劑或其它療法組合)的靶向放射性核素療法的效果的可能性，其中靶向劑不 僅將治療活性放射性核素投遞至腫瘤關聯(lián)抗原，而且還通過調(diào)控(例如觸發(fā)或阻斷)胞內(nèi)信 號傳導級聯(lián)同時放射性敏化靶定的腫瘤細胞。此選項也可用于用細胞毒劑的混合物治療前 列腺癌，例如使用α-發(fā)射體和不同射程的β-發(fā)射體的混合物，或具有不同射程、LET(線性能 量傳遞)和RBE(相對生物學活性)的放射性核素的混合物，以組合治療大腫瘤、微轉(zhuǎn)移、和單 一腫瘤細胞。在一個實施方案中，可以使用長程發(fā)射體治療大腫瘤，并且可以使用短程發(fā)射 體治療較小的腫瘤，諸如微轉(zhuǎn)移，和單一腫瘤細胞。
[0145] 任選地，本發(fā)明的抗體多肽可以（不可以）進一步包含用于延長藥劑的體內(nèi)半衰期 的模塊。用于延長藥劑的體內(nèi)半衰期的例示性模塊可以包括聚乙二醇（PEG)、人血清清蛋 白、糖基化基團、脂肪酸和右旋糖昔?？梢蕴貏e涵蓋PEG。
[0146] 會領會，可以凍干本發(fā)明的多肽以進行貯存，并且在使用前在合適的載劑中重建， 例如經(jīng)由冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧冷卻、或者經(jīng)由使用自超臨界二氧化碳的顆粒形成(沉 淀）?？梢圆捎萌魏魏线m的凍干方法(例如冷凍干燥、噴霧干燥、濾餅干燥(cake drying)) 和/或重建技術。本領域技術人員會領會，凍干和重建可以導致不同程度的活性喪失，并且 可能不得不向上調(diào)節(jié)使用水平以進行補償。優(yōu)選地，凍干的（冷凍干燥的）多肽在再水合時 喪失不超過約1 %的其(凍干前)活性，或者在再水合時喪失不超過約5 %、10 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%或不超過約50%的其（凍干前)活性。
[0147] 用于生成本發(fā)明的多肽的方法是本領域中公知的。
[0148] 方便地，多肽是或包含重組多肽。適合于生成此類重組多肽的方法是本領域中公 知的，諸如在原核或真核宿主細胞中表達（例如見3&111131'〇〇1^&1?1188611，2000，]\1〇16(311131 Cloning,A Laboratory Manual，Third Edition,Cold Spring Harbor，New York，在此通 過提及收錄該文獻中的相關公開內(nèi)容）。
[0149] 也可以使用商品化體外翻譯系統(tǒng)，諸如家兔網(wǎng)織紅細胞裂解物或麥胚裂解物(可 獲自Promega)生成本發(fā)明的抗體多肽。優(yōu)選地，翻譯系統(tǒng)是家兔網(wǎng)織紅細胞裂解物。方便 地，可以偶聯(lián)翻譯系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，諸如TNT轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)(Promega)。此系統(tǒng)具有在與翻 譯相同的反應中自編碼DNA多核苷酸生成合適的mRNA轉(zhuǎn)錄物的優(yōu)點。
[0150] 本領域技術人員會領會，或者可以人工合成本發(fā)明的多肽，例如使用公知的液相 或固相合成技術(諸如t-Boc或Fmoc固相肽合成)進行。
[0151] 本發(fā)明的第二個方面提供了編碼本發(fā)明的抗體多肽或其組分多肽鏈的分離的核 酸分子。通過"核酸分子"，我們包括DNA(例如基因組DNA或互補DNA)和mRNA分子，其可以是 單鏈或雙鏈。
[0152] 在一個實施方案中，核酸分子是cDNA分子。
[0153] 本領域技術人員會領會，可以密碼子優(yōu)化核酸分子以在特定的宿主細胞中表達抗 體多肽，例如在人細胞中表達(例如見Angov，2011，Biotechnol.J.6(6):650-659)。
[0154] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含：
[0155] (a)SEQIDN0:14的核苷酸序列
[0157] [SEQ ID NO：14],
[0158] 和/或
[0159] (b)SEQIDN0:15的核苷酸序列
[0161] [SEQ ID N0:15]。
[0162] 本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括下列各項：
[0163] (a)本發(fā)明的第三個方面提供了載體(諸如表達載體），其包含依照本發(fā)明的第二 個方面的核酸分子；
[0164] (b)本發(fā)明的第四個方面提供了宿主細胞(諸如哺乳動物細胞，例如人細胞），其包 含依照本發(fā)明的第二個方面的核酸分子或依照本發(fā)明的第三個方面的載體;和
[0165] (c)本發(fā)明的第五個方面提供了生成依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽的方 法，其包括在表達所述多肽的條件下培養(yǎng)依照本發(fā)明的第四個方面的宿主細胞的群體，并 且自其分離多肽。
[0166] 本發(fā)明的第六個方面提供了藥物組合物，其包含藥學有效量的本發(fā)明的第一個方 面的抗體多肽和藥學可接受稀釋劑、載劑或賦形劑。
[0167] 藥物組合物中還可以包含別的化合物，包括螯合劑，諸如EDTA、檸檬酸鹽、EGTA或 谷胱甘肽。
[0168] 可以以本領域中已知的方式制備藥物組合物，其是足夠貯存穩(wěn)定的，并且適合于 對人和動物施用。例如，可以例如經(jīng)由冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧冷卻、或者經(jīng)由使用自超臨 界顆粒形成的顆粒形成凍干藥物組合物。
[0169] 通過"藥學可接受的"，我們意指不降低本發(fā)明的藥劑的激肽釋放酶蛋白質(zhì)結(jié)合活 性的效率的無毒性材料。此類藥學可接受緩沖劑、載劑或賦形劑是本領域中公知的（見 Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A·RGennaro編Mack Publishing Company(1990)和Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe編， Pharmaceutical Press(2000)，通過提及將其公開內(nèi)容收入本文）。
[0170] 術語"緩沖劑"意圖指以穩(wěn)定化pH為目的的含有酸-堿混合物的水性溶液。緩沖劑 的例子是 1^211^、8丨(^116、1^(^116、]\?^5、]\?^50、]\?^5、1^8、!16?68、冊？85、]\^5、磷酸鹽、碳 酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、羥乙酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPS0、 BES、CABS、甲次砷酸鹽（。3(3〇狀1&七6)、(：冊5、01?504??5、乙醇胺、甘氨酸、冊？？50、咪唑、咪 唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、P0PS0、TAPS、TABS、TAPS0 和 TES。
[0171] 術語"稀釋劑"意圖指以稀釋藥物制劑中的藥劑為目的的水性或非水性溶液。稀釋 劑可以是下列一項或多項：鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油（諸如紅花油、玉米油、花 生油、棉籽油或芝麻油）。
[0172] 術語"佐劑"意圖指對配制劑添加以提高本發(fā)明的藥劑的生物學效果的任何化合 物。佐劑可以是下列一項或多項:具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽，例如但不限于氟化物、氯 化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽(tiocyanate)、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸 鹽、羥乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽、和不同?；M成的乙酸鹽。佐劑也可以是陽離 子聚合物，諸如陽離子纖維素醚、陽離子纖維素酯、脫乙酰化透明質(zhì)酸、殼聚糖、陽離子樹枝 狀聚合物(dendrimer)、陽離子合成聚合物諸如聚（乙烯基咪唑）、和陽離子多肽(諸如聚組 氨酸、聚賴氨酸、聚精氨酸）、和含有這些氨基酸的肽。
[0173] 賦形劑可以是下列一項或多項：碳水化合物、聚合物、脂質(zhì)和礦物質(zhì)。碳水化合物 的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、和環(huán)糊精，其對組合物添加例如以促進凍干。聚 合物的例子是淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙 基羥乙基纖維素、藻酸鹽、角叉菜膠(carageenans)、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺 酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同程度水解的 聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮(都具有不同分子量），它們對組合物添加，例如以控制粘 度、以實現(xiàn)生物粘著、或者以保護脂質(zhì)免于化學和蛋白水解降解。脂質(zhì)的例子是脂肪酸、磷 月旨、甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯、神經(jīng)酰胺、鞘脂和糖脂(都具有不同的?；滈L度和飽 和度）、蛋卵磷脂，大豆卵磷脂、氫化的蛋和大豆卵磷脂，出于與聚合物的那些原因相似的原 因?qū)⑺鼈兲砑又两M合物。礦物質(zhì)的例子是滑石、氧化鎂、氧化鋅和氧化鈦，其對組合物添加 以獲得益處，諸如降低液體積累或有利的色素特性。
[0174] 可以將本發(fā)明的抗體多肽配制成本領域中已知的任何類型的藥物組合物以適合 于其投遞。
[0175] 在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以為脂質(zhì)體形式，其中在其它藥學可 接受載劑外，組合抗體多肽與兩親性藥劑，諸如脂質(zhì)，其以聚集形式以膠束、不溶性單層和 液晶存在。適合于脂質(zhì)體配制的脂質(zhì)包括但不限于甘油單酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷 月旨、磷脂、皂苷、膽汁酸等。合適的脂質(zhì)也包括在極性首基中通過聚（乙二醇)修飾的上述脂 質(zhì)以延長血流循環(huán)時間。此類脂質(zhì)體配制劑的制備可以參見例如US 4,235,871，通過提及 將其公開內(nèi)容收入本文。
[0176] 本發(fā)明的藥物組合物也可以為可生物降解微球的形式。已經(jīng)在微球的生成中廣泛 使用脂肪族聚酯，諸如聚（乳酸）（PLA)、聚（乙醇酸）（PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚 (己內(nèi)酯）（PCL)和聚酐作為可生物降解聚合物。此類微球的制備可以參見US 5,851，451和 EP 0 213 303,通過提及將其公開內(nèi)容收入本文。
[0177] 在別的實施方案中，可以以聚合物凝膠形式提供本發(fā)明的藥物組合物，其中使用 聚合物諸如淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基 羥乙基纖維素、藻酸鹽、角叉菜膠（carageenans)、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯 基咪唑、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同 程度水解的聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮增稠含有藥劑的溶液。聚合物也可以包含明 膠或膠原。
[0178] 或者，可以僅在鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油（諸如紅花油、玉米油、花生 油、棉籽油或芝麻油）、黃蓍膠、和/或各種緩沖劑中溶解抗體多肽。
[0179] 會領會，本發(fā)明的藥物組合物可以包含離子和限定的pH以增強活性抗體多肽的作 用。另外，組合物可以進行常規(guī)制藥操作諸如滅菌和/或可以含有常規(guī)的佐劑諸如防腐劑、 穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、緩沖劑、填充劑等。
[0180]可以經(jīng)由本領域技術人員已知的任何合適的路徑施用依照本發(fā)明的藥物組合物。 如此，可能的施用路徑包括胃腸外(靜脈內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)）、表面、眼、鼻、肺、含服、口服、胃 腸外和直腸。自植入物施用也是可能的。由于施用藥劑的潛在高細胞毒性，輸注可以是期望 的路徑。
[0181 ]在一個實施方案中，胃腸外，例如靜脈內(nèi)、腦室內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、 心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用藥物組合物，或者可以通過輸注技術施用它們。以 無菌水性溶液形式方便地使用它們，所述無菌水性溶液可以含有其它物質(zhì)，例如足以使溶 液與血液等張的鹽或葡萄糖。在必要時，應當適當緩沖水性溶液(例如至3-9的pH)。容易通 過本領域技術人員公知的標準制藥技術實現(xiàn)在無菌條件下制備合適的胃腸外配制劑。
[0182] 適合于胃腸外施用的配制劑包括可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使配制劑 與意圖接受者的血液等張的溶質(zhì)的水性和非水性無菌注射溶液;和可以包含懸浮劑和增稠 劑的水性和非水性無菌懸浮液。配制劑可以在單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿和管 形瓶）中呈現(xiàn)，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，僅需要剛好在使用前添加無菌液體 載劑(例如注射用水）?？梢宰韵惹懊枋龇N類的無菌粉末、顆粒劑和片劑制備即時注射溶液 和懸浮液。
[0183] 如此，本發(fā)明的藥物組合物特別適合于胃腸外，例如靜脈內(nèi)施用或者對患者中的 腫瘤的局部施用(例如腫瘤內(nèi)或腫瘤周）。
[0184] 會以藥學有效劑量（即治療性放射性核素的治療有效吸收劑量)對患者施用藥物 組合物。
[0185] 如本文中使用的，在本發(fā)明的抗體多肽的治療用途的背景中，"藥學有效量"，或 "有效量"，或"治療有效"指對于給定狀況和施用方案提供治療效果的量。這是活性材料的 預先確定的數(shù)量，其經(jīng)計算以與需要的添加劑和稀釋劑（即載劑或施用媒介物)結(jié)合產(chǎn)生期 望的治療效果。此外，它意圖指足以降低和/或防止宿主的活性、功能和應答的臨床顯著缺 乏的量?；蛘?，治療有效量足以引起宿主中的臨床顯著狀況的改善。如本領域技術人員領會 的，化合物的量可以隨其比活而變化。合適的劑量量可以含有經(jīng)計算以與需要的稀釋劑結(jié) 合產(chǎn)生期望的治療效果的活性組合物的預先確定數(shù)量。在用于制備本發(fā)明的組合物的方法 和用途中，提供了治療有效量的活性組分。基于患者特征，諸如年齡、重量、性別、狀況、并發(fā) 癥、其它疾病等，治療有效量可以由普通技術醫(yī)學工作人員確定，如本領域中公知的（見下 文實施例8)?？梢约韧ㄟ^以個別劑量單位，否則幾個較小劑量單位的形式的單次施用，又通 過以特定時間間隔多次施用細分劑量實施藥學有效劑量的施用?；蛘?，可以在延長的時段 里以連續(xù)輸注提供劑量。
[0186] 如本文中使用的，在本發(fā)明的抗體多肽的診斷用途的背景中，"藥學有效量"，或 "有效量"，或"診斷有效"指出于體內(nèi)成像目的提供可檢測信號的量。
[0187] 根據(jù)使用的化合物的效力/毒性，可以以各種濃度配制本發(fā)明的抗體多肽。配制劑 可以包含0 . ΙμΜ和ImM之間，ΙμΜ和500μΜ之間，500μΜ和ImM之間，300μΜ和700μΜ之間，ΙμΜ和 100μΜ之間，100μΜ和200μΜ之間，200μΜ和300μΜ之間，300μΜ和400μΜ之間，400μΜ和500μΜ之間 和約500μΜ的濃度的多肽。
[0188] 通常，人患者中的抗體多肽（具有或沒有治療性模塊）的治療劑量會在每次施用 lOOyg至700mg的范圍中（基于70kg的體重）。例如，最大治療劑量可以在每次施用0.1至 10mg/kg的范圍中，例如0.1和5mg/kg之間或1和5mg/kg之間或0.1和2mg/kg之間。會領會，可 以以不同時間間隔施用此類劑量，如由腫瘤學家/內(nèi)科醫(yī)生確定的；例如，可以每天、每周兩 次、每周、每兩周或每月施用劑量。
[0189] 本領域技術人員會領會，可以單獨或與治療前列腺癌中使用的其它治療劑組合， 或者在用用于治療前列腺癌的其它治療形式，諸如其它治療性抗體、手術(例如根治性前列 腺切除術）、放射性核素療法、近程療法、外部束放射療法、高強度聚焦超聲(HIFU)、化學療 法、口服化學治療性藥物、冷凍手術(冷凍腫瘤）、激素療法(諸如抗雄激素療法）、去勢或前 述項的組合治療患者之前、之后或同時施用本發(fā)明的藥物組合物。
[0190] 本發(fā)明的第七個方面提供了試劑盒，其包含依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽 或依照本發(fā)明的第六個方面的藥物組合物，連同如本文中描述的其用途的用法說明。
[0191] 本發(fā)明的第八個方面提供了依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽，其在藥物中使 用。
[0192] 本發(fā)明的第九個方面提供了依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽，其在治療和/ 或診斷前列腺癌中使用。
[0193] 本發(fā)明的第十個方面提供了治療受試者中的前列腺癌的方法，所述方法包括對受 試者施用治療有效量的依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽。
[0194] 通過"治療/處理"，我們包括患者的治療性和防范性處理兩者。術語"防范性"用于 涵蓋使用如本文中描述的藥劑或其配制劑，其防止或降低前列腺癌，或者患者或受試者中 的局限性前列腺癌的擴散、播散或轉(zhuǎn)移的可能性。術語"防范性"還涵蓋使用如本文中描述 的藥劑或其配制劑以防止先前已經(jīng)治療前列腺癌的患者中的前列腺癌復發(fā)。
[0195] 本發(fā)明的第十一個方面提供了診斷受試者中的前列腺癌的方法，所述方法包括對 受試者施用診斷有效量的依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽。
[0196] 通過"診斷"，我們包括檢測體內(nèi)（即在患者身體內(nèi)）或離體（即自患者的身體取出 的組織或細胞樣品內(nèi)）的前列腺癌細胞。
[0197] 要治療或診斷的前列腺癌可以局限于前列腺，或者可以是非局限性（也就是說播 散性)前列腺癌。依照TNM系統(tǒng)（自腫瘤/結(jié)節(jié)/轉(zhuǎn)移縮寫），例如可以將局限于前列腺的前列 腺癌分類為臨床T1或T2癌癥，而例如可以將非局限性/播散性前列腺癌分類為臨床T3或T4 癌癥。
[0198] 要治療或診斷的前列腺癌可以是轉(zhuǎn)移性前列腺癌。轉(zhuǎn)移指癌癥自其初始位置擴散 到身體中的其它部位。例如，要治療或診斷的轉(zhuǎn)移性前列腺癌可以是淋巴系統(tǒng)中；骨(包括 脊柱、椎骨、骨盆、肋骨）中存在的轉(zhuǎn)移;骨盆、直腸、膀胱、或尿道內(nèi)的轉(zhuǎn)移。也可以用本發(fā)明 治療其它不太常見的位置處存在的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移可以是微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移是一種轉(zhuǎn)移形式，其中 新形成的腫瘤一般太小以致于不能檢出，或者難以檢出。例如，本發(fā)明給技術人員提供了治 療單一癌細胞或細胞簇的手段，即使此類細胞或簇的存在不可能診斷，但是例如作為隱性 播散性疾病存在。
[0199] 因而，預期與前列腺癌的現(xiàn)有技術治療相比通過本發(fā)明提供的治療的特別重要的 技術優(yōu)點是治療播散性和/或轉(zhuǎn)移性(包括微轉(zhuǎn)移性)前列腺癌中的增強的效力。
[0200] 如此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于預防或治療原發(fā)性前列腺腫瘤的轉(zhuǎn) 移的抗體多肽和方法。
[0201] 前列腺癌趨向于在超過年齡50歲的男性中，更通常在超過60、65或70歲的男性中 形成，并且盡管它是男性中的最普遍的癌癥類型之一，但是許多人從未具有癥狀，不經(jīng)歷療 法，并且最終死于其它原因。這是因為前列腺癌在大多數(shù)情況中是緩慢生長、無癥狀的，并 且由于具有該狀況的男性是年長的，他們經(jīng)常死于與前列腺癌無關的原因，諸如心臟/循環(huán) 系統(tǒng)疾病、肺炎、其它無關聯(lián)的癌癥、或老齡。約三分之二的前列腺癌病例是緩慢生長的，另 三分之一更具攻擊性并且快速形成。
[0202] 因而，用于治療和診斷前列腺癌的有效方法的開發(fā)對于管理更具攻擊性且快速形 成的癌癥形式(特別是在較年輕的患者中）是特別重要的。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明 涉及治療或診斷患者中的前列腺癌，所述患者在診斷前列腺癌時和/或在治療時小于9 0、 85、80、75、70、65、60、55、50、45、40或更小歲齡。
[0203] 與沒有家族史的男性相比，認為具有一名具有前列腺癌的一級親屬(父親或兄弟） 的男性具有形成前列腺癌的風險的兩倍，并且認為那些具有受累的兩名一級親屬的男性具 有大5倍的風險。因而，本發(fā)明可以涉及治療或診斷患者中的前列腺癌，所述患者的特征在 于1、2名或更多家庭成員，特別是一級家庭成員（諸如父親或兄弟)先前已經(jīng)診斷出前列腺 癌。
[0204] 本發(fā)明還涉及治療或診斷患者中的前列腺癌，其中要治療的前列腺癌具有去勢抗 性前列腺癌(CRPChCRPC可以以通常在1至3年后對激素治療變得難治，并且盡管有激素療 法仍恢復生長為特征。
[0205] 在本發(fā)明的醫(yī)學用途和方法中，通常將抗體多肽注射或輸注入患者的身體中。在 體內(nèi)，抗體多肽然后結(jié)合生成靶抗原h(huán)K2的組織;主要是前列腺癌細胞及其轉(zhuǎn)移。在結(jié)合時， 抗體多肽可以直接施加治療效果(例如經(jīng)由ADCC、CDC或者依靠攜帶放射性同位素或其它細 胞毒性模塊誘導細胞死亡）。或者，結(jié)合的抗體多肽可以充當診斷(成像)工具，其可以引導 療法的選擇或者幫助癌細胞的手術除去。
[0206] 本領域技術人員會領會，可以與其它治療和/或診斷劑/處理，諸如外部放射療法、 手術、細胞抑制劑和雄激素處理組合使用本發(fā)明的抗體多肽。
[0207] 前述描述聚焦于適用于用于治療和診斷前列腺癌的方法的本發(fā)明的實施方案。然 而，會領會，本發(fā)明不限于此類應用，而是可以可用于術后檢查、和放射、細胞抑制和雄激素 治療期間或之后的檢查。
[0208] 在另一個實施方案中，可以在手術期間和/或之前使用放射引導手術(RGS)或圖像 引導手術（Image-Guided Surgery，IGS)鑒定經(jīng)示蹤劑標記的本發(fā)明的抗體多肽。如此，可 以在手術期間和/或之前施用包含如上文討論的可檢測模塊的抗體多肽。在此實施方案中， 首先可以輸注抗體多肽。此后，可以在手術期間或之前使用RGS/IGS來用對可檢測模塊靈敏 的檢測儀鑒定hK2生成性組織。例如，可檢測模塊可以是放射發(fā)射或磁敏感性可檢測模塊； 例如，它可以是契侖科夫(Cerenkov)放射和/或初致放射(Bremsstrahlung)的發(fā)射體;它可 以是熒光標記物和/或磁性或可磁化標記物。因而，依照本發(fā)明的RGS/IGS可以例如是基于 光學、契侖科夫、軔致放射、或β放射的檢測;放射性核素標記物的檢測，和/或可以牽涉磁力 測定的方法。RGS作為手術技術而為本領域技術人員公知，所述手術技術使外科醫(yī)生能夠鑒 定由可檢測模塊"標記"的組織。
[0209] 可以組合依照上述方法獲得的顯現(xiàn)與其它放射學顯現(xiàn)方法，諸如SPECT/PET、計算 機斷層攝影術(computed tomography，CT)、超聲(US)、和磁共振成像(MRI)。
[0210]因而，在又一個方面中，本發(fā)明還提供了抗體多肽，其用于通過在手術(諸如放射 引導或圖像引導手術)之前或期間對前列腺癌患者施用在藥物中使用。
[0211]本發(fā)明的又一個方面提供了用于檢測受試者的血液中的前列腺腫瘤細胞的體外 方法，所述方法包括：
[0212] (a)提供來自要測試的受試者的血液樣品；
[0213] (b)任選地，提取和/或純化所述血液樣品中存在的細胞；
[0214] (c)使依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽與所述血液樣品中存在的細胞接觸；
[0215] (d)測定(直接或間接)所述抗體多肽是否結(jié)合游離（即未復合)的hK2,其中所述抗 體多肽對游離的hK2的結(jié)合指示受試者血液中的前列腺腫瘤細胞的存在。
[0216] 如此，本發(fā)明包括實施測定法以測定血液樣品是否含有游離的hK2;游離的hK2的 存在指示受試者血液中的前列腺腫瘤細胞的存在。
[0217] 本領域技術人員會領會，有多種實施此類測定法的方式。例如，免疫測定法可以是 同質(zhì)的或更優(yōu)選地異質(zhì)的。也可以以競爭或更優(yōu)選地非競爭形式實施測定法。
[0218]在異質(zhì)的非競爭性測定法的情況中，例示性的方案可以是：
[0219] (a)提供來自要測試的受試者的血液樣品；
[0220] (b)任選地，提取和/或純化所述血液樣品中存在的細胞；
[0221] (c)使固相固定化的依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽與血液樣品中存在的細 胞接觸；
[0222] (d)清洗以除去可溶性組分(不與固體表面結(jié)合）；
[0223] (e)添加示蹤劑，即用報告分子/顆粒標記的另一種抗hK2特異性抗體；
[0224] (f)清洗以除去未結(jié)合的示蹤劑抗體;并
[0225] (g)檢測來自示蹤劑抗體的信號。
[0226] 在步驟b和cSc和d之間，通常應當有溫育期以容許細胞生成可溶性hK2,然后使它 被檢出。
[0227] 本發(fā)明的又一個方面提供了用于檢測受試者的組織中的前列腺腫瘤細胞的體外 方法，所述方法包括：
[0228] (a)提供來自要測試的受試者的組織樣品(此類組織學樣品）；
[0229] (b)任選地，提取和/或純化所述組織樣品中存在的細胞；
[0230] (c)使依照本發(fā)明的第一個方面的抗體多肽與所述組織樣品中存在的細胞接觸；
[0231] (d)測定(直接或間接)所述抗體多肽是否結(jié)合游離（即未復合)的hK2,其中所述抗 體多肽對游離的hK2的結(jié)合指示受試者組織中的前列腺腫瘤細胞的存在。
[0232] 在上述體外方法的一個實施方案中，通過ELISA實施步驟(d)。然而，可以使用適合 于體外檢測抗體-抗原相互作用的任何測定法。
[0233] 在別的實施方案中，方法進一步包括量化樣品中的前列腺腫瘤細胞。
[0234] 在上述體外方法的別的實施方案中，方法用于診斷受試者中的前列腺癌。
[0235] 在權利要求書和/或說明書中結(jié)合術語"包含"使用時，詞語"一個"或"一種"的使 用可以意指"一個/種"，但是它也與"一個/種或多個/種"、"至少一個/種"和"一個/種或超 過一個/種"的意義一致。
[0236] 在結(jié)合上述描述和附圖考慮時會更好地領會并理解本發(fā)明的這些和其它實施方 案。然而，應當理解，上述描述雖然指示本發(fā)明的各個實施方案及其眾多具體細節(jié)，但作為 例示而非限制給出。可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)在不偏離其精神的前提下做出許多替代、修改、 添加和/或重排，并且本發(fā)明包括所有此類替代、修改、添加和/或重排。
[0237] 附圖簡述
[0238] 附圖形成本說明書的一部分，并且包括在內(nèi)以進一步表明本發(fā)明的某些方面?？?以通過參考與本文中呈現(xiàn)的具體實施方案的詳細描述結(jié)合的這些附圖中的一幅或多幅更 好地理解本發(fā)明。
[0239] 圖1:本發(fā)明的例示性人源化11B6 Fab片段的重和輕鏈可變區(qū)的序列。
[0240]圖2:用鼠和人源化11B6抗體的天然和還原性樣品進行的SDS-PAGE凝膠。
[0241]圖3:在測試11B6抗體結(jié)合芯片上的hK2后的結(jié)合階段。
[0242] 圖4:測試11B6抗體的解離階段。
[0243] 圖5: gmLu標記的人源化11B6抗體的生物分布。
[0244] 圖6:例示性SPECT圖像，其顯示了經(jīng)mLu標記的hllB6對小鼠中的前列腺腫瘤的結(jié) 合。
[0245] 圖7:腫瘤和骨中的gmLu標記的h 11B6和m 11B6的百分比攝取。
[0246] 圖8:腫瘤與骨中的每克經(jīng)mLu標記的hllB6和mllB6的百分比攝取的比率。
[0247] 圖9: (a)人源化11B6抗體和(b)鼠11B6抗體的動力學。
[0248] 圖10:自血液清除經(jīng)mLu標記的hllB6和mllB6。
[0249] 圖11:用1771^-1186處理之前(頂部圖像)和之后(底部圖像）的腫瘤大小的代表性 照片。
[0250] 圖12:(&)單一放射性量"0"的1'11-1186，（13)雙重放射性量"2叉0"的 1771^-1186和 (c)對照處理對LNCaP異種移植物中的腫瘤大小的影響的匯總。
[0251] 圖13:關于用單劑mLu_llB6處理的1只LNCaP異種移植物小鼠的(a)腫瘤生長數(shù)據(jù) 和(b)SPECT圖像。
[°252]圖14: (a)接受經(jīng)mLu標記的依照本發(fā)明的hllB6抗體的動物，（b)接受經(jīng)mLu標記 的非特異性IgG "同種型對照"抗體的動物和(c)僅接受NaCl的動物的作為注射后天數(shù)的函 數(shù)的腫瘤體積。在第〇天時施用處理。如果發(fā)生下述事件，那么終止動物:大腫瘤體積(直徑 > 14mm);大重量減輕(與初始重量相比，重量減輕>15%);受負面影響的一般狀況;或者所 有這三項參數(shù)的組合。（右邊的數(shù)字是每只動物的ID編號）。
[0253] 圖15:圖14中顯示的三種處理組的Kaplan-Meier曲線。實線：mLu-hllB6;虛線： gmLu標記的非特異性IgG "同種型對照"抗體;點線:NaCl。
[0254] 包括以下實施例以表明本發(fā)明的具體實施方案。本領域技術人員應當領會，以下 實施例中公開的技術代表由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實施中完全發(fā)揮功能的技術，并且如此 可以認為構(gòu)成用于其實施的具體模式。然而，考慮到本公開內(nèi)容，本領域技術人員應當領會 可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下對公開的具體實施方案做出許多變化，并且仍 獲得相似或類似的結(jié)果。 實施例
[0255] 實施例1:自雜交瘤細胞系克隆11B6
[0256] 試劑
[0257] 使用單克隆抗體11B6生成性雜交瘤細胞系進行mRNA提取和抗體生成，進一步親和 純化所述抗體以進行蛋白質(zhì)測序(VEisSnen.et al.，2〇〇4)。
[0258] 限制酶、FastAP和T4DNA連接酶來自Fermentas，引物來自土爾庫大學生物技術部 (University of Turku，Department of Biotechnology)(W0252)和Thermo Scientific。 用Qiagen凝膠提取和PCR純化試劑盒完成DNA純化。
[0259] mRNA提取和cDNA合成
[0260] 用QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒（Amersham Biosciences)自 11B6單抗生成 性雜交瘤細胞(5E6細胞)提取mRNA，并且用Applied Biosystems的高容量cDNA檔案試劑盒 (High-capacity cDNA archive kit)依照用法說明完成自mRNA的cDNA合成。
[0261] 自cDNA擴增抗體基因
[0262] 在赫爾辛基大學(University of Helsinki)蛋白質(zhì)測序服務通過Edman降解測定 純化的11B6單抗重(H)和輕(L)鏈的N端序列。輕鏈序列是DIVLTQSPAS[SEQIDN0:16]，并且 重鏈序列是DVQLQESGPG[SEQ ID N0:17]。氨基酸的頂GT數(shù)據(jù)庫比較分別鑒定基因：IGKV3和 IGHV3?；诰幋aN端氨基酸的DNA序列(通過NCBI BLAST找到)設計正向PCR引物(簡并）的互 補區(qū)。用于克隆重鏈的反向引物設計為結(jié)合CH1。在輕鏈的情況中，使用兩種反向引物;第一 PCR中使用的反向引物結(jié)合CL，并且第二PCR中使用的另一種反向引物結(jié)合I和α的邊界。所 有引物還含有克隆需要的限制酶識別位點（隨后加下劃線）。
[0263] 輕鏈正向引物是 SfiI_DIVLTQ SPAS[SEQ ID Ν0:16]:(5'-TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAYATHGTRYTVACNCARTCTCC-3 ' ； [SEQ ID NO: 18])和反向引 物TO252(5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3'，XbaI;[SEQ ID NO:19])和CpoI_ JK2(5，-GATACAGTTGGTGCAGCATCGGTCCGTTTT ATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT-3'；[SEQ ID NO: 20])。
[0264] 重鏈正向引物是NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID N0:17](5'_ TGCTGCTGGCGGCCGCTCCAGCCATGGCTGAYGT VCARCTKCAGGAGTCDGG_3'；[SEQIDN0:21]WPg 向引物asCHl_SacI (5 ' -CGCCACCAGAGCTCTCACAATCCCTGGGCACAATTTTC-3 ' ; [SEQ ID NO: 22])。
[0265] 在PCR反應中擴增Vl+Cl片段，所述PCR反應含有作為模板的lOOng cDNA、0.2mM (1ΝΤΡ、0·5μΜ引物Sfil DIVLTQSPAS[SEQ ID N0:16]和TO252、lx Phusion HF緩沖液和0.6U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)。通過下述方案完成擴增：98°C 30sec，30個循環(huán)的98°C 7sec，50°C 20sec，72°C 20sec，和72°C最終延伸10min。在對PCR產(chǎn)物測序并且找出Vl-Cl邊 界的序列后，在與上文相似的反應中再次自cDNA完成用于實際克隆的PCR，只是用引物 SfiI_DIVLTQSPAS[SEQ ID N0:16]和CpoI_JK2以僅克隆Vl部分。通過下述方案完成擴增:98 °C 30sec，10個循環(huán)的98°C 7sec，6(TC 20sec，72°C 20sec，25個循環(huán)的98°C 7sec，56°C 20sec，72°C 20sec，并且72°C最終延伸 10mm。
[0266] 在與Vl相似的反應中擴增Vh+Chi片段，只是用引物NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID NO: 17]和asCHl_SacI。擴增方案是98°C 30sec，30個循環(huán)的98°C 7sec，64°C 20sec，72°C 20sec，和 72°C 最終延伸 lOmin。
[0267] 直墜
[0268] 自制備瓊脂凝膠純化正確大小的產(chǎn)物。用Sfil和Cpol消化Vl，用SacI和Notl消化Vh +Chi。用這兩種酶組合分開消化接受載體pAK400 5404 FAb lch(自pAK400修飾，Krebber et al.，1997)，用FastAP使片段去磷酸化，并且自制備凝膠純化。
[0269] 用T4 DNA連接酶連接經(jīng)消化的11B6 VL和相應的載體片段，并且通過電穿孔轉(zhuǎn)化 入大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue細胞（Stratagene)中以生成載體pAK400-11B6-VL。經(jīng)Sacl+Notl消化的Vh+Chi和載體片段的連接產(chǎn)物稱作PAK400-11B6-VH+CH1。通過DNA測 序，并且將序列與初始蛋白質(zhì)序列和與數(shù)據(jù)庫(BLAST搜索）上找到的抗體比較確認正確的 克隆。
[0270]為了構(gòu)建完整的11B6 Fab，用Notl和SacI消化兩種先前生成的構(gòu)建體。使用載體 PAK400-11B6-VL作為插入來自載體pAK400-l 1B6-VH+CH1的Vh+Chi的接受載體。如上文那樣 完成連接和轉(zhuǎn)化。用限制酶分析確認構(gòu)建的PAK400 11B6 FAb lch載體。
[0271] 參考文獻
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[0278] 實施例2:11B6抗體的人源化
[0279] 使用⑶R嫁接方法人源化鼠抗hK2抗體11B6的可變域。在此方法中，將鼠抗體的互 補決定區(qū)(CDR)嫁接到可變重和輕域框架^另外，CDR區(qū)處的殘基，框架區(qū)處的某些至關重要 的位置中的殘基作為鼠樣保留，而不是轉(zhuǎn)變?yōu)槿藰?，以維持與其在親本鼠抗體中的構(gòu)象盡 可能相似的嫁接的CDR環(huán)的構(gòu)象。
[0280] 貫穿此描述使用Kabat編號方案(Kabat et al.，1991)。
[0281] 同源性建模
[0282] 通過使用自動網(wǎng)絡抗體建模服務器（VAM;http://an tibody.bath.ac.uk/ index.html)產(chǎn)生鼠11B6抗體的同源性模型。模型分別用于親本鼠抗體和作為可變域人源 化的框架使用的人免疫球蛋白序列之間不同的殘基的重要性的基于視覺檢查的評估。 [0283] 11B6人源化V-域序列的設計
[0284] Vl域設計
[0285] 使用ClustalW序列比對程序比較鼠11B6輕鏈可變域的氨基酸序列與NCBI中的人 免疫球蛋白種系序列的數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)11B6 VL與人種系序列B3(IGKV4-1*01)，ΛνΚ4家族的唯 一成員共享最高的相似性。關于編碼可變域序列的C端部分的J區(qū)段，發(fā)現(xiàn)人J K2與鼠11Β6的 相應區(qū)域是最相似的。
[0286] 使用人B3基因以及IGKJ2的序列作為框架以嫁接來自親本鼠抗體11B6的輕鏈的 CDR環(huán)（圖1)。在VL的位置4中引入鼠起源的殘基（亮氨酸）替換人樣甲硫氨酸。此微調(diào)區(qū) (Vernier zone) (Foote and Winter，1992)殘基直接位于輕鏈的⑶R1和⑶R3環(huán)下面。在 CDR-L2中的位置54處，使用人樣精氨酸替換鼠樣纈氨酸。依照建模，此位置處的殘基不可能 形成與抗原的直接相互作用，然而，Arg54似乎與人框架中的位置60處的帶負電荷的天冬氨 酸形成鹽橋。認為不可能的是，CDR-L1中的位置24處的殘基牽涉抗原接觸。因此，在此位置 處引入人樣賴氨酸替換鼠樣精氨酸。
[0287] VH域設計
[0288] 使用clustalW序列比對程序，比較鼠11B6重鏈可變域的氨基酸序列與NCBI中的人 免疫球蛋白種系序列的數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)11B6 VH與人VH4家族成員VH4-28具有最高的相似性。關 于編碼可變域序列的C端部分的J區(qū)段，發(fā)現(xiàn)人J H1與鼠11B6的相應區(qū)域是最相似的。
[0289] 使用人VH4-28基因以及JH1的序列作為框架以嫁接來自親本鼠抗體11B6的重鏈的 CDR環(huán)（圖1)。
[0290] 分別在VH的位置27和30處引入鼠樣殘基天冬酰胺和蘇氨酸。雖然不屬于依照 Kabat定義（Kabat et al.，1991;圖1)的CDR-H1，但通過一些其它CDR定義規(guī)程，諸如 Chothia(1989)的規(guī)程將它們分類為⑶R殘基。殘基27和30可以影響⑶R-H1的其它部分的結(jié) 構(gòu)，并且可能參與與抗原的直接接觸。已知第71位的殘基在維持CDR-H2的構(gòu)象中發(fā)揮重要 作用（Tramontane) et al.，1990)，并且本文使用鼠樣精氨酸替換人樣繳氨酸。在重要的 ⑶R-H3環(huán)前的第94位處，引入鼠11B6衍生的殘基蘇氨酸替換人VH4-28樣精氨酸。另外，認為 不可能的是CDR-H2中的第60位的殘基牽涉抗原接觸。因此，在此位置處引入人樣天冬酰胺 替換鼠樣絲氨酸。
[0291] 以合成構(gòu)建體購買編碼作為Fab片段的人源化11B6(其中設計的VH和Vd或分別與人 CH1和人CK恒定域連接）的基因（GensCript，US)。使用Sfil限制酶將基因克隆入自pAK400修 飾的表達載體pAK400Fab(Krebber et al.，1997)中，所述Sf Π 限制酶在Fab盒的任一側(cè)上 具有識別位點。將載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-1 blue細胞中以表達人源化Fab片段。
[0292] 圖1中顯示了本發(fā)明的例示性的人源化llB6Fab片段的重和輕鏈可變區(qū)的序列。
[0293] 參考文獻
[0294] Chothia,C.,Lesk,A.M.,Tramontano,A.,Levitt,Μ.,Smith-Gill,S.J.,Air,G., Sheriff,S.,Padlan,E.A.,Davies,D.,Tulip,ff.R.,Colman,P.M.,Spinelli,S.,Alzari, P.M.?and Poljak，R·J·(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions Nature?342?877-883
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[0298] 實施例3:hllB6的表達和純化
[0299] 將HEK293細胞擴充入Freestyle 293表達培養(yǎng)基（Life Technologies)中的2L懸 浮培養(yǎng)物中。在轉(zhuǎn)染當天，細胞密度是lxl〇6個細胞/ml。
[0300] 為了在哺乳動物細胞中表達而密碼子優(yōu)化編碼組分重或輕鏈（即分別為SEQ ID NO: 14和15)的核苷酸序列，將該核苷酸序列合成，并克隆至IgG表達載體。然后，混合含有重 和輕鏈的核苷酸序列的質(zhì)粒DNA (表達載體)與轉(zhuǎn)染劑，并且在RT中溫育10分鐘。在緩慢旋動 燒瓶的情況中將DNA-轉(zhuǎn)染劑-混合物緩慢添加至細胞培養(yǎng)物。然后，于37°C，8 % C02在以約 135rpm旋轉(zhuǎn)的定軌搖動器平臺上將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物溫育7天。
[0301] 通過離心收獲培養(yǎng)基，并且過濾流過5μπι、0 · 6μπι和0 · 22μπι濾器系統(tǒng)。
[0302] 通過蛋白G層析純化抗體，并且通過透析將緩沖液更換為PBS pH 7.4;隨后，通過 超濾濃縮抗體。
[0303] 通過吸光度測量濃度。
[0304] DNA:輕鏈：pllB6VLhVlhk(4300bp)量： 0.35mg
[0305] 重鏈：pllB6VHhVlhIgGl(4900bp)量： 0.6mg
[0306] 沒有優(yōu)化DNA量。
[0307]轉(zhuǎn)染劑:專有(然而，合適的商品化轉(zhuǎn)染劑是容易可獲得的，諸如Xfect?轉(zhuǎn)染試劑 (Clontech)、Lipofectamine(Life Technologies)、FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑（Promega)、 FreeStyle? Max Reagent(Invitrogen)、DEAE_右旋糖苷、聚乙稀亞胺和磷酸鈣）。
[0308] 總體產(chǎn)量：13.1mg(約 6.5mg/L)
[0309] 實施例4: hi 1B6的表征:親和力 [0310] 研究目的
[0311]研究的目的是通過在Biacore儀上使用表面等離振子共振（SPR)技術調(diào)查抗體 11B6的4種變體和抗原h(huán)K2之間的結(jié)合動力學。
[0312]為了調(diào)查蛋白質(zhì)樣品（抗體和抗原）的質(zhì)量，在SPR實驗前運行SDS-PAGE凝膠。
[0313] 在預研究中，調(diào)查不同參數(shù)以尋找適合于研究中的實驗的條件。
[0314] 在研究中，對4種抗體和抗原實施多次結(jié)合測量。自收集的數(shù)據(jù)，計算結(jié)合和解離 速率常數(shù)(b和km)和解離常數(shù)(KD)，并且在本文報告。
[0315] 試劑和儀器信息
[0316] 4種抗體和1種抗原的以下溶液由Diaprost AB提供：
[0317] · ml 1B6儲液：a-ehk211B614· 12013PP，3 · 41mg/ml:0 · 9%NaCl，100μΙ
[0318] · hllB6儲液：Innovagen批次90476.302013-04-12，lmg/ml:PBS pH 7·4,320μ1
[0319] · hllB6-DTPA儲液：0.2M乙酸鈉 pH 5.5,0.9mg/ml，340yl
[0320] · hi 1B6-DF0儲液：0 · 2M乙酸銨pH 5 · 5，1 · 6mg/ml 中的5mg/ml龍膽酸（gentisin acid)，400μ1
[0321] ?碰2儲液：26.6此/1111打&肚2打751^蛋白質(zhì)111115/2-021%85八
[0322] 將所有樣品等分取樣，并且在分析前在-20°C冷凍器中保持。
[0323] 在Biacore 3000儀上在CM4芯片上實施所有結(jié)合實驗。芯片和用于活化、固定化、 失活、結(jié)合和再生需要的所有試劑購自GE Healthcare，并且依照來自制造商的準則使用。
[0324] SDS-PAGE
[0325] (a)實驗的描述
[0326] 在來自Novex的TRIS-Tricine 10-20%丙烯酰胺凝膠上依照來自制造商的準則運 行由D i apr 〇 s t AB提供的試劑。
[0327] 與標準樣品一起在同一凝膠上同時運行蛋白質(zhì)樣品的兩種系列（天然的和還原 性)。
[0328] 天然系列中的每份樣品含有：1-1.3yg蛋白質(zhì)、TRIS緩沖液pH 8.8、SDS和加載緩沖 液。
[0329] 還原性系列中的每份樣品含有：1-1 · 3yg蛋白質(zhì)、TRIS緩沖液pH 8 · 8、SDS、加載緩 沖液和0.04 % v/v β2-巰基乙醇(還原劑）。
[0330] 在具有0.7、3.0、6.3的相應比例的乙酸、乙醇和水的Commasie亮藍溶液中實施凝 膠的染色。
[0331] 在具有0.7、3.0、6.3的相應比例的乙酸、乙醇和水的溶液中實施凝膠的脫色。
[0332] (b)結(jié)果和結(jié)論
[0333] 圖2中顯示了結(jié)果。
[0334]從這些結(jié)果看明顯的是，抗體和抗原樣品是高質(zhì)量和純度的。
[0335] 親和力研究
[0336] (a)CM4芯片上的抗原固定化
[0337] 依照制造商的準則實施芯片CM4-2的活化以使用EDC和NHS混合物進行胺偶聯(lián)。
[0338] 在芯片CM4-2上的通道fc2-4上流過含有2.96μg/ml抗原h(huán)K2的溶液（在10mM NaAc-緩沖液pH3.8中稀釋的hK2儲備溶液）以將抗原固定化至芯片。流速:5μ1/π?η，體積： 200μ1〇
[0339] 靶標RU彡Mw/10 Mw(hk2) = 25 900 Da 靶標RU(hk2)彡2590
[0340] 使用通道fcl作為空白。
[0341] 實現(xiàn)以下固定化：
[0342] fc2 = 1104RU fc3 = 731RU fc4 = 688RU
[0343] 在活化和固定化后通過乙醇胺封閉所有通道(fcl-4)。
[0344]這些數(shù)據(jù)證明了使用2.96μg/ml抗原實現(xiàn)了合適的固定化。
[0345] (b)結(jié)合階段的調(diào)查
[0346] 在芯片CM4-2上的通道fc2-4上以30μ1/π?η的速率流過每種抗體的5種不同濃度的 溶液(在HSP緩沖液中稀釋的儲備溶液)時追蹤4種抗體對芯片CM4-2的結(jié)合階段達4-5分 鐘。
[0347] 每種抗體的調(diào)查濃度是：100、50、25、12.5和6.25ηΜ。
[0348] 另外，自實驗獲得結(jié)合數(shù)據(jù)，其中追蹤解離過程達480分鐘。
[0349 ]總共，實施針對每種抗體的18個個別的結(jié)合實驗。
[0350]對于所有數(shù)據(jù)，扣除來自空白fc 1的信號。
[0351] 在圖3中，顯示了 5種不同濃度的每種抗體在芯片CM-2上的通道fc2中的結(jié)合階段。
[0352] 我們發(fā)現(xiàn)了在4-5分鐘后，我們能夠擬合關于結(jié)合過程的數(shù)據(jù)。
[0353] (c)調(diào)查解離階段
[0354] 在芯片CM4-2上的通道fc2-4上以30μ1/π?η的速率使50nM抗體的溶液流動5分鐘 后對每種抗體追蹤解離階段達480分鐘（圖4)。
[0355] 在計算解離速率常數(shù)中使用的所有數(shù)據(jù)中扣除來自空白fcl的信號。
[0356] 數(shù)據(jù)指示解離過程是非常緩慢的。對于所有4種抗體，通道fc4中的信號在漂移，并 且不能在該通道中追蹤解離過程。
[0357] (d)評估解離速率常數(shù)(1??)
[0358] 擬合解離階段數(shù)據(jù)，并且評估解離速率常數(shù)(??)(見表2)。
[0359] 表 2
[0360]
[0361] 基于對每種抗體采取的兩次測量，測試的抗體的解離速率常數(shù)(??)之間似乎沒 有顯著差異。
[0362] (e)評估結(jié)合速率常數(shù)(1?給）
[0363] 為了評估結(jié)合速率常數(shù)，在擬合方程中使用解離速率常數(shù)(表2)。
[0364] 使用所有擬合的數(shù)據(jù)以對每種抗體計算結(jié)合速率常數(shù)的平均數(shù)值和標準差(見表 3)〇
[0365] 表 3
[0367] 基于對每種抗體采取的15-18次測量，測試的抗體的結(jié)合速率常數(shù)(k結(jié)合)之間似乎
沒有顯著差異。
[0368] (f)評估解離常數(shù)(kD)
[0369] 表4中顯示了測試的抗體之每種的解離常數(shù)(Kd)。
[0370] 表 4
[0373] 對于所有4種抗體，解離常數(shù)(KD)在10-12Μ范圍中。
[0374] 雖然不是統(tǒng)計學顯著的，人源化抗體的解離常數(shù)似乎高于親本鼠抗體的解離常 數(shù)。
[0375] 由于對于hi 1B6-DTPA或hi 1B6-DF0，KD沒有顯著變化，人源化抗體的綴合似乎不顯 著影響親和力。
[0376] ra
[0377] ?對于所有4種抗體，結(jié)合過程是非?？焖俚模⑶一诿糠N抗體的15-18次實驗， 結(jié)合速率常數(shù)(b)都在ΙΟ^Γ 1 ?Γ1范圍中。
[0378] ?解離過程是非常緩慢的，并且?guī)缀踉贐iacore的技術限度的范圍中?；诿糠N抗 體的兩次實驗，解離速率常數(shù)(??)都在10- 5 ?Γ1范圍中。
[0379] ?對于所有4種抗體，解離常數(shù)(KD)在10-12Μ范圍中。
[0380] 實施例5: hi 1Β6的表征：聚集
[0381] 執(zhí)行摘要
[0382] 已經(jīng)對IgG的4種變體實施動態(tài)光散射(DLS)研究以研究其聚集的傾向。DLS結(jié)果顯 示了所有構(gòu)建體都具有合理的大小(200kDa或略高于200kDa，假設球形蛋白質(zhì)）和很少聚集 或無聚集。
[0383] JJ^I
[0384] 為了使用動態(tài)光散射就寡聚狀態(tài)而言表征4種IgG構(gòu)建體。使用胰島素作為對照。
[0385]
[0386] 動態(tài)光散射
[0387] 將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS pH 7.4)過濾流過0.22微米濾器。在PBS pH 7.4中將投遞 的蛋白質(zhì)稀釋至〇. lmg/ml。使用Malvern APS設備，于20°C在一式兩份樣品中測量動態(tài)光散 射。對每份樣品測量三次。使用稀釋緩沖液作為對照以確保合理地，緩沖液不含塵埃和聚集 體，圖1c?？梢允褂脭?shù)量分布函數(shù)可靠測量所有樣品。計算最豐富的種類的平均半徑及種類 的多分散性。還計算此種類的平均質(zhì)量分布，見表5。
[0388] 表 5
[0389] 自大小分布導出的動態(tài)光散射數(shù)據(jù)
[0391] 多分散性=半徑的標準差/平均半徑X 100%
[0392] 胰島素對照（4mg/ml 20mM Na2HP〇4，10mM Na3EDTA)具有2.8nm的平均半徑，其是約 37kDa。在溶液中，已知胰島素形成約35kDa的六聚體。對于具有完全球形形狀的蛋白質(zhì)， 5.7nm的半徑對應于約200kDa的分子量。對于具有完全球形形狀的蛋白質(zhì)，6. lnm的半徑對 應于約230kDa的分子量。合理地，這接近于150kDa的分子量(對于IgG分子），這意味著大多 數(shù)樣品主要由單體和/或二聚體IgG分子組成。不排除二聚體的原因是基于分子形狀，光散 射給出大致的大小估計，并且這使得難以分開單體和二聚體，但是容易分開較大的聚集體 與單體或者單體與六聚體(如在胰島素情況中一樣）。
[0393]
[0394] 動態(tài)光散射顯示了所有構(gòu)建體具有合理的大小和很少的聚集或無聚集。所有4種 構(gòu)建體的大小分布是重疊的(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0395] 實施例6:hllB6的表征:體內(nèi)生物分布
[0396] 此研究比較在與17111標記時的鼠11B6和人11B6的體內(nèi)生物分布。
[0397] 材料和方法
[0398] 材料
[0399] 177Lu購自Mallinkrodt Medical BV，佩滕(Petten)，荷蘭。
[0400] 自Sigma Aldrich獲得所有化學品，并且使用分析級水(除非另外記錄）內(nèi)部制備 緩沖液。
[0401]自芬蘭的土爾庫大學(University of Turku，F(xiàn)inland)獲得對人激肽釋放酶2特 異性的親本鼠抗體ml 1B6。
[0402] mllB6重鏈[SEQ ID N0:23]:
[0404] mllB6輕鏈[SEQIDN0:24]:
[0406] 如上文的實施例2和3中描述的那樣生成人源化對應物抗體hllB6(見圖1)。
[0407] 對于體內(nèi)研究，使用表達hK2(ATCC，Manassas，VA，USAWPDU145(ATCC，Manassas， VA，USA)的前列腺癌細胞系LNCaP。在補充有10%胎牛血清和PEST(青霉素 100IU/ml和100μ g/ml鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。于37 °C在具有5 % C02的濕潤培養(yǎng)箱中維持細 胞，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25 %胰蛋白酶，緩沖液中的0.02 % EDTA，Thermo Scientific)分離。在異種移植LNCaP細胞時使用來自BD-biosciences ( San-Jose， California，USA)的基質(zhì)膠基質(zhì)。用兩種細胞系接種NMRI_Nu(Charles River)和Balb/c-Nu (內(nèi)部品種)小鼠。
[0408]綴合和放射性標記
[0409] CHX-A" -DTPA與11B6的綴合:使用0 · 07M硼酸鈉緩沖液將PBS中的鼠和人源化11B6 單抗的溶液調(diào)節(jié)至pH 9.2,之后在Amicon Ultra-2離心濾器(2ml，100K)上濃縮。然后，以3: 1螯合劑與抗體的摩爾比率于4 0 °C綴合所得的蛋白質(zhì)溶液與螯合劑C Η X - A " - D T P A (Macrocyclics，USA)。在4h后終止反應，并且通過在用20ml 0.2M乙酸銨緩沖液，pH 5.5平 衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻層析使CHX-A"-DTPA-11B6(DTPA-11B6)與游離 的螯合物分開。用lml乙酸銨緩沖液洗脫綴合的11B6抗體。
[0410] DTPA-11B6的放射性標記:將乙酸銨緩沖液pH 5.5中的鼠和人源化DTPA-11B6與預 先確定量的mLuCl3混合。使用每名受試者0.5-0.6MBq的最終活性進行生物分布或者使用 每名受試者的18_20MBq的最終活性進行SPECT研究。在于室溫溫育2h后，終止標記，并且在 用PBS平衡的NAP-5柱上純化。
[0411] 動物研究
[0412]依照關于實驗室動物保護的國家立法實施所有動物實驗。
[0413] 對此研究使用雄性免疫缺陷裸鼠匪RI-Nu( 6-8周齡)和Balb/c-Nu。給所有小鼠在 其左或右體側(cè)上異種移植LNCaP細胞或DU145，100yl生長培養(yǎng)基和100μ1基質(zhì)膠中的800-1000萬個細胞。
[0414] 生物分布研究
[0415] 對hi 1Β6和ml 1Β6兩者實施生物分布研究。
[0416] 給6組（n = 4)小鼠靜脈內(nèi)注射20yg hllB6或2(^8用1771^1標記的mllB6。在24h p. i .、48h p. i和72h p. i .時處死動物，并且用具有3-英寸Nal (T1)檢測器的自動Nal(T1)孔 計數(shù)器（1480 WIZARD，Wallac 0y，Turku，F(xiàn)inland)分析感興趣的器官。
[0417] 如下計算組織攝取數(shù)值，其以每克組織的百分比注射劑量（％IA/g)表示：％IA/g =(組織放射性/注射放射性)/器官重量X 100
[0418] 其中對于iV注射：
[0419] 注射放射性=對照注射器中的平均放射性-用過的注射器中的放射性-尾部中的 放射性
[0420] 還在解剖后對器官稱重。
[0421] 動力學數(shù)據(jù)
[0422] DThe時間_%ID曲線直至48為止以直線ID(t)=k*t+例表示?；趤碜缘诙偷谌?時間點（分別為48和72h)的數(shù)據(jù)，對時間間隔[48，m]應用單指數(shù)曲線（ID(t) = ID(0)e4t)。 然而，如果λ變?yōu)樨撝?，即ID在48和72h之間在增加，則取而代之以直線對此時間間隔中的時 間ID曲線建模，并且假設從72小時起在器官中保留藥物。為了獲得時間-活性曲線，應用物 理半衰期。
[0423] 注意:在一些圖中，ID稱作"IA" ；這些表述在本文中可互換使用。
[0424] 結(jié)果
[0425] 人源化mLu_llB6的生物分布
[0426] 圖5中顯示TmLu-hllB6的生物分布。
[0427] 抗體在到24小時內(nèi)在LNCaP腫瘤中快速積累，并且發(fā)現(xiàn)在72小時時仍然較高。
[0428] 最初，高水平的hllB6在血液和腎中也是明顯的，其在隨后的48小時時段里降低， 因為自身體除去抗體。此類生物動力學是任何經(jīng)放射性標記的抗體的靜脈內(nèi)注射的不可避 免且預期的結(jié)果。
[0429] 所有其它器官(諸如骨和肌肉）顯示低水平的放射性。
[0430]這些數(shù)據(jù)證明7mLu-hllB6能在體內(nèi)有效靶向前列腺癌細胞。
[0431] 圖6顯示了 一幅例示性的SPECT圖像，其中mLu-h 11B6對經(jīng)異種移植的小鼠內(nèi)的 LNCaP腫瘤細胞的結(jié)合是完全明顯的。
[0432] mLu_hl 1B6展現(xiàn)出好得意料不到的治療比率。
[0433] 關于人源化mLu-llB6的生物分布數(shù)據(jù)與關于親本鼠抗體(mLu-mllB6)的生物分 布數(shù)據(jù)的比較揭示了意料不到的且有利的差異。
[0434] 如圖7中顯示的，與mLu-mllB6相比，mLu-hllB6對LNCaP腫瘤中的攝取在注射后 72小時升高約20%。伴隨地，與 mLu-mllB6相比，mLu-hllB6對健康骨中的攝取在注射后72 小時降低約40 %。
[0435] 圖8顯示了在注射后24、48和72小時時以腫瘤對健康骨中的抗體攝取的比率表示 的數(shù)據(jù)。到72小時，此比率對于人源化11B6抗體是明顯增加的。
[0436] 劑量測定法計算
[0437] 吸收的劑量的計算提供本發(fā)明的人源化抗體的動力學相對于親本鼠11B6抗體的 動力學的差異的更尖端的測量。
[0438] 依照MIRD-圖式與計算吸收的劑量，其中A是來源器官 中的衰變的總數(shù)，并且S是每個衰變單位的吸收劑量（見Bolch et al.，2009， J. Nuc 1.Med. 50:477-484，通過提及將其公開內(nèi)容收入本文）。以時間-活性曲線里的時間積 分計算A 因子基于使用Moby幻圖（Moby-phantom)的小鼠特異性蒙特卡洛模擬（見 Larsson et al.，2011，Acta Oncol.50:973-980和Keenan et al.，2010，J.Nucl.Med.50: 471-476)。為了得到總吸收劑量，認為所有器官是來源-或靶來源。
[0439] 表6中顯示了不同組織的計算的吸收劑量數(shù)值。
[0440] 表 6
[0443] 如可以在表6中看出的，腫瘤吸收劑量自1.21Gy/MBq(對于mllB6)增加至2.2Gy/ 1^9(對于111186)，8卩80%的增加。腫瘤與骨髓吸收劑量的比率自3.9(對于1111186)增加至5.6 (對于hllB6)，約40%。在本文中，顯示了與mllB6相比hllB6的增強的治療效力，并且指示可 以在較小的正常器官毒性的情況中給出對腫瘤的較高的吸收劑量。
[0444] 抗體自血液的清除
[0445] 圖10中顯示了人源化和鼠 11B6抗體的血液水平分析。
[0446] 結(jié)果提示了可以比鼠11B6抗體略快自血液清除hllB6。若這樣的話，人源化抗體的 此類增強的清除速率從安全性前景看也可以是治療益處的，這潛在容許施用較高的活性。
[0447] 增強的清除速率對于內(nèi)部成像也可以是有益的。
[0448] 莖遂
[0449] 本研究的結(jié)果證明以下內(nèi)容：
[0450] ?人源化11B6抗體1T7Lu-hllB6在體內(nèi)有效靶向前列腺腫瘤；
[0451] ?人源化11B6抗體比其親本鼠抗體展現(xiàn)出好得意料不到的治療比率(如通過腫瘤 中的攝取與健康骨中的攝取的比率測定的）；以及
[0452] ?可以比鼠 11B6抗體略快地自血液清除人源化11B6抗體。
[0453]總之，這些發(fā)現(xiàn)提供了人源化11B6抗體在治療(和診斷)前列腺癌中的增強的治療 效力的引人注目的證據(jù)。
[0454]由于人源化和鼠抗體靶向相同抗原（即人激肽釋放酶2)，不能容易地預測或解釋 腫瘤與健康骨髓中的更新比率的計算差異(特別是考慮到與親本鼠抗體相比，人源化抗體 似乎展現(xiàn)出更低的對靶hK2抗原的親和力;見實施例4)。
[0455]由于此比較提供了治療比率的測量，人源化和鼠11B6抗體之間與健康骨相比腫瘤 中的相對攝取的差異是相當重要的。此比率的較高數(shù)值(如對于人源化11B6抗體明顯的）指 示較好的治療抗體。特別地，較高的治療比率意味著可以施用較高吸收劑量的經(jīng)治療放射 性標記的hllB6以實現(xiàn)較好的治療效果（因為人源化抗體對健康組織和器官的結(jié)合比對于 鼠抗體低得多）。較高的比率還指示對于診斷目的，hllB6會好于鼠抗體(因為它等于較低的 信噪比，容許較小的腫瘤，包括轉(zhuǎn)移的成像）。
[0456]總之，數(shù)據(jù)證明了 11B6抗體的人源化給出了早期診斷的增強的可能性和治療前列 腺癌中高得意料不到的治療效力。
[0457] 實施例7:證明診斷和治療效力
[0458] 本研究的目的是確認11B6( -種特異性靶向hK2的催化裂縫內(nèi)部的表位的單抗)作 為媒介物以將高度毒性的放射性核素特異性投遞至前列腺癌生長的部位的效用。在概念研 究的此證據(jù)中，我們用 177!^!(-種也采用γ發(fā)射的低能量β顆粒)標記親本鼠11B6抗體，使得 能夠?qū)嵤㏒PECT成像。
[0459] 材料和方法
[0460] 材料
[0461] 177Lu購自Mallinkrodt Medical BV，佩滕，荷蘭。使用Cyclone? Storage Phosphor System和OptiQuant?圖像分析軟件（Perkin Elmer，Weilesley，ΜΑ，USA)測量 ITLC(快速薄層層析)條(Bi〇dex，US)上的放射性以測定標記動力學和放射性化學純度。自 Sigma Aldrich獲得所有化學品，并且使用分析級水(若沒有另外記錄的話）內(nèi)部制備緩沖 液。單抗11B6是一種對人激肽釋放酶2特異性且具有約1.2nM的對此抗原的親和力的抗體； 參見圖1(獲自芬蘭的土爾庫大學）。對于體內(nèi)研究，使用表達hK2的前列腺癌細胞系LNCaP (ATCC，Manassas，VA，USA)。在補充有10%胎牛血清和PEST(青霉素 100IU/ml和100μg/ml鏈 霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。于37°C在具有5%⑶2的濕潤培養(yǎng)箱中維持細胞，并 且用胰蛋白酶-EDTA溶液（0 · 25 %胰蛋白酶，緩沖液中的0 · 02 %EDTA，Thermo Scientif ic) 分離。
[0462] 綴合和放射性標記
[0463] 綴合CHX-A" -DTPA與11B6:使用0.07M硼酸鈉緩沖液將roS中的單抗11B6的溶液調(diào) 節(jié)至pH9.2。在Amicon Ultra-2離心濾器(2ml，100K)上濃縮樣品。以3:1螯合劑與抗體的摩 爾比率于40°C綴合蛋白質(zhì)溶液與螯合劑〇^4"-0了?4(1&1(^^(31化8，1^)。在411后終止反 應，并且通過在用20ml 0.2M乙酸銨緩沖液，pH 5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大 小排阻層析使CHX-A" -DTPA-11B6 (從現(xiàn)在起稱作DTPA-11B6)與游離的螯合物分開。用lml乙 酸銨緩沖液洗脫綴合的11B6和5A10。
[0464] DTPA-11B6的放射性標記:混合乙酸銨緩沖液pH 5.5中的DTPA-11B6與預先確定量 的17111(：13。在于室溫溫育2h后，終止標記，并且在用roS平衡的NAP-5柱上純化。用ITLC條監(jiān) 測標記效率和標記動力學，用0.2M檸檬酸洗脫。在此系統(tǒng)中，放射性標記的綴合物保持于原 點線，而游離的Lu-177在溶劑前面的情況中迀移。使用Optiquant作為量化軟件（Perkin Elmer，Wei les ley，MA，USA)，用Phosphor Imager系統(tǒng)（Perkin Elmer，Wei les ley，MA，USA)測 定放射性分布。
[0465] 動物研究
[0466] 依照關于實驗室動物保護的國家立法實施所有動物實驗。動物研究已經(jīng)得到地方 動物研究倫理委員會批準。使用購自Taconic Europe(Bomholt，Denmark)的雄性免疫缺陷 裸鼠 NMRI (6-8周齡)進行此研究。
[0467] 在右體側(cè)和/或左體側(cè)中以每次注射約10*106個細胞皮下植入hK2表達性LNCaP前 列腺癌細胞的異種移植物。
[0468] 將形成LNCaP腫瘤的動物分成組，并且注射治療劑mLu-DTP_l 1B6或?qū)φ眨娤挛?表7:
[0469] 表 7
[0472] 連續(xù)測量包括的所有動物，并且在3-4天的時間間隔內(nèi)稱重。
[0473] 最初，一些動物得到較低活性(8MBqW^mLu-DTPA_llB6以使用SPECT調(diào)查治療劑 的定位。也用SPECT研究來自組8的1只小鼠。這些動物已經(jīng)被除去其器官，并且使用具有3英 寸似1(1'1)檢測器的自動恥1(11)孔計數(shù)器（14801124^)，'^113(3〇7，1\^1〇1^丨111311(1)量化 這些組織樣品中的放射性。
[0474] 為了研究對骨髓的影響，定期采集血液樣品（10yL)。在注射后一周兩次收集血液 樣品達8周，并且在Medonic Cell Analyzer-Vet CA530Vet(Boule Medical，Stockholm， Sweden)中分析WBC計數(shù)、RBC計數(shù)、和血小板計數(shù)。在血液取樣時，監(jiān)測動物的重量和身體狀 況。通過對動物監(jiān)測體重減輕、一般狀況的下降、和血液學毒性評估毒性。
[0475] 用測徑器測量腫瘤體積。測量長度1、寬度w和厚度t，并且計算體積。
[0476] 療法計劃
[0477] 基于經(jīng)歷用90Y和177LU的放射性免疫療法的大鼠中吸收劑量和對骨髓的生物學 影響之間的關系（見Larsson et al ·，2012，Med · Phys · 39(7): 4434-43)，可以評估骨髓的 LD50會為12Gy等級。在文獻中，關于大鼠和小鼠的短期照射的LD50是相同的，約9Gy (例如見 Radiobiology for the radiologist，Hall&Giacca(編），2006,第6版）〇 [0478]然后，自對骨髓的可耐受吸收劑量12Gy的假設設計療法。然后，自劑量測定法計 算，計算與此吸收劑量對應的活性。
[0479] 對對照使用相應的劑量/活性。
[0480] 莖里
[0481 ]動物腫瘤收縮
[0482]圖11顯示了小鼠之一中的腫瘤(在動物的體側(cè)上可見，在皮膚下）在處理后如何在 體積上縮小。
[0483]放射性免疫療法結(jié)果
[0484] 圖12顯示了在施用的活性(a)D、（b)2x D和(c)對照組(其中D = 26.7MBq)的情況中 研究組的結(jié)果。
[0485] 這兩種處理組中有腫瘤體積縮小的清楚趨勢。在注射177Lu-mllB6后幾天已經(jīng)看 到腫瘤收縮的開始。在對照組中，在注射Nal溶液后有腫瘤體積的增加。
[0486] 圖13(a)顯示了用活性A注射的組中的小鼠之一的結(jié)果。這里，在施用活性A的 177Lu-mllB6時，腫瘤從第1天到第6天穩(wěn)定生長。在處理后，觀察到腫瘤體積的快速下降。
[0487] 在SPECT研究(8dpi)中，在仍存在活性的情況中顯示了腫瘤體積;見圖13(b)。
[0488] 莖造
[0489] 用例示性抗體177Lu-mllB6的本研究清楚證明了針對前列腺癌腫瘤的hK2靶向性 抗體的體內(nèi)治療效力。
[0490] 實施例8:例示性的經(jīng)mLu標記的本發(fā)明的人源化11B6抗體在前列腺癌異種移植 物中的治療效力
[0491 ] 材料和方法
[0492]抗體、綴合和放射性標記
[0493] 抗體:例示性的人源化單克隆抗體11B6(IgG 1 /κ，在HEK 293細胞中瞬時表達）（其 包含依照SEQIDN0:12的重鏈和依照SEQIDN0:13的輕鏈）由InnovagenAB，Lund提供(在 PBS pH 7.4中的lmg/ml，批次No. 90476.30)。利用非特異性IgG抗體作為同種型對照（來自 小鼠血清的IgG抗體，Sigma 1-8765)。
[0494] 綴合：如下綴合例示性的h 11B6非特異性I gG對照抗體與螯合劑CHX- A" -DTPA (1&(^〇〇5^1;^8，1]34):在4111；[(30111]11:抑-2離心濾器(21]11^，1001〇上濃縮抗體溶液，隨后使用 0.07M硼酸鈉緩沖液(Sigma Aldrich)調(diào)節(jié)至pH 9.2。
[0495] 與先前描述的方法(見Almqvist et al)類似地實施以約3:1(螯合劑與抗體)的摩 爾比率偶聯(lián)螯合劑化合物CHX-A"-DTPA與蛋白質(zhì)溶液?？梢酝ㄟ^分光光度法(Pippin et al)測定偶聯(lián)效率，即每個抗體獲得的螯合劑的數(shù)目，但是在本研究中沒有分析。然而，優(yōu)選 地，偶聯(lián)應當不超過3個螯合劑/抗體，以避免對蛋白質(zhì)的損傷。對蛋白質(zhì)添加螯合劑，并且 在于40 °C溫和搖動的情況中溫育溶液。
[0496] 在4h后終止反應，并且通過在用20ml 0.2M乙酸銨緩沖液（Sigma Aldrich)，pH 5·5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻層析將CHX-A"-DTPA-hllB6(稱為DTPA- hllB6)與游離的螯合物分開。用lml乙酸銨緩沖液洗脫綴合的hllB6,并且于-20°C貯存等分 取樣的樣品。
[0497] 以與上文類似的方式控制IgG對照抗體的綴合。
[0498] 放射性標記:混合綴合的hi 1B6或IgG對照抗體(通常為200-300yL在0.2M乙酸鈉緩 沖液pH 5.5中的約1μg/μL)與預先確定量（約200-300MBqW^mLuCl3(IDB Holland)，并且 于室溫溫育1.5-2h。在溫育后，終止標記，并且在用PBS(Thermo Scientific)平衡的NAP-5 柱(GE Healthcare)上純化。用快速薄層層析(Biodex，USA)監(jiān)測標記效率，用0.2M梓檬酸 (Sigma Aldrich)洗脫。在此系統(tǒng)中，放射性標記的綴合物保持于原點線，而游離的mLu在 溶劑前面的情況中迀移。使用Optiquant作為量化軟件用Cyclone Storage Phosphor System(都來自Perkin Elmer)測定放射性分布。
[0499] 以與上文相似的方式實施IgG對照抗體的放射性標記。
[0500] 療法研究
[0501 ]細胞系:LNCaP(hK2+)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。在補充有10 %胎牛血 清（Thermo Scientific)及青霉素 100IU/mL和100yg/mL鏈霉素 （Thermo Scientific)的 RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo Scientific)中培養(yǎng)細胞。于37°C在濕潤的培養(yǎng)箱中于5%C〇2維 持細胞，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermo Scientific)分離。
[0502]遵照關于實驗室動物保護的國家立法，并且在動物研究倫理委員會（Lund University，Sweden)批準的情況中進行所有動物研究。使用內(nèi)部育種的雄性免疫缺陷 Balb/c裸鼠（6-8周齡）。通過在100yL生長培養(yǎng)基和100yL基質(zhì)膠(K) Matrigel?基底膜基質(zhì) 生長因子還原性（Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced)，無酸紅，產(chǎn)品目 錄編號356231)中的s . c.注射(800-1000萬個細胞)給小鼠在其右體側(cè)上異種移植LNCaP細 胞。研究中包括具有建立的腫瘤的小鼠，并且分成下文在表8中描述的三組，所述建立的腫 瘤具有至少約3mm的直徑。在尾靜脈中i . v.注射動物。選擇20MBq活性水平，因為已經(jīng)在用 mllB6的研究中使用在此量的劑量，顯示了良好的治療效果(見實施例7)。
[0503] 表8 :包括三組動物：注射mLu-hl 1B6的一組、注射mLu非特異性單抗（以顯示 hllB6的特異性）的一組、和注射NaCl(作為對照組）的一組。
[0505] 通過使用測徑器重復測量腫瘤大小評估治療效力。通過測量腫瘤的長度(L)和寬 度(W)，然后以0.5XLXWX W計算體積V計算腫瘤體積。
[0506] 還有，對所有動物重復采取血液學（白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板數(shù)目和血紅 蛋白計數(shù))和重量測量以鑒定任何潛在血液學毒性，并且監(jiān)測動物的一般狀況。在評估放射 性免疫療法時監(jiān)測血液學毒性是尤其重要的，因為放射性會在血液中分布，并且最終達到 血液干細胞定位的骨髓。
[0507]依照倫理準則終止小鼠，所述小鼠形成超出14mm的腫瘤長度/寬度，或與初始重量 相比超出15%的重量減輕，或者在其它情況中具有受負面影響的一般狀況，或者具有所有 這三項參數(shù)的組合。
[0508] 莖里
[0509]治療效力的評估
[0510]如圖14(a)中顯示的，施用本發(fā)明的例示性的人源化11B6抗體(mLu-hllB6)阻止 小鼠中的腫瘤生長(并且在除了一只外的所有測試動物中導致腫瘤體積的顯著降低）。比較 而言，腫瘤在用IgG對照抗體(見圖14b)或NaCl(見圖14c)處理的小鼠中繼續(xù)快速生長。
[0511] 在圖15中以Kaplan-Meier曲線形式匯總了圖14中顯示的來自個別動物的數(shù)據(jù)。 mLu-hllB6的施用在實驗期里產(chǎn)生小鼠存活率的顯著增加，超過80%的動物在注射后60天 實驗終止時仍然活著(與兩個對照組中的0%存活相比）。
[0512] 血液學毒性的評估
[0513] 白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板數(shù)目、血紅蛋白計數(shù)和重量的評估沒有揭示施 用1771^-1!1186的任何毒性效應(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0514] 過造
[0515] 本研究的結(jié)果揭示了 mLu_hllB6處理在前列腺癌異種移植物模型中的顯著治療 效果。
[0516] 對小鼠施用的活性(20MBq)對應于約10Gy的對骨髓的吸收劑量，其是由這些動物 完全耐受的。甚至在20MBq的此低活性，觀察到較大的治療效果。如較早評估的，可以預期至 少60Gy的腫瘤吸收劑量。
[0517] 沒有觀察到血液學毒性的指示。
[0518] 參考文獻
[0519] Almqvist Y.，et al. In vitro and in vivo characterization of 177Lu_ huA33:a radio-immunoconjugate against colorectal cancer.Nucl Med Biol·2006;33 :991-998.
[0520] Pippin CG et al.Spectrophotometric method for the determination of a bifunctional DTPA ligand in DTPA-monoclonal antibody conjugates. Bioconjug Chem.1992;3:342-5.
[0521 ]實施例9:放射性核素療法劑量測定法計劃和治療患者中的前列腺癌 [0522]對于放射性核素療法(RNT)，整體分布放射源，并且通常以放射性藥物系統(tǒng)性施用 放射性。放射性分布取決于隨時間在不同組織中積累的放射性藥物的量，其有時在患者間 變化(1)。
[0523] RNT處理應當基于規(guī)定的吸收劑量(2)。然后，首先應當使用示蹤劑量的放射性藥 物實施療法前研究，并且確定腫瘤和器官吸收劑量。通常，此信息以描述每單位施用活性的 器官吸收劑量的因素表示，以mGy/MBq為單位;D pT(器官）。
[0524] 若然后在相似的條件下給出治療性施用，則可以使用此因素來確定需要施用以將 規(guī)定的吸收劑量投遞至給定器官、組織或腫瘤的活性(4,6)。
[0525] 在用經(jīng)放射性標記的hllB6抗體的前列腺癌治療的情況中，療法前研究應當基于 用mIn-hllB6的 mIn成像。當然后177!^!要是治療性放射性核素時，mIn最適合于定量(平 面/SPECT)成像。當然后測定D PT (器官）時，可以給予療法，其中療法活性At給出規(guī)定療法效 果。在療法期間，應當基于成像計算活性分布和相應的劑量比率以得到對于評估治療必需 的對腫瘤和正常器官給予的實際療法吸收劑量。
[0526] 在由于治療計劃而達到骨髓毒性水平的療法的情況中，則骨髓支持物是必需的， 并且基于骨髓腔的劑量測定法計算，必須測定用于再輸注干細胞的時間。
[0527] 總之，應當相應地計劃以下治療方案：
[0528]療法前劑量測定法研究
[0529] 1.經(jīng)mIn 標記的 hllB6(200_300MBq)注射
[0530] 2.血液取樣-第一周測定的血液和血漿中的活性濃度。
[0531] 3·在1周里成像(SPECT/平面）（7次）
[0532] 4.基于LundaDose方案(3)的器官劑量測定法
[0533] 5.測定的療法活性，其以對放射敏感性器官，如骨髓（2_3Gy)、腎（20_30Gy)和肝 (12-36Gy)的規(guī)定吸收劑量限制。
[0534]包括療法內(nèi)劑量測定法的療法
[0535] 1.施用的gmLU標記的hllB6(基于療法前劑量測定法）
[0536] 2.血液取樣-血液和血漿中的活性濃度
[0537] 3.在1周里成像(6次）
[0538] 4.器官劑量測定法= > 確認規(guī)定的療法吸收劑量。
[0539] 關于劑量測定法的具體評述
[0540]累積的活性是在一段時間里在給定區(qū)域中發(fā)生的衰變的數(shù)目。單位是Bq s或Bq h。當離子化放射行進通過物質(zhì)時，它相互作用并沉積能量。賦予的能量是給定體積中的所 有能量沉積物的總和。吸收劑量是賦予的均值能量和體積質(zhì)量的比率。吸收劑量的單位是 格雷(6瓜7)(67)，167等于1]/1^。
[0541]自不同時間時組織中的活性數(shù)值，通過積分測定累積的活性，并且可以測定均值 吸收劑量。使用平面成像做出活性測量以進行全器官劑量測定法。定量SPECT/CT容許使用 基于體元的方法的較小體積中的劑量測定法。
[0542]自活性濃度數(shù)值的3D分布，可以使用所謂的點劑量核或體元S值（其描述位于水 (或骨）中的點源周圍的能量沉積樣式)計算吸收的劑量比率分布。此方法假設解剖學區(qū)域 就密度而言是同質(zhì)的，諸如軀干內(nèi)的軟組織。對于密度為異質(zhì)的身體區(qū)域，如在肺中，直接 的蒙特卡洛計算是優(yōu)選的。這里，使用來自SPECT或PET的活性分布作為蒙特卡洛劑量計算 代碼的輸入。
[0543] 參考文獻
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【主權項】
1. 一種對人激肽釋放酶-2(hK2)具有結(jié)合特異性的抗體多肽，其中所述抗體多肽包含： (a) 包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和/ 或 (b) 包含SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)， 且其中所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包含來自一種或多種人抗體的框架氨基酸序列。2. 依照權利要求1的抗體多肽，其中與鼠11B6抗體相比，所述抗體多肽展現(xiàn)出增強的治 療比率。3. 依照權利要求1或2的抗體多肽，其包含完整抗體或由完整抗體組成。4. 依照權利要求1至3中任一項的抗體多肽，其包含抗原結(jié)合片段或由抗原結(jié)合片段組 成，所述抗原結(jié)合片段選自下組:Fv片段(例如單鏈Fv和成二硫鍵的Fv)、Fab樣片段(例如 Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)和域抗體(例如單一 Vh可變域或Vl可變域）。5. 依照權利要求4的抗體多肽，其中所述抗原結(jié)合片段是scFv。6. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述框架包含來自人免疫球蛋白VH4 基因家族的序列。7. 依照權利要求6的抗體多肽，其中所述框架序列來自VH4-28種系序列。8. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述重鏈可變區(qū)和/或所述輕鏈可變 區(qū)的框架序列是非天然存在的。9. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列組成。10. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列組成。11. 依照權利要求9或10的抗體多肽，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變 區(qū)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列組成，所述輕鏈可變區(qū)包 含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列組成。12. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其進一步包含重鏈恒定區(qū)或其部分。13. 依照權利要求12的抗體多肽，其中所述重鏈恒定區(qū)是選自下組的免疫球蛋白亞型 的：1861、以62、1 863和1864。14. 依照權利要求12的抗體多肽，其中所述重鏈恒定區(qū)是免疫球蛋白亞型IgGl的。15. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含重鏈恒定區(qū)或其部分，所述重鏈恒 定區(qū)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 10的氨基酸序列組成。16. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其進一步包含輕鏈恒定區(qū)或其部分。17. 依照權利要求16的抗體多肽，其中所述輕鏈恒定區(qū)是κ或λ輕鏈的。18. 依照權利要求17的抗體多肽，其中所述輕鏈恒定區(qū)是κ輕鏈的。19. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含輕鏈恒定區(qū)或其部分，所述輕鏈恒 定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列組成。20. 依照權利要求18或19的抗體多肽，其包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定 區(qū)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 10的氨基酸序列組成，所述輕鏈恒定區(qū) 包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列組成。21. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含重鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列組成。22. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列組成。23. 依照權利要求21或22的抗體多肽，其包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列組成，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 13的氨基酸 序列或由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列組成。24. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述抗體多肽與治療性模塊直接或 間接連接。25. 依照權利要求24的抗體多肽，其中所述治療性模塊是細胞毒性模塊，所述細胞毒性 模塊包含一種或多種放射性同位素或由一種或多種放射性同位素組成。26. 依照權利要求25的抗體多肽，其中所述一種或多種中的每一種放射性同位素獨立 選自下組:β-發(fā)射體、俄歇(auger)_發(fā)射體、轉(zhuǎn)換電子-發(fā)射體、α-發(fā)射體、和低光子能量-發(fā) 射體。27. 依照權利要求26的抗體多肽，其中所述一種或多種中的每一種放射性同位素獨立 具有在藥劑附近創(chuàng)建高劑量吸收的局部吸收能量的發(fā)射樣式。28. 依照權利要求26或27的抗體多肽，其中所述一種或多種中的每一種放射性同位素 獨立選自下組：長程β-發(fā)射體，諸如9QY、 32P、186Re/186Re; 166Ho、76As/77As、153Sm;中程β-發(fā)射 體，諸如 1311、1771^、67〇!、161113;低能量|3-發(fā)射體，諸如 4^、355或14(：;轉(zhuǎn)換或俄歇-發(fā)射體，諸29. 依照權利要求28的抗體多肽，其中所述放射性同位素是mLu。30. 依照權利要求24的抗體多肽，其中所述治療性模塊是細胞毒性模塊，所述細胞毒性 模塊包含一種或多種細胞毒性藥物或由一種或多種細胞毒性藥物組成。31. 依照權利要求30的抗體多肽，其中所述一種或多種中的每一種治療性模塊獨立選 自下組:細胞抑制性藥物;抗雄激素藥物;可的松及其衍生物;膦酸鹽/酯;睪酮-5-α-還原酶 抑制劑;硼附加物;細胞因子;毒胡蘿卜素(thapsigargin)及其代謝物;毒素(諸如皂草素或 加利車霉素）；化學治療劑(諸如抗代謝物）；或可用于治療前列腺癌的任何其它細胞毒性藥 物。32. 依照權利要求24的抗體多肽，其中所述治療性模塊包含一種或多種適合于在活化 療法中使用的模塊或者由一種或多種適合于在活化療法中使用的模塊組成，所述活化療法 諸如光子活化療法、中子活化療法、中子誘導的俄歇電子療法、同步加速器照射療法、或低 能量X-射線光子活化療法。33. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述抗體多肽進一步包含可檢測模 塊。34. 依照權利要求33的抗體多肽，其中所述可檢測模塊包含放射性同位素或由放射性 同位素組成。35. 依照權利要求34的抗體多肽，其中所述放射性同位素選自下組：99mTc、mIn、 67Ga、 68Ga、72As、89Zr、 123_2()1Tl。36. 依照權利要求34的抗體多肽，其中所述放射性同位素是89Zr。37. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述抗體多肽包含一對可檢測且細 胞毒性的放射性核素，諸如86Y/9°Y或124I/211At。38. 依照權利要求37的抗體多肽，其中所述放射性同位素能夠作為可檢測模塊及還作 為細胞毒性模塊以多模式方式同時起作用。39. 依照權利要求33的抗體多肽，其中所述可檢測模塊包含順磁性同位素或由順磁性 同位素組成。40. 依照權利要求34的抗體多肽，其中所述順磁性同位素選自下組：157Gd、55Mn、 162Dy、 52Cr 和 56Fe。41. 依照權利要求33至40中任一項的抗體多肽，其中所述可檢測模塊是通過成像技術， 諸如SPECT、PET、MRI、光學或超聲成像可檢測的。42. 依照權利要求24至41中任一項的抗體多肽，其中所述治療性模塊和/或可檢測模塊 經(jīng)由連接模塊與抗體多肽間接連接。43. 依照權利要求34的抗體多肽，其中所述連接模塊是螯合劑。44. 依照權利要求34的抗體多肽，其中所述螯合劑選自下組：1，4,7,10-四氮雜環(huán)十二 烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)的衍生物、去鐵胺(DFO)、二乙撐三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、 S-2-(4-異硫氰酸根芐基)-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸(ΝΟΤΑ)的衍生物和1，4，8， 11-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,8，11-四乙酸(ΤΕΤΑ)的衍生物。45. 依照前述權利要求中任一項的抗體多肽，其中所述抗體多肽進一步包含用于延長 藥劑的體內(nèi)半衰期的模塊。46. 依照權利要求45的抗體多肽，其中所述用于延長體內(nèi)半衰期的模塊選自下組:聚乙 二醇(PEG)、人血清清蛋白、糖基化基團、脂肪酸和右旋糖苷。47. -種分離的核酸分子，其編碼依照前述權利要求中任一項的抗體多肽或其組分多 肽鏈。48. 依照權利要求47的核酸分子，其中所述分子是cDNA分子。49. 依照權利要求47或48的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 14和/或SEQ ID NO: 15的核苷 酸序列。50. -種載體，其包含依照權利要求47至49中任一項的核酸分子。51. 依照權利要求50的載體，其中所述載體是表達載體。52. -種重組宿主細胞，其包含依照權利要求47至49中任一項的核酸分子或依照權利 要求50或51的載體。53. 依照權利要求52的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞。54. 依照權利要求52的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。55. 依照權利要求54的宿主細胞，其中所述宿主細胞是人細胞。56. -種用于生成依照權利要求1至46中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段的方法，所述方 法包括在容許編碼的抗體或其抗原結(jié)合片段表達的條件下培養(yǎng)如權利要求52至55中任一 項限定的宿主細胞。57. -種藥物組合物，其包含依照權利要求1至46中任一項的抗體多肽和藥學可接受賦 形劑、稀釋劑或載劑。58. 依照權利要求57的藥物組合物，其適合于胃腸外施用。59. -種試劑盒，其包含依照權利要求57或58的藥物組合物。60. 依照權利要求1至46中任一項的抗體多肽，其在藥物中使用。61. 依照權利要求1至46中任一項的抗體多肽，其在治療和/或診斷前列腺癌中使用。62. 依照權利要求61的抗體多肽，其中要治療的前列腺癌是非局限性（即播散性)前列 腺癌。63. 依照權利要求62的抗體多肽，其中要治療的前列腺癌是轉(zhuǎn)移性前列腺癌，任選微轉(zhuǎn) 移性前列腺癌。64. 依照權利要求63的抗體多肽，其中要治療的轉(zhuǎn)移性前列腺癌是淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移；骨 (包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)轉(zhuǎn)移;骨盆、直腸、膀胱、尿道內(nèi)轉(zhuǎn)移。65. 依照權利要求61至64中任一項的抗體多肽，其中所述患者具有前列腺癌，并且在診 斷前列腺癌時和/或在治療時小于70、65、60、55、50、45、40或更小歲齡。66. 依照權利要求61至65中任一項的抗體多肽，其中所述患者的特征在于家庭成員，諸 如父親或兄弟在先前已經(jīng)診斷出前列腺癌。67. 依照權利要求61至66中任一項的抗體多肽，其中要治療的前列腺癌是去勢抗性前 列腺癌(CRPC)。68. 依照權利要求1至46中任一項的抗體多肽在制備用于治療和/或診斷前列腺癌的藥 物中的用途。69. -種用于治療患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括施用治療有效量的依照權 利要求1至46中任一項的抗體多肽的步驟。70. -種用于處理診斷患者中的癌癥的方法，所述方法包括施用診斷有效量的依照權 利要求1至46中任一項的抗體多肽的步驟。71. 依照權利要求69或70的方法，其中要治療的前列腺癌是非局限性（即播散性）前列 腺癌。72. 依照權利要求71的方法，其中要治療的前列腺癌是轉(zhuǎn)移性前列腺癌，任選微轉(zhuǎn)移性 前列腺癌。73. 依照權利要求72的方法，其中要治療的轉(zhuǎn)移性前列腺癌是淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移;骨(包括 脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)轉(zhuǎn)移;骨盆、直腸、膀胱、尿道內(nèi)轉(zhuǎn)移。74. 依照權利要求69至73中任一項的方法，其中所述患者具有前列腺癌，并且在診斷前 列腺癌時和/或在治療時小于70、65、60、55、50、45、40或更小歲齡。75. 依照權利要求69至74中任一項的方法，其中所述患者的特征在于家庭成員，諸如父 親或兄弟在先前已經(jīng)診斷出前列腺癌。76. 依照權利要求69至75中任一項的方法，其中要治療的前列腺癌是去勢抗性前列腺 癌(CRPC)〇77. 依照權利要求69至76中任一項的方法，其中在施用所述抗體多肽后對所述患者實 施放射引導手術以除去前列腺癌細胞。78. -種用于檢測受試者血液中的前列腺腫瘤細胞的體外方法，所述方法包括： (a) 提供來自要測試的受試者的血液樣品； (b) 任選地，提取和/或純化所述血液樣品中存在的細胞； (c) 使依照權利要求1至47中任一項的抗體多肽與所述血液樣品中存在的細胞接觸； (d) 測定所述抗體多肽是否結(jié)合游離hK2， 其中所述抗體多肽對游離hK2的結(jié)合指示受試者血液中前列腺腫瘤細胞的存在。79. -種用于檢測受試者組織中的前列腺腫瘤細胞的體外方法，所述方法包括： (a) 提供來自要測試的受試者的組織樣品； (b) 任選地，提取和/或純化所述組織樣品中存在的細胞； (c) 使依照權利要求1至47中任一項的抗體多肽與所述組織樣品中存在的細胞接觸； (d) 測定所述抗體多肽是否結(jié)合游離hK2， 其中所述抗體多肽對游離hK2的結(jié)合指示受試者組織中前列腺腫瘤細胞的存在。80. 依照權利要求79的方法，其中所述組織樣品是組織學樣品。81. 依照權利要求78至80中任一項的方法，其中通過ELI SA實施步驟(d)。82. 依照權利要求78至81中任一項的方法，其進一步包括量化所述樣品中的前列腺腫 瘤細胞。83. 依照權利要求78至82中任一項的方法，其用于診斷受試者中的前列腺癌。84. 基本上如本文中參考說明書描述的抗體多肽。85. 基本上如本文中參考說明書描述的分離的核酸分子。86. 基本上如本文中參考說明書描述的載體。87. 基本上如本文中參考說明書描述的宿主細胞。88. 基本上如本文中參考說明書描述的生成抗體多肽的方法。89. 基本上如本文中參考說明書描述的藥物組合物。90. 基本上如本文中參考說明書描述的在治療和/或診斷前列腺癌中使用的抗體多肽。91. 基本上如本文中參考說明書描述的用于治療和/或診斷患者中的前列腺癌的方法。92. 基本上如本文中參考說明書描述的用于檢測受試者中的前列腺腫瘤細胞的體外方 法。
【文檔編號】A61K51/10GK105980404SQ201480072422
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年11月19日
【發(fā)明人】P·O·V·蒂默曼德, A·T·特蘭, S-E·斯特蘭德, U·J·拉明梅基
【申請人】弗雷達克斯有限責任公司