具備單向滑動驅(qū)動工具的pcr裝置及利用此的pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明的一實施例涉及具備單向滑動驅(qū)動工具的PCR裝置及利用此的PCR方法，據(jù)此，通過重復(fù)布置2個以上加熱器的加熱組合單元與重復(fù)布置2個以上的反應(yīng)腔室的PCR芯片之間依次進(jìn)行熱接觸，能夠同時對大量試料實施迅速且正確的PCR，能夠增加試料的處理量。并且，防止了個別加熱器中發(fā)生的放射形熱分布及據(jù)此產(chǎn)生的鄰接加熱器之間不均勻的熱重疊，從而能夠大大提高PCR收率，無需另外的溫度調(diào)節(jié)工具，非常有助于裝置的小型化及集成化。進(jìn)而，通過利用重復(fù)布置加熱器單元的加熱組合單元及板形狀的PCR反應(yīng)部，能夠同時迅速地實施多個核酸樣品的增幅，測定連續(xù)的光學(xué)信號或電化學(xué)信號而能夠?qū)崟r確認(rèn)核酸增幅過程。
【專利說明】
具備單向滑動驅(qū)動工具的PCR裝置及利用此的PCR方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種PCR裝置及利用此的PCR方法，該PCR裝置具備連續(xù)重復(fù)布置加熱器的PCR加熱組合單元及重復(fù)布置反應(yīng)腔室的PCR芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR(Polymerase Chain React1n，以下相同)是重復(fù)地加熱及冷卻模板核酸的特定部位而連環(huán)復(fù)制所述特定部位，從而幾何級數(shù)地增加具備該特定部位的核酸的技術(shù)，以分析及診斷為目的，廣泛適用于生命科學(xué)、遺傳工程及醫(yī)療領(lǐng)域等。最近，正在開發(fā)多種能夠有效實施PCR的裝置。
[0003]現(xiàn)有PCR裝置的一例是在一個加熱器上安裝管(tube)形態(tài)的反應(yīng)容器，該反應(yīng)容器內(nèi)引入多個包括模板核酸的樣品溶液，重復(fù)地加熱(heating)及冷卻(cooling)所述反應(yīng)容器而實施PCR(參照圖1至2)。但是，雖然所述PCR裝置因具備一個加熱器而整體的結(jié)構(gòu)不復(fù)雜、能夠引入多個試料而增加了試料的密度(density)，但是為了正確的溫度控制，需要具備復(fù)雜的回路，管形反應(yīng)容器的大小較大，需要較多的試料，因?qū)σ粋€加熱器重復(fù)進(jìn)行加熱或冷卻，導(dǎo)致整體PCR時間邊長。
[0004]并且，現(xiàn)有PCR裝置的另一例是安裝具有PCR溫度的多個加熱器，使包括核酸的樣品溶液通過一個流路流動而通過這些各個加熱器，從而實施PCR(參照圖3)。通過使用已設(shè)定為PCR溫度的多個加熱器，無需重復(fù)的加熱(heating)及冷卻(cooling)加熱器，因此其優(yōu)點在于PCR時間較快。但是，所述PCR裝置因利用多個加熱器，雖能實現(xiàn)比較簡單的回路，但必須具備用于通過高溫及低溫加熱器的長流路，從而整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以適用多個試料，為了控制通過所述加熱器的流路中流動的包括核酸的樣品溶液的流速，需要另外的控制裝置，難以增加試料及裝置的密度(dens i ty)。
[0005]最近，就PCR裝置，除了開發(fā)出能夠改進(jìn)PCR收率及實時掌握PCR過程的有效方法之夕卜，還通過增加密度(density)而能夠在一次PCR工藝中就能處理較多數(shù)量的試料，減少了PCR時間并增加了試料的處理量(through put)。這種情況下，仍需具備如下技術(shù):能夠大大減少PCR時間，不需要重復(fù)加熱(heating)及冷卻(cooling)的，能夠正確控制或?qū)崿F(xiàn)并聯(lián)布置的加熱器設(shè)定溫度的技術(shù)、為了能夠利用已設(shè)定溫度的加熱器而使大量試料同時進(jìn)行PCR所需的移送技術(shù)及與此相關(guān)的PCR裝置的實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題
[0007]為了解決所述問題，本發(fā)明的一實施例提供一種PCR裝置，能夠較大地改善PCR時間、收率及試料的處理量，還能進(jìn)行實時測定及分析。
[0008]解決問題的手段
[0009]本發(fā)明的一實施例提供一種PCR裝置，其特征在于，包括:PCR加熱組合單元，在基板上部面重復(fù)地隔離布置2個以上的加熱器;板形狀的PCR芯片，具備重復(fù)體現(xiàn)的2個以上的反應(yīng)腔室，當(dāng)接觸所述PCR加熱組合單元時，與布置于所述PCR加熱組合單元的2個以上的各加熱器相接;及單向滑動驅(qū)動工具，安裝所述PCR芯片的狀態(tài)下，維持所述PCR芯片與所述PCR加熱組合單元之間的接觸地體現(xiàn)滑動，所述滑動時，使得從所述PCR芯片的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的反應(yīng)腔室與從所述PCR加熱組合單元的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的加熱器之間依次發(fā)生熱接觸。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一實施例，所述2個以上的加熱器中鄰接的加熱器可具有不同的溫度。
[0011]所述2個以上的加熱器也可在所述PCR加熱組合單元的一末端加熱器中開始PCR的第I循環(huán)，在所述PCR加熱組合單元的另一末端加熱器中結(jié)束PCR的最后循環(huán)。
[0012]所述PCR芯片的反應(yīng)腔室可布置如下:向所述PCR芯片的滑動方向隔離布置2個以上；向與所述PCR芯片的滑動方向相垂直的方向隔離布置2個以上;或向與所述PCR芯片的滑動方向相垂直的方向連續(xù)通過的流路形態(tài)。
[0013]所述PCR芯片的反應(yīng)腔室可具有流入部/流出部整合型孔形態(tài)或流入部/流出部不同流路形態(tài)。
[0014]還可包括:光源，向所述PCR芯片的反應(yīng)腔室提供光;及光檢測部，收容從所述PCR反應(yīng)部放出的光。所述光源或光檢測部可重復(fù)布置于所述PCR加熱組合單元的鄰接加熱器之間的空間，可對應(yīng)所述PCR芯片的移動路徑而移動。
[0015]所述PCR芯片可具備檢測電極，用于檢測所述反應(yīng)腔室的內(nèi)部因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號，還可包括:電化學(xué)信號測定模塊，與所述檢測電極電氣性地連接而能夠?qū)崟r測定所述PCR芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)部發(fā)生的電化學(xué)信號。
[0016]所述PCR芯片具備:固定化(immobilizat1n)層，用形成于所述反應(yīng)腔室內(nèi)部的一區(qū)域而能夠與增幅標(biāo)的核酸的一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的捕獲探針(capture probe)進(jìn)行了表面處理;及檢測電極，形成于所述反應(yīng)腔室內(nèi)部的另一區(qū)域而檢測電化學(xué)信號，并且可包括:復(fù)合體，具備金屬納米粒子及連接到所述金屬納米粒子而能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的另一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的信號探針(signaling probe)，還可包括:電化學(xué)信號測定模塊，與所述檢測電極電氣性地連接而實時測定所述PCR芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)部發(fā)生的電化學(xué)信號。
[0017]所述PCR裝置還可具備:收容多個PCR芯片的芯片等待部，第IPCR芯片與所述PCR加熱組合單元依次進(jìn)行熱接觸之后，為了使第2PCR芯片與所述PCR加熱組合單元開始熱接觸而可驅(qū)動地連接。
[0018]發(fā)明效果
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一實施例，根據(jù)具有重復(fù)布置2個以上PCR溫度的加熱器的加熱組合單元與重復(fù)布置2個以上的反應(yīng)腔室的PCR芯片之間依次進(jìn)行熱接觸，能夠同時對大量試料實施迅速且正確的PCR，能夠增加試料的處理量。并且，防止了個別加熱器中發(fā)生的放射形熱分布及據(jù)此產(chǎn)生的鄰接加熱器之間不均勻的熱重疊，從而能夠大大提高PCR收率，無需另外的溫度調(diào)節(jié)工具，非常有助于裝置的小型化及集成化。進(jìn)而，通過利用重復(fù)布置加熱器單元的加熱組合單元及板形狀的PCR反應(yīng)部，能夠同時迅速地實施多個核酸樣品的增幅，測定連續(xù)的光學(xué)信號或電化學(xué)信號而能夠?qū)崟r確認(rèn)核酸增幅過程。
【附圖說明】
[0020]圖1至2圖示現(xiàn)有單一加熱器方式的PCR加熱組合單元及安裝于此的管(tube)類型的PCR反應(yīng)容器的平面圖及側(cè)方向剖面圖；
[0021]圖3圖示現(xiàn)有多個加熱器方式的PCR加熱組合單元及安裝于此的流路類型的PCR反應(yīng)容器的平面圖；
[0022]圖4圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的基板99上部面上重復(fù)地隔離布置2個以上的加熱器111、121的PCR加熱組合單元100 ；
[0023]圖5圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR加熱組合單元100的加熱器的布置結(jié)構(gòu)；
[0024]圖6圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900及布置于內(nèi)部的2個以上的反應(yīng)腔室910的布置結(jié)構(gòu)；
[0025]圖7至9圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種類型的PCR芯片900;
[0026]圖10至12圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種類型的PCR芯片900及其與PCR加熱組合單元相接觸的狀態(tài)；
[0027]圖13至14是現(xiàn)有管(tube)類型及流路類型的PCR反應(yīng)容器與根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片的比較圖；
[0028]圖15圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的單向滑動驅(qū)動工具及據(jù)此的PCR實施原理；
[0029 ]圖16至18圖示通過根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種PCR裝置體現(xiàn)的實時PCR;
[0030]圖19圖示與根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置相聯(lián)的芯片等待部；
[0031]圖20是圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置的PCR試驗結(jié)果的電泳照片。
【具體實施方式】
[0032]以下，參照附圖而詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明的實施例。以下說明只是為了易于理解根據(jù)本發(fā)明的實施例，并不是為了限定保護(hù)范圍。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的一實施例，PCR(Polymerase Chain React1n)是指增幅具有特定堿基序列的核酸的反應(yīng)的一種。例如，為了增幅具有特定堿基序列的DNA(deoxyribo nucleicacid)，PCR裝置可實施如下步驟:變性步驟(denaturing step)，將包括模板核酸即雙鏈DNA的PCR試料及試劑的溶液加熱到特定溫度，例如約95°C，將所述雙鏈DNA分離為單鏈的DNA;退火步驟(annealing step)，提供與需增幅的堿基序列具有互補(bǔ)性序列的寡核苷酸(ο I i gonuc Ieotide)引物，與所述分離的單鏈DNA —同冷卻到特定溫度，例如55 °C，從而使所述單鏈DNA的特定堿基序列與所述引物結(jié)合而形成部分DNA-引物復(fù)合體;及延長(或增幅)步驟(extens1n step)，所述退火步驟之后，使所述溶液維持適當(dāng)溫度，例如72°C，通過DNA聚合酶(polymerase)，以所述部分DNA-引物復(fù)合體的引物為基礎(chǔ)而形成雙鏈DNA，并且，通過重復(fù)所述3步驟，例如20次至40次，從而能夠幾何級數(shù)地遞增具有所述特定堿基序列的DNA。根據(jù)情況，所述PCR裝置能夠同時實施所述退火步驟與所述延長(或增幅)步驟，這種情況下，PCR裝置通過實施由所述延長步驟及所述退火及延長(或增幅)步驟構(gòu)成的2個步驟，從而完成第I循環(huán)。因此，根據(jù)本發(fā)明實施例的PCR加熱組合單元及包括此的PCR裝置是指包括實施所述步驟所需模塊的裝置，本說明書中未記載的具體模塊已通過用于實施PCR的現(xiàn)有技術(shù)而公開，或以不言自明的范圍內(nèi)全部具備為前提。
[0034]圖4圖示在基板99上部面上重復(fù)地隔離布置2個以上的加熱器111、121的PCR加熱組合單元100。
[0035]根據(jù)圖4，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR加熱組合單元100，向PCR溶液供熱的2個以上的加熱器111、121重復(fù)布置于其上部表面。所述PCR加熱組合單元100是維持特定溫度的模塊，在至少一面具備與PCR反應(yīng)區(qū)域之間的接觸面，通過熱接觸而向PCR溶液(用于實施PCR的試料及試劑)供熱而實施PCR。所述基板99的材質(zhì)不會因布置于其表面的加熱器111、121的加熱而發(fā)生物理或化學(xué)性質(zhì)的變化，2個以上的加熱器之間不會產(chǎn)生熱交換。例如，所述基板99由塑料、玻璃、硅等材質(zhì)形成，根據(jù)所需，可以是透明或半透明的。所述PCR加熱組合單元100為了裝置的小型化及集成化而整體上體現(xiàn)為薄的板形狀，例如具有約50納米(nm)至I毫米(mm)的厚度，優(yōu)選約250微米(μπι)，但并不限定于此。
[0036]在所述PCR加熱組合單元100的上部表面，重復(fù)地隔離布置2個以上的加熱器，例如所述PCR加熱組合單元100的2個以上的加熱器從所述PCR加熱組合單元的一末端的加熱器開始PCR的第I循環(huán)，在所述PCR加熱組合單元的另一末端的加熱器結(jié)束PCR的最后循環(huán)。并且，所述PCR加熱組合單元100可具有能夠向PCR反應(yīng)區(qū)域有效供熱的形狀，例如能夠增加面容比(Surfaceto Volume Rat1)的平面(Plane)形狀、流路(Channel)形狀或柱(pillar)形狀等。
[0037]所述加熱器111、121為布置于所述基板99的導(dǎo)電性發(fā)熱元件，可體現(xiàn)為利用焦耳熱(JouIe Heating)的加熱器、引起?白爾帖效應(yīng)(Peltier Effect)的熱電偶(Thermoelement)。另外，所述PCR加熱組合單元100的2個以上的加熱器中鄰接加熱器可體現(xiàn)為相異的溫度，鄰接加熱器間溫度模式可通過一定數(shù)量的加熱器的組合重復(fù)。例如，第I加熱器為95°C、第2加熱器為55°C、第3加熱器為72°C，這種溫度模式可重復(fù)體現(xiàn)為10次、20次、30次或40次等，第I加熱器為950C，第2加熱器為72°C等這種溫度模式重復(fù)體現(xiàn)10次、20次、30次或40次等。因此，所述PCR加熱組合單元100的2個以上的加熱器在所述PCR加熱組合單元的一末端的加熱器(95°C)開始PCR的第I循環(huán)，所述PCR加熱組合單元的另一末端的加熱器(72°C)中結(jié)束PCR的最后循環(huán)。
[0038]所述加熱器111、121為了維持一定溫度而與電源模塊及控制模塊連接，也可與監(jiān)測所述加熱器111、121溫度的傳感器。所述加熱器111、121為了維持固定的內(nèi)部溫度，以單位電極即加熱器電極以所述加熱器111、121的表面中心店為基準(zhǔn)而向上下及/或左右方向?qū)ΨQ布置。并且，所述加熱器111、121可由用于體現(xiàn)迅速的熱傳遞性及導(dǎo)電性的金屬材質(zhì)，例如由鉻、鋁、銅、鐵、銀及碳構(gòu)成的群中選擇一個I個以上或依此為基礎(chǔ)的復(fù)合材料(composite materials)制造，但并不限定于此。并且，所述加熱器111、121可包括從光透過性發(fā)熱元件，例如包括氧化物半導(dǎo)體物質(zhì)或向氧化物半導(dǎo)體物質(zhì)添從由111、313^1、63、(:及Sn構(gòu)成的群中選擇的不純物的物質(zhì)的導(dǎo)電性納米粒子、銦錫氧化物，導(dǎo)電性高分子物質(zhì)，碳素納米管及石墨稀(graphene)組成的群中選擇的一個以上的物質(zhì)。
[0039]若所述加熱器111、121以2次布置于所述PCR加熱組合單元100的上部表面而實施PCR的2步驟，即實施變性步驟及退火/延長步驟，則相比實施PCR的3步驟，即變性步驟、退火步驟及延長步驟，能夠減少PCR時間，減少加熱器個數(shù)，從而具有簡化結(jié)構(gòu)及增加密度(density)的優(yōu)點。另外，這種情況下，PCR的3步驟中，實施變性步驟所需的溫度為85°C至1050C，優(yōu)選95°C，實施退火步驟所需的溫度為40°C至60°C，優(yōu)選50°C，實施延長步驟所需的溫度為50°C至80 °C，優(yōu)選72 °C，進(jìn)而，PCR實施所需的2步驟中，實施變性步驟所需溫度為85°(:至105°(:，優(yōu)選95°C，實施退火/延長步驟所需溫度為50°C至80°C，優(yōu)選72°C。但是，實施所述PCR所需的特定溫度及溫度范圍可在PCR實施的公知范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。
[0040]如上述，將維持一定溫度的2個以上的加熱器111、121重復(fù)地隔離布置于PCR加熱組合單元100的上部表面，從而能夠增加每小時的溫度變化率。例如，根據(jù)現(xiàn)有的單一加熱器方式，每小時溫度變化率在:TC至7°C每秒的范圍內(nèi)，與此相反，根據(jù)本發(fā)明實施例的重復(fù)布置加熱器結(jié)構(gòu)，所述加熱器之間的每小時溫度變化率在200C至40°C每秒的范圍內(nèi)，因此能夠大大縮短PCR時間。根據(jù)本發(fā)明實施例的重復(fù)布置加熱器結(jié)構(gòu)，PCR的變性步驟、退火步驟及延長步驟(或所述變性步驟及退火/變性步驟)中能夠正確地控制溫度，同時，能夠僅在所述加熱器供熱的部位，維持所需的溫度或溫度范圍。并且，通過在所述PCR加熱組合單元100上重復(fù)布置多個加熱器而體現(xiàn)多種PCR循環(huán)周期。例如，適用于循環(huán)周期為10次的PCR時，可重復(fù)布置20個或30個所述加熱器。即，考慮到所需的PCR循環(huán)周期，在所述PCR加熱組合單元100上以10次、20次、30次、40次、50次等重復(fù)布置所述加熱器。
[0041]圖5圖示根據(jù)本發(fā)明實施例的PCR加熱組合單元100及向重復(fù)布置于所述PCR加熱組合單元100的加熱器供應(yīng)電力的電力供應(yīng)部200。更具體地說，圖5的上端圖示所述PCR加熱組合單元100的垂直剖面圖，圖5的下端圖示所述PCR加熱組合單元100的平面圖。圖5的PCR加熱組合單元100上重復(fù)布置20個加熱器。所述電力供應(yīng)部200是從電力供應(yīng)源向所述PCR加熱組合單元100供應(yīng)電力而加熱的模塊，包括向所述各加熱器110、120分配電力的布線210、220。例如，根據(jù)圖5，所述PCR加熱組合單元100的第I布線210向第I加熱器110供應(yīng)電力，第2布線220向第2加熱器120供應(yīng)電力。若所述第I加熱器110維持PCR變性步驟溫度，例如85°C至105°C，所述第2加熱器120維持PCR退火/延長步驟溫度，例如50°C至80°C的情況下，所述第I布線210從所述電力供應(yīng)部200接收維持PCR變性步驟溫度所需的電力，所述第2布線220從所述電力供應(yīng)部200接收維持PCR退火/延長步驟溫度所需的電力。所述第I布線210及所述第2布線220可由金、銀、銅等導(dǎo)電性材質(zhì)構(gòu)成，但并不限定于此。所述電力供應(yīng)源是向所述電力供應(yīng)部200供應(yīng)電力的模塊，分別與所述電力供應(yīng)部200的第I布線210及第2布線220連接。例如，實施PCR時，所述電力供應(yīng)源的第I電力端口與所述第I布線210電氣性地連接，所述電力供應(yīng)源的第2電力端口與所述第2布線220電氣性地連接。然后，存在實施PCR所需的使用者指示時，所述電力供應(yīng)源向所述第I布線210及所述第2布線220分別供應(yīng)電力而迅速加熱所述PCR加熱組合單元的第I加熱器及第2加熱器，當(dāng)各加熱器達(dá)到預(yù)先設(shè)定的溫度時，控制電力供應(yīng)量而使其維持所述預(yù)先設(shè)定的溫度。
[0042]圖6圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900及布置于其內(nèi)部的2個以上的反應(yīng)腔室910的布置結(jié)構(gòu)，圖7至9圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種類型的PCR芯片900。
[0043]根據(jù)圖6，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900為板形狀，與PCR加熱組合單元100的上部表面，更具體地說，與加熱器110、120接觸，為了接觸時能夠鄰接布置于所述PCR加熱組合單元100的2個以上的加熱器110、120，具備重復(fù)體現(xiàn)的2個以上的反應(yīng)腔室910、920。以此為前提，圖7至9圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種類型的PCR芯片900。
[0044]所述反應(yīng)腔室是收容溶液的空間，該溶液包括為增幅具有特定堿基序列的DNA(deoxyribo nucleic acid-脫氧核糖核酸)而包括模板核酸即雙鏈DNA的PCR試料及試劑。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，所述反應(yīng)腔室的特征在于，為實施PCR而與所述PCR加熱組合單元100熱接觸時，布置于所述PCR加熱組合單元100所具備的加熱器區(qū)域。另外，所述PCR芯片整體體現(xiàn)為板形狀，與所述PCR加熱組合單元100熱接觸時，能夠向所述各反應(yīng)腔室均勻地傳遞熱量。
[0045]根據(jù)圖7，在板形狀的芯片上重復(fù)布置2個以上的所述反應(yīng)腔室910。并且，所述反應(yīng)腔室910可向所述芯片的長度方向或與長度方向垂直的方向布置2個以上。這時，各反應(yīng)腔室910可包括相同或相異的PCR試料及試劑，這時，通過一個PCR芯片900就能實施對2個以上或多種試料的PCR。
[0046]根據(jù)圖8，在板形狀的芯片上重復(fù)布置2個以上的所述反應(yīng)腔室910，所述反應(yīng)腔室910可體現(xiàn)為向與所述芯片的長度方向垂直的方向連續(xù)通過的流路形態(tài)。這時，各反應(yīng)腔室910可包括相同或相異的PCR試料及試劑，這時，通過一個PCR芯片900就能實施對2個以上或多種試料的PCR。
[0047]另外，根據(jù)圖7至8的PCR芯片900的反應(yīng)腔室910無流入部/流出部的區(qū)別而體現(xiàn)為作為整體的流入部/流出部整合型孔形態(tài)，根據(jù)圖9的PCR芯片900的反應(yīng)腔室910在單位區(qū)域內(nèi)分開體現(xiàn)流入部931及流出部932，也可體現(xiàn)為流入部931及流出部932通過一個流路921連接的流入部/流出部分離型流路形態(tài)?，F(xiàn)有多孔板(multi well plate)形態(tài)的PCR芯片因試料的量(volume)大，面容比(SurfacetoVolume Rat1)低，PCR時間較長，但根據(jù)本發(fā)明的一實施例的流入部/流出部分離型流路形態(tài)的PCR芯片因面容比(Surface toVo IumeRat1)高，能夠大大縮短PCT時間。所述反應(yīng)腔室內(nèi)的流路高度可從0.01微米(μπι)至5毫米(mm)中選擇，但優(yōu)選地，為了提高面容比(Surfaceto Volume Rat1)而選擇較低的流路高度。
[0048]另外，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900可包括:第I板，接觸到所述PCR加熱組合單元100;第2板，布置于所述第I板上，具備所述2個以上的反應(yīng)腔室;及第3板，布置于所述第2板上，具備所述2個以上的反應(yīng)腔室的流入部或流出部。
[0049]如上述，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900體現(xiàn)為板形狀的層疊機(jī)構(gòu)，從而具有簡化制造工藝、降低費用、增大與PCR加熱組合單元100之間的熱交換面積的優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900可采用多種材質(zhì)，但優(yōu)選塑料材質(zhì)的薄膜形狀。并且，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900可采用透光性材質(zhì)，若用于焚光(Fluorescence)、磷光(Phosphorescence)、發(fā)光(Luminescence)、拉曼光譜學(xué)(Raman Spectroscopy)、表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Scattering)及表面等離子體共振(Surface PlasmonResonance)等以光學(xué)測定為基礎(chǔ)的實時(real-time)PCR用途時，優(yōu)選采用透光性材質(zhì)。[°°50] 所述第I板是粘貼或粘結(jié)到所述PCR加熱組合單元100而從所述PCR加熱組合單元I 00接收熱量的部分。所述第I板可采用多種材質(zhì)，優(yōu)選采用從聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、環(huán)稀經(jīng)共聚物(cycle olefin copolymer，COC)、聚甲基丙稀酸甲酯(polymethylmetharcylate，PMMA)、聚碳酸酯(poIycarbonate，PC)、聚碳酸亞丙酯(polypropylene carbonate，PPC)、聚釀諷(polyether sulfone，PES)及聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)、及其組合物構(gòu)成的群中選擇的材質(zhì)。并且，所述第I板的上端面可用親水性物質(zhì)(未圖示)進(jìn)行處理，從而能夠順暢地實施PCR。根據(jù)所述親水性物質(zhì)的處理，所述第I板上可形成包括親水性物質(zhì)的單一層。所述親水性物質(zhì)可以是多種物質(zhì)，但優(yōu)選從羧基(-C00H)、氨基(-NH2)、羥基(-0H)及巰基(-SH)構(gòu)成的群中選擇，所述親水性物質(zhì)的處理可采用行業(yè)內(nèi)公知的方法。
[0051]所述第2板布置于所述第I板上。所述第2板包括2個以上的反應(yīng)腔室。向所述2個以上的反應(yīng)腔室引入需增幅的標(biāo)的樣品溶液之后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。并且，所述第2板可采用多種材質(zhì)，優(yōu)選采用由聚甲基丙稀酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)、聚碳酸酯(polycarbonate ,PC)、環(huán)稀經(jīng)共聚物(eyelooIef in copolymer ,COC)、聚酰胺(polyamide，PA)、聚乙稀(polyethylene，PE)、聚丙稀(polypropyIene，PP)、聚苯醚(polyphenyIeneether，PPE)、聚苯乙稀(polystyrene，PS)、聚甲酸(polyoxymethyIene ,POM)、聚釀釀酮(po lye there therke tone，PEEK)、聚四氣乙稀(polytetraf luoroethylene，PTFE)、聚氯乙稀(poly vinyl chloride ,PVC)、聚偏二氣乙稀(polyvinyl i dene fluoride ,PVDF)、聚對苯二甲酸丁二酯(po lybuty leneterephthalate，PBT)、氣化乙丙稀(fluorinated ethylenepropylene,FEP)、全氟燒氧基燒經(jīng)(perfluoralkoxyalkane，PFA)及其組合物構(gòu)成的群中選擇的熱塑性樹脂或熱固性樹脂材質(zhì)。并且，所述第2板可具有多種厚度，可從0.Ο?μπι至5mm中選擇。并且，所述反應(yīng)腔室可具有多種寬度及長度，但優(yōu)選地，所述反應(yīng)腔室的寬度從
0.00 Imm至I Omm中選擇，所述長度從Imm至400mm中選擇。并且，為了防止DNA、蛋白質(zhì)(protein)的吸附，可用娃燒(siIane)系列、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)等物質(zhì)對所述第2板的內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理，所述物質(zhì)的處理可采用行業(yè)內(nèi)公知的方法。
[0052]所述第3板布置于所述第2板上。所述第3板具備形成于所述第2板上形成的2個以上的反應(yīng)腔室區(qū)域的流入部或流出部。所述流入部是流入包括需增幅的核酸的標(biāo)的樣品溶液的部分，所述流出部是結(jié)束PCR之后排出所述標(biāo)的樣品溶液的部分。如上述，所述流入部與流出部可采用整合型或分離型，所述流入部與流出部的內(nèi)部表面與所述第2板的2個以上的反應(yīng)腔室的內(nèi)部表面連續(xù)地連接。另外，所述第3板可采用多種材質(zhì)，但優(yōu)選采用由聚二甲娃氧燒(polydimethylsiloxane，PDMS)、環(huán)稀經(jīng)共聚物(cycle olefin copolymer,COC)、聚甲基丙稀酸甲酯(polymethylmetharcylate，PMMA)、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)、聚碳酸亞丙酯(polypropylene carbonate，PPC)、聚釀諷(polyether sulfone，PES)及聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)、及其組合物構(gòu)成的群中選擇的材質(zhì)。并且，所述流入部可具有多種大小，但優(yōu)選從直徑0.001mm至1mm中選擇。并且，所述流出部也可具備多種大小，但優(yōu)選從直徑0.0Olmm至1mm中選擇。并且，所述流入部及流出部具備另外的蓋子工具，實施標(biāo)的樣品溶液的PCR時，防止所述2個以上反應(yīng)腔室內(nèi)的標(biāo)的樣品溶液的泄漏。所述蓋子工具可具有多種形狀、大小或材質(zhì)。并且，所述第3板可具有多種厚度，但優(yōu)選從0.00 Imm至I Omm中選擇。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900可通過包括如下步驟的方法制作:提供所述第3板的步驟，通過機(jī)械加工形成所述流入部或流出部;提供所述第2板的步驟，在具有與所述第3板的下部面對應(yīng)的大小的板材上對應(yīng)所述第3板的流入部或流出部的部分，通過機(jī)械加工而形成2個以上的反應(yīng)腔室;提供所述第I板的步驟，在具有與所述第2板的下部面對應(yīng)的大小的板材的上部面上，通過表面處理加工而由親水性物質(zhì)形成表面;及接合步驟，通過接合工藝而將所述第3板的下部面接合到所述第2板的上部面，通過接合工藝而將所述第2板的下部面接合到所述第I板的上部面。
[0054]所述第3板的流入部或流出部及所述第2板的2個以上的反應(yīng)腔室可通過由射出成形(inject1n molding)、熱壓成形(hot-emboss ing)、鑄造(casting)及激光燒蝕(I as erab I a t i on)構(gòu)成的群中選擇的加工方法而形成。并且，所述第I板表面的親水性物質(zhì)可通過從氧氣及氬等離子體處理、電暈放電處理及表面活性劑涂布構(gòu)成的群中選擇的方法進(jìn)行處理，可采用行業(yè)內(nèi)公知的方法。并且，所述第3板的下部面與所述第2板的上部面及所述第2板的下部面與所述第I板的上部面的接合可采用熱黏合(Thermal bonding)、超聲波焊接(Ultrasonic We Iding )、溶劑黏合(Sol vent Bonding)、熱板焊接(Hot PlateWelding)、UV接合(Ultrav1let Bonding)及壓力接合(Press Bonding)工藝，可采用行業(yè)內(nèi)公知的方法。所述第3板與第2板之間及所述第2板與第I板之間可用雙面粘合劑或熱塑性樹脂或熱固性樹脂進(jìn)行處理。
[0055]圖10至12圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種類型的PCR芯片900及其與PCR加熱組合單元接觸的狀態(tài)。
[0056]根據(jù)圖10，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900具備流入部/流出部整合型孔(well)形態(tài)的反應(yīng)腔室910，所述反應(yīng)腔室910對應(yīng)地布置于根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR加熱組合單元的加熱器110、120上。根據(jù)圖11，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900具備流入部/流出部分離型流路形態(tài)的反應(yīng)腔室910，所述反應(yīng)腔室910垂直布置于根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR加熱組合單元的加熱器110、120上。進(jìn)而，根據(jù)圖12，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片900具備流入部/流出部不同流路形態(tài)的反應(yīng)腔室910，所述反應(yīng)腔室910水平布置于根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR加熱組合單元的加熱器110、120上。
[0057]如上述的根據(jù)本發(fā)明的一實施例的形態(tài)的PCR芯片相比現(xiàn)有PCR反應(yīng)容器，能夠增加PCR裝置體現(xiàn)的密度，同時有助于有效實施PCR。根據(jù)圖13，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片相比使用單一加熱器為前提的現(xiàn)有的管方式的PCR反應(yīng)容器，能夠?qū)Ω嗟亩喾N試料同時實施PCR，還能大大縮短PCR時間，大大減少容器的大小。進(jìn)而，相比使用以現(xiàn)有的多個加熱器為前提的單一流路方式的PCR反應(yīng)容器，能夠?qū)Ω嗟亩喾N試料同時實施PCR，還能大大縮短PCR時間，無需通過流路的流體控制模塊，能夠大大地增加PCR裝置的密度。另外，根據(jù)圖14，因根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片能夠小型化，可最小胡試料的量，能夠增加加熱器即加熱組合單元與試料之間的熱接觸面，能夠增加面容比(Surfaceto VolumeRat1)(a〈a’〈a〃)。這時，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR芯片，圖11至圖12的芯片相比圖10的芯片，更加提高了面容比。
[0058]圖15圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的單向滑動驅(qū)動工具及據(jù)此的PCR實施原理。
[0059]根據(jù)圖15，能夠確認(rèn)通過包括PCR加熱組合單元100、電力供應(yīng)部(200、PCR芯片900及單向滑動驅(qū)動工具990的根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置實施PCR的步驟(SI至S3)。單向滑動驅(qū)動工具990以安裝PCR芯片900的狀態(tài)，維持所述PCR芯片900與所述PCR加熱組合單元100之間的接觸地滑動，所述滑動時，從所述PCR芯片900的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的反應(yīng)腔室910與從所述PCR加熱組合單元100的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的加熱器110、120之間實現(xiàn)依次的熱接觸。
[0060]首先，準(zhǔn)備包括雙鏈標(biāo)的DNA、需增幅的特定堿基序列及互補(bǔ)性序列的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphates，dNTP)、PCR反應(yīng)緩沖液(PCR react1n buffer)的PCR溶液，將所述PCR溶液引入PCR芯片900的反應(yīng)腔室后密封。其次，所述電力供應(yīng)部200，具體將第I布線210及第2布線220等與電力供應(yīng)源分別連接。然后，通過所述第I布線210及所述第2布線220等而加熱所述第I加熱器110及所述第2加熱器120等，維持實施PCR所需的溫度，即第I加熱器110維持PCR變性溫度(95°C)及第2加熱器維持PCR退火/延長步驟溫度(72 °C)。[0061 ]在SI至S3步驟中，所述PCR芯片900的2個以上的反應(yīng)腔室910可收容相同或相異的PCR試料及試劑，重復(fù)布置于所述PCR加熱組合單元100的加熱器110、120根據(jù)電力供應(yīng)部200的電力供應(yīng)而實施PCR所需的2步驟，即第I加熱器110維持實施變性步驟所需的溫度即95°C，第2加熱器120維持實施退火/延長步驟所需的溫度即72°C，之后，20個加熱器重復(fù)維持95°C/72°C為前提。
[0062]參照SI步驟，所述PCR芯片900根據(jù)所述單向滑動驅(qū)動工具990而開始與所述PCR加熱組合單元100的一末端接觸并開始滑動。即，所述PCR芯片900的右側(cè)末端的第I反應(yīng)腔室910與所述PCR加熱組合單元100的左側(cè)末端的第I加熱器110實現(xiàn)熱接觸而實施變性步驟，從而開始PCR。
[0063]參照S2步驟，所述PCR芯片900根據(jù)所述單向滑動驅(qū)動工具990維持與所述加熱組合單元100的上部面的接觸，并連續(xù)地滑動而依次實施PCR。例如，所述PCR芯片900的右側(cè)末端的第I反應(yīng)腔室910根據(jù)PCR芯片900的滑動而與所述加熱組合單元100的左側(cè)末端的第2加熱器120實現(xiàn)熱接觸而實施退火/延長步驟，所述PCR芯片900的右側(cè)末端的第2反應(yīng)腔室920與所述PCR加熱組合單元100的左側(cè)末端的第I加熱器110實現(xiàn)熱接觸而實施變性步驟，重復(fù)布置于所述PCR芯片900的右側(cè)末端的反應(yīng)腔室與重復(fù)布置于所述PCR加熱組合單元100的左側(cè)末端的加熱器重復(fù)進(jìn)行熱接觸而依次實施PCR。
[0064]參照S3步驟，所述PCR芯片900根據(jù)所述單向滑動驅(qū)動工具990而與所述加熱組合單元100的上部面接觸并進(jìn)行滑動后，完成PCR。例如，所述PCR芯片900的左側(cè)末端的反應(yīng)腔室與所述加熱組合單元100的右側(cè)末端的加熱器實現(xiàn)熱接觸而實施退火/延長步驟，完成依次實施的PCR。
[0065]另外，完成SI至S3步驟之后，單向滑動驅(qū)動工具990實施以現(xiàn)有正向滑動為前提的PCR，也可通過逆向滑動重復(fù)實施SI至S3步驟。因此，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置無需復(fù)雜的其他控制模塊，也能維持具備PCR加熱組合單元與PCR腔室的PCR芯片之間的熱接觸，能夠迅速實施PCR，非常有利于裝置的小型化及集成化。
[0066]圖16至18圖示通過根據(jù)本發(fā)明的一實施例的多種PCR裝置體現(xiàn)的實時PCR。
[0067]圖16a至16d圖示通過根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置體現(xiàn)的實時PCR。根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置可包括用于實時測定PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)發(fā)生的核酸增幅反應(yīng)的光學(xué)模塊。所述光學(xué)模塊可包括:光源150，布置為向PCR芯片900的反應(yīng)腔室910提供光;及光檢測部600，布置為收容從PCR芯片900放出的光。為了利用光學(xué)模塊實時測定核酸增幅反應(yīng)，可向標(biāo)的樣品溶液添加另外的熒光物質(zhì)，據(jù)此生成PCR產(chǎn)物，根據(jù)特定波長的光而發(fā)光，誘發(fā)可測定及分析的光信號。所述光源150可從水銀弧光燈(Mercury ArcLamp)、氣弧燈(Xenon Arc Lamp)、媽弧燈(Tungsten Arc Lamp)、金屬齒化弧燈(MetalHalide Arc Lamp)、金屬齒化物光纖(Metal Halide fiber)及LED(Light EmittingD1des-發(fā)光二極管)構(gòu)成的群中選擇。并且，所述光源150的波長可從約200納米(nm)至1300納米(nm)的范圍內(nèi)選擇，可利用多重光源或利用過濾器體現(xiàn)為多重波長。并且，所述光檢測部600可從CCD(Charge-coupled Device-電荷親合裝置)、CID(Charge_in ject1nDevice_電荷注入器件)、CMOS (CompIementary-metal-oxide-semiconductor Detector-互補(bǔ)式金屬氧化物半導(dǎo)體探測器)及PMT(Photo Multiplier Tube-光電倍增管)構(gòu)成的群中選擇。另外，根據(jù)本發(fā)明的一實施例，為了改善檢測效率，可驅(qū)動地連接布置所述光源150及光檢測部600與多種模塊。例如，所述光源150還可包括或可驅(qū)動地連接到僅使能夠激發(fā)(excitat1n)焚光物質(zhì)的波長帶域的光通過的I個以上的光學(xué)帶域過濾器(optical bandpassfilter)，這種情況下，
[0068]所述光源150或光檢測部600還可包括或可驅(qū)動地連接到置換部，使得要檢測所述I個以上的光學(xué)帶域過濾器的熒光物質(zhì)的激發(fā)波長與發(fā)光波長相一致。并且，所述光源150還可包括或可驅(qū)動地連接到能夠激發(fā)I個以上的熒光物質(zhì)的使用I個以上的波長的LED(Light Emitting D1de)，這種情況下，所述LED光源還可包括或可驅(qū)動地連接到置換部，能夠使I個以上的熒光物質(zhì)的激發(fā)波長與發(fā)光波長相一致。
[0069]根據(jù)圖16a，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置包括:透光性材質(zhì)的PCR芯片900、PCR加熱組合單元100的第I加熱器110及布置于第2加熱器120之間的光源150、及用于檢測從光源150放出的光信號的光檢測部600。具體地說，包括標(biāo)的樣品溶液的PCR溶液在反應(yīng)腔室910內(nèi)，在第I加熱器110的上側(cè)對應(yīng)部分及第2加熱器120的上側(cè)對應(yīng)部分滑動，從而重復(fù)實施PCR變性步驟及PCR退火/延長步驟，這種情況下，標(biāo)的樣品溶液在第I加熱器110與第2加熱器120之間，及包括第I加熱器110與第2加熱器120的加熱器單元之間，通過光源150的上側(cè)對應(yīng)部分。收容標(biāo)的樣品溶液的反應(yīng)腔室910在光源150的上側(cè)對應(yīng)部分移動時，通過控制單向滑動驅(qū)動工具990而減緩PCR芯片900的移動速度或暫時維持停止?fàn)顟B(tài)后，從光源150放出光，放出的光通過PCR芯片900，具體通過反應(yīng)腔室910，所述光檢測部600能夠測定及分析根據(jù)反應(yīng)腔室910內(nèi)的核酸增幅而產(chǎn)生的光信號。因此，進(jìn)行PCR各循環(huán)周期的時間內(nèi)，在反應(yīng)腔室910內(nèi)(結(jié)合熒光物質(zhì)的)實時(real-time)監(jiān)測根據(jù)核酸增幅的反應(yīng)結(jié)果，從而能夠?qū)崟r(r ea 1-t ime)測定及分析標(biāo)的核酸的量。
[0070]與根據(jù)圖16a的PCR裝置不同，根據(jù)圖16b至16c的PCR裝置包括:PCR芯片900，具有半透過性(上層由透過性材質(zhì)，下層由非-透過性材質(zhì)體現(xiàn))材質(zhì);光源150，布置于PCR加熱組合單元100的第I加熱器110與第2加熱器120之間；及光檢測部600，用于檢測從光源150放出的光信號，對應(yīng)PCR芯片900的移動路徑而移動。這種情況下，固定布置光檢測部600，光源150可對應(yīng)PCR芯片900的移動路徑而移動。另外，根據(jù)圖16d的PCR裝置包括:PCR芯片900，具有半透過性(上層由透過性材質(zhì)，下層由非-透過性材質(zhì)體現(xiàn))材質(zhì);光檢測部600，對應(yīng)PCR芯片900的移動路徑而移動，用于檢測光源150、從光源150放出的光信號；及光學(xué)模塊610，收容雙色鏡620，該雙色鏡將由光源150放出的光傳遞到PCR芯片900的反應(yīng)腔室910并將由反應(yīng)腔室910放出的光傳遞到光檢測部600。
[0071]圖17圖示通過根據(jù)本發(fā)明的一實施例的另一類型的PCR裝置體現(xiàn)的實時PCR。根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置包括PCR加熱組合單元100、PCR芯片900、單向滑動驅(qū)動工具990及實時測定所需的電化學(xué)模塊。具體地說，所述PCR芯片900可具備檢測電極950，檢測所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部中因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號。
[0072]所述電化學(xué)模塊包括通過電化學(xué)實時測定所述PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)產(chǎn)生的核酸增幅反應(yīng)的模塊。所述電化學(xué)模塊為達(dá)成其目的而體現(xiàn)為多種，但優(yōu)選如圖17，可包括:檢測電極9 50，檢測所述PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)部中因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號；電氣性連接工具700，與所述檢測電極950想聯(lián)，及電化學(xué)信號測定模塊800，經(jīng)由所述電氣性連接工具700而測定所述檢測的信號。
[0073]所述活性物質(zhì)(redoxindicator)可定義為與增幅核酸產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(結(jié)合)而引發(fā)電化學(xué)信號的物質(zhì)，所述電化學(xué)信號是指根據(jù)核酸的連續(xù)增幅而能夠連續(xù)地檢測及測定的信號。例如，雙鏈核酸(DNA)的情況為:整體帶負(fù)電荷，若活性物質(zhì)帶正電荷，根據(jù)核酸的連續(xù)增幅，增幅核酸與所述活性物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，根據(jù)總電荷量變化而導(dǎo)出可檢測的信號。因此，所述電化學(xué)信號可起因于所述增幅核酸的負(fù)電荷與所述活性物質(zhì)的正電荷結(jié)合所導(dǎo)致的總電流值變化，所述活性物質(zhì)可以是離子結(jié)合性物質(zhì)的離子化產(chǎn)物中的正離子物質(zhì)。更具體地說，所述離子結(jié)合性物質(zhì)可以是亞甲藍(lán)(methylene blue)，所述活性物質(zhì)可以是亞甲藍(lán)的離子化產(chǎn)物中的正離子物質(zhì)。若用溶劑溶解所述亞甲藍(lán)(C16H18N3SC1.3H20)，則離子化為C16H18N3S+及Cl-，電子的情況為，因硫原子(S)而帶正電荷。雙鏈核酸(DNA)由糖和堿基及磷酸過程，其中，因磷酸基帶負(fù)電荷，雙鏈核酸(DNA)整體上帶負(fù)電荷。因亞甲藍(lán)的正離子與DNA的磷酸基結(jié)合，與雙鏈核酸結(jié)合的亞甲藍(lán)的表面擴(kuò)散率相比亞甲藍(lán)的表面擴(kuò)散率相應(yīng)地減少，據(jù)此減少電流的峰值。因此，隨著PCR周期的進(jìn)行及雙鏈核酸(DNA)的增幅，結(jié)合到雙鏈核酸(DNA)的亞甲藍(lán)的量增加而電流的峰值減少，最終，提高實時PCR的增幅產(chǎn)物與亞甲藍(lán)的化學(xué)結(jié)合所導(dǎo)致的電氣性信號，實現(xiàn)增幅核酸的實時定量。
[0074]所述檢測電極950可體現(xiàn)為多種材質(zhì)，能夠檢測所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而發(fā)生的電化學(xué)信號，例如從金(Au)、鈷(Co)、鉑金(Pt)、銀(Ag)、碳納米管(carbon nanotube)、石墨稀(graphene)及碳(Carbon)構(gòu)成的群中選擇的I個以上。另外，所述檢測電極950為了效率最大化，可體現(xiàn)為多種形狀及規(guī)格。例如，可體現(xiàn)為:具備產(chǎn)生所述增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合的作業(yè)電極(working electrode)及不會產(chǎn)生所述增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而成為電極電位的測定基準(zhǔn)的基準(zhǔn)電極(reference electrode)的2_電極模塊，或具備所述作業(yè)電極、所述基準(zhǔn)電極及流動著從所述作業(yè)電極產(chǎn)生的電流的對電極(counter electrode)的3_電極模塊。如所述，所述檢測電極的結(jié)構(gòu)若體現(xiàn)為上述的多_電極模塊方式，能夠提高所述反應(yīng)腔室內(nèi)部中產(chǎn)生的電化學(xué)信號的靈敏度之外，還能容易地檢測及測定產(chǎn)生的信號。
[0075]所述電化學(xué)信號測定模塊800可通過電氣性連接工具700，例如通過引線而能夠?qū)щ姷剡B接到所述PCR芯片900的任意夾具(未圖示)的連接端口。因此，可通過所述PCR芯片900的檢測電極950而能夠依次檢測所述PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)部中根據(jù)依次的核酸增幅而重復(fù)產(chǎn)生的電化學(xué)信號，所述檢測的信號經(jīng)由所述電氣性連接工具700而通過所述電化學(xué)信號測定模塊800測定并加工或分析。所述電化學(xué)信號測定模塊800可體現(xiàn)為多種，從陽極溶出伏安法(anod i c stripping v ο 11 amm e t r y，A S V )、計時電流法(chronoamperometry,CA)、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry)、方波伏安法(square wavevo I tammetry，SffV )、方波伏安法(differential pulse vol tammetry，DPV)及阻抗(impedance)構(gòu)成的群中選擇。
[0076]根據(jù)圖17，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的第2PCR裝置實施PCR時，能夠?qū)崟r(real-time) 測定及分析核酸增幅過程。這種情況下，所述試料及試劑與根據(jù)本發(fā)明的一實施例的第IPCR裝置不同，無需添加另外的熒光物質(zhì)。例如，PCR試料及試劑溶液根據(jù)所述PCR芯片900的滑動，在所述反應(yīng)腔室910內(nèi)，連續(xù)通過所述第I加熱器110的上側(cè)對應(yīng)部分及所述第2加熱器120的上側(cè)對應(yīng)部分302，從而實施變性步驟及退火/延長步驟，這種情況下，增幅核酸在所述第I加熱器110及第2加熱器120的任意的位置，通過所述單向滑動驅(qū)動工具990的控制而減緩移動速度或維持暫時停止的狀態(tài)后，通過所述檢測電極950而依次實時檢測及測定因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號。因此，PCR各循環(huán)周期進(jìn)行的過程中，所述反應(yīng)腔室910內(nèi)(無熒光物質(zhì)及光檢測系統(tǒng))，實時(real-time)監(jiān)測因核酸的增幅導(dǎo)致的反應(yīng)結(jié)果，實時(r ea 1-t ime)檢測及測定標(biāo)的核酸的量。
[0077]圖18圖示通過根據(jù)本發(fā)明的一實施例的另一類型的PCR裝置體現(xiàn)的實時PCR。根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置包括PCR加熱組合單元100、PCR芯片900、單向滑動驅(qū)動工具990及實時測定所需的電化學(xué)模塊。具體地說，所述PCR芯片900具備:固定化(immobilizat1n)940層，用形成于所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部的一區(qū)域而能夠與增幅標(biāo)的核酸的一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的捕獲探針(capture probe)進(jìn)行了表面處理;及檢測電極950，形成于所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部的另一區(qū)域而檢測電化學(xué)信號，并且，還可包括:復(fù)合體，具備金屬納米粒子及連接到所述金屬納米粒子而能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的另一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的信號探針(signaling probe)。
[0078]所述電化學(xué)模塊可包括通過電化學(xué)實時測定所述PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)產(chǎn)生的核酸增幅反應(yīng)的模塊。所述電化學(xué)模塊為達(dá)成其目的而體現(xiàn)為多種，但優(yōu)選地，具備:固定化(11111]1013；[11231:;[011)940層，用形成于所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部的一區(qū)域而能夠與增幅標(biāo)的核酸的一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的捕獲探針(capture probe)進(jìn)行了表面處理;檢測電極950，形成于所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部的另一區(qū)域而檢測電化學(xué)信號；電氣性連接工具700，與所述檢測電極950相聯(lián);及電化學(xué)信號測定模塊800，經(jīng)由所述電氣性連接工具700而測定所述檢測的信號。這種情況下，所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部可包括:復(fù)合體，具備金屬納米粒子及連接到所述金屬納米粒子而能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的另一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的信號探針。
[0079]所述固定化(immobilizat1n)層940與所述檢測電極950可布置于所述反應(yīng)腔室910的多種位置，也可左右或上下相對地布置。并且，所述反應(yīng)腔室910的內(nèi)部可收容復(fù)合體，具備金屬納米粒子及連接到所述金屬納米粒子而能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的另一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的信號探針。這種情況下，在引入包括模板核酸等的PCR試料之前，所述復(fù)合體可預(yù)先收容到所述反應(yīng)腔室910，以包括含有引物、聚合酶等的PCR試劑的狀態(tài)一同引入到所述反應(yīng)腔室910。所述固定化層940可體現(xiàn)為娃、塑料、玻璃，金屬材質(zhì)等，從而在其一面，能夠蒸鍍并暴露捕獲探針。這種情況下，在所述固定化層940的表面，例如，蒸鍍捕獲探針之前，可提前用氨NH3+、醛C0H、羧基C00H等物質(zhì)進(jìn)行表面處理。所述捕獲探針可體現(xiàn)為與所述增幅標(biāo)的核酸的一部位(區(qū)域)互補(bǔ)性地結(jié)合，與金屬納米粒子結(jié)合而形成復(fù)合體。所述金屬納米粒子可體現(xiàn)為多種，可從鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、銅(Cu)、鎵(Ga)、銦(In)、金(Au)、鉻(Cr)、猛(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銫(Cs)、鋇(Ba)、鎘(Cd)、萊(Hg)、砷(As)、砸(Se)、錫(Sn)、銻(Sb)、鉍(Bi)及銀(Ag)構(gòu)成的群中選擇的I個以上。所述信號探針體現(xiàn)為能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的一區(qū)域互補(bǔ)性地結(jié)合，這種情況下，對于所述增幅標(biāo)的核酸，所述信號探針的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域與所述捕獲探針的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域不同。因此，所述捕獲探針及信號探針能夠與增幅標(biāo)的核酸互補(bǔ)性地結(jié)合。即，PCR進(jìn)行過程中，隨著所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部中標(biāo)的核酸的增幅，增幅標(biāo)的核酸與對所述固定化層940進(jìn)行表面處理的捕獲探針互補(bǔ)性地結(jié)合，同時，與連接到金屬納米粒子的信號探針互補(bǔ)性地結(jié)合，將所述金屬納米粒子集中在接近所述固定化層940的區(qū)域。其結(jié)果，所述金屬納米粒子無法到達(dá)所述檢測電極26，弓丨起所述金屬納米粒子與所述檢測電極26之間的電流變化(減少)，產(chǎn)生根據(jù)標(biāo)的核酸的增幅的可檢測電化學(xué)信號。另外，所述增幅標(biāo)的核酸、所述捕獲探針及所述信號探針可以是單鏈DNA0
[0080]所述檢測電極950布置于所述反應(yīng)腔室910的至少一個區(qū)域而檢測所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部產(chǎn)生的電化學(xué)信號。所述檢測電極950為了實施所述的功能而能夠體現(xiàn)為多種材質(zhì)，例如，從金(Au)、鈷(Co)、鈾金(Pt)、銀(Ag)、碳納米管(carbon nanotube)、石墨稀(graphene)及碳(Carbon)構(gòu)成的群中選擇I個以上。并且，所述檢測電極950為了有效檢測所述反應(yīng)腔室910內(nèi)部產(chǎn)生的電化學(xué)信號而能夠體現(xiàn)為多種形狀及結(jié)構(gòu)，例如，根據(jù)所述反應(yīng)腔室910的任意表面布置的金屬材質(zhì)的板形狀。另外，所述電化學(xué)信號是通過電化學(xué)信號測定模塊800測定，可具有多種所述電化學(xué)信號測定模塊，可從陽極溶出伏安法(anodicstripping voltammetry，ASV)、計時電流法(chrono amperometry，CA)、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry )、方波伏安法(square wave vol tammetry，SWV)、方波伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)及阻抗(impedance)構(gòu)成的群中選擇。所述電化學(xué)信號起因于所述增幅標(biāo)的核酸與所述捕獲探針及信號探針互補(bǔ)性地結(jié)合而產(chǎn)生的電流變化。根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置的電化學(xué)信號發(fā)生過程如下。第I步驟包括:在PCR開始之前，包括在固定化(immobilizat1n)層進(jìn)行表面處理的捕獲探針(capture probe)、信號探針(signaling probe)及金屬納米粒子的復(fù)合體(signaling probe-metal nanoparticle)的原來狀態(tài);第2步驟包括:根據(jù)所述檢測電極(working electrode)與金屬納米粒子之間的還原或氧化而產(chǎn)生的電流變化(信號，Signal);第3步驟包括:在PCR開始之后，增幅標(biāo)的核酸(target DNA)與所述捕獲探針(capture probe)及所述復(fù)合體(signalingprobe-metal nano particle)的信號探針(signaling probe)結(jié)合而減少電流變化(信號減少)的步驟。
[0081 ] 更具體地說，向所述復(fù)合體(signaling probe-metal nano particle)的金屬納米粒子(metal nano part i cIe )施加還原電壓后，所述金屬納米粒子(metal nanoparticle)聚集在所述檢測電極(working electrode)的鄰近表面而形成積累層而被還原(Accumulat1n of metal nano particle)，然后，向所述檢測電極(working electrode)施加電壓，所述還原金屬納米粒子(metal nano particle)被氧化(Stripping)而產(chǎn)生電流變化，即產(chǎn)生信號(Signal)，可通過氧化電流峰值所呈現(xiàn)的電壓值，容易地測定所述電流變化。這種情況下，在所述反應(yīng)腔室內(nèi)部，電流變化值即電化學(xué)信號是指標(biāo)的核酸(targetDNA)的變化量。并且，所述金屬納米粒子(metal nano particle)被氧化的電壓值因金屬納米粒子(metal nano particle)的種類不同，若使用2個以上的金屬納米粒子(metal nanoparticle)，能夠同時檢測對2個以上的試料的信號。之后，實施PCR后，從模板核酸進(jìn)行標(biāo)的核酸(target DNA)的增幅，所述增幅標(biāo)的核酸(target DNA)與所述捕獲探針(captureprobe)及所述復(fù)合體(signaling probe-metal nano particle)的信號探針(signalingprobe)互補(bǔ)性地結(jié)合(Hybridized target DNA)而如上述地妨礙所述復(fù)合體(signalingprobe-metal nano particle)的金屬納米粒子(metal nano particle)在電極表面的積累(Accumulat1n of metal nano particle)，減少所述電流值，進(jìn)而隨著PCR周期的進(jìn)行而增加了增幅標(biāo)的核酸(target DNA)量，從而增加了與所述捕獲探針(capture probe)及所述復(fù)合體(signaling probe-metal nano particle)的信號探針(signaling probe)之間的互補(bǔ)性結(jié)合，從而更加減少所述電流值(信號)。因此，通過所述電流減少現(xiàn)象，即通過檢測及測定電化學(xué)信號而體現(xiàn)實時PCR。另外，所述檢測電極950可體現(xiàn)為多種。例如，具備產(chǎn)生氧化或還原反應(yīng)的作業(yè)電極(working electrode)950a及不產(chǎn)生氧化或還原反應(yīng)的基準(zhǔn)電極(reference electrode)950b的2_電極模塊，或如圖16，具備調(diào)整從所述作業(yè)電極950a、所述基準(zhǔn)電極950b及所述指示電極產(chǎn)生的電子平衡的對電極(counter electrode)950c的3-電極模塊。如所述，所述檢測電極950的結(jié)構(gòu)若體現(xiàn)為多-電極模塊方式，能夠提高所述反應(yīng)腔室內(nèi)部產(chǎn)生的電化學(xué)信號的靈敏度，能夠容易地檢測及測定產(chǎn)生的信號。
[0082]根據(jù)圖18，所述電化學(xué)信號測定模塊800能夠通過電氣性連接工具700，例如引線而可導(dǎo)電地連接到所述PCR芯片900的任意芯片夾具(未圖示)的連接端口。因此，在所述PCR芯片900的反應(yīng)腔室910內(nèi)部，根據(jù)依次的核酸增幅重復(fù)產(chǎn)生的電化學(xué)信號可通過所述PCR芯片900的檢測電極950而依次檢測，所述檢測的信號經(jīng)由所述芯片夾具的連接端口及所述電氣性連接工具700而在所述電化學(xué)信號測定模塊800進(jìn)行測定，進(jìn)而加工或分析。所述電化學(xué)信號測定模塊8 O O可體現(xiàn)為多種，可從陽極溶出伏安法(an ο d i c strippingvo I tammetry , ASV)、計時電流法(chrono amperometry，CA)、循環(huán)伏安法(eye I i cvoltammetry)、方波伏安法(square wav evoltammetry,SffV)，方波伏安法(differentialpulse voltammetry，DPV)及阻抗(impedance)構(gòu)成的群中選擇。
[0083]根據(jù)圖18，實施根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置的PCR時，可實時(real-time)測定及分析核酸增幅過程。這種情況下，與根據(jù)本發(fā)明的一實施例的第IPCR裝置不同，所述試料及試劑無需添加另外的熒光物質(zhì)。例如，PCR試料及試劑溶液根據(jù)所述PCR芯片900的滑動而在所述反應(yīng)腔室910內(nèi)，連續(xù)通過所述第I加熱器110的上側(cè)對應(yīng)部分及所述第2加熱器120的上側(cè)對應(yīng)部分302而實施變性步驟及退火/延長步驟，這種情況下，增幅核酸在所述第I加熱器110及第2加熱器120的任意的位置，通過控制所述單向滑動驅(qū)動工具990而減緩移動速度或暫時維持停止?fàn)顟B(tài)后，通過所述檢測電極950依次實時檢測及測定因增幅標(biāo)的核酸與所述捕獲探針及所述復(fù)合體的信號探針的互補(bǔ)性結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號(電流變化)。因此，PCR各循環(huán)周期的進(jìn)行過程中，在所述反應(yīng)腔室910內(nèi)(無熒光物質(zhì)及光檢測系統(tǒng))，實時(real-time)監(jiān)測根據(jù)核酸的增幅產(chǎn)生的反應(yīng)結(jié)果，從而能夠?qū)崟r(real-time)檢測及測定標(biāo)的核酸的量。
[0084]圖19圖示與根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置相聯(lián)的芯片等待部1000。
[0085]根據(jù)圖19，所述PCR裝置還可具備:芯片等待部1000，收容可驅(qū)動地連接的多個PCR芯片900(芯片編號1、2、3、4、5)，從而在第1卩0?芯片900(芯片編號1)與所述卩0?加熱組合單元100依次進(jìn)行熱接觸后，第2PCR芯片900(芯片編號2)能夠開始與所述PCR加熱組合單元100的熱接觸。芯片等待部1000可具備多個?0?芯片900(芯片編號1、2、3、4、5)。收容到芯片等待部1000的PCR芯片可包括多種樣品，根據(jù)其收容空間的大小，可具有大于圖19中收容的數(shù)量(5個)。例如，PCR加熱組合單元100與第IPCR芯片900(芯片編號I)依次熱接觸而開始第IPCR后，第IPCR芯片900(芯片編號I)通過組件995的芯片排出口 995b向外部移動，開放組件995的芯片投入口 995a，根據(jù)另外的驅(qū)動工具(未圖示)收容到芯片等待部1000的第2PCR芯片900(芯片編號2)移動到PCR加熱組合單元100上，與PCR加熱組合單元100依次進(jìn)行熱接觸而開始第2PCR。這種情況下，所述第2PCR芯片900(芯片編號2)通過芯片投入口 995a之前，安裝到組件995的另外的傳感器識別第2PCR芯片900(芯片編號2)并重新設(shè)置(setting)組件995內(nèi)條件，例如PCR加熱組合單元100的溫度條件、PCR測定裝置的反應(yīng)條件。上述的一系列過程可重復(fù)進(jìn)行到收容于芯片等待部1000的多個PCR芯片的PCR反應(yīng)完成為止。因具備上述的芯片等待部1000，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置能夠同時、依次迅速地實施對多個樣品及試料的PCR。
[0086]圖20是圖示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置的PCR試驗結(jié)果的電泳照片。
[0087]根據(jù)圖20，可使用根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置而確認(rèn)實施PCR的結(jié)果，電泳照片中標(biāo)示的“M”是指size marker (尺寸標(biāo)記)，各數(shù)字表示實施PCR的試料編號。能夠確認(rèn)可通過本實驗而在非常快速的時間，約15分鐘內(nèi)，同時實施對多個試料的PCR。因此，若使用根據(jù)本發(fā)明的一實施例的PCR裝置，相比使用現(xiàn)有單一加熱器方式的多個孔類型PCR反應(yīng)容器或多個加熱器方式的單一流路類型PCR反應(yīng)容器，能夠較大地減少PCR芯片的大小，減少試料的量，大大縮短PCR時間，能夠同時進(jìn)行對大量試料的PCR，有效地改善現(xiàn)有PCR裝置的問題。
【主權(quán)項】
1.一種PCR裝置，其特征在于，包括: PCR加熱組合單元，在基板上部面重復(fù)地隔離布置2個以上的加熱器； 板形狀的PCR芯片，具備重復(fù)體現(xiàn)的2個以上的反應(yīng)腔室，當(dāng)接觸所述PCR加熱組合單元時，與布置于所述PCR加熱組合單元的2個以上的各加熱器相接;及 單向滑動驅(qū)動工具，安裝所述PCR芯片的狀態(tài)下，維持所述PCR芯片與所述PCR加熱組合單元之間的接觸地體現(xiàn)滑動，所述滑動時，使得從所述PCR芯片的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的反應(yīng)腔室與從所述PCR加熱組合單元的一末端向另一末端重復(fù)布置的2個以上的加熱器之間依次發(fā)生熱接觸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述2個以上的加熱器中鄰接的加熱器具有不同的溫度。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述2個以上的加熱器在所述PCR加熱組合單元的一末端加熱器中開始PCR的第I循環(huán)，在所述PCR加熱組合單元的另一末端加熱器中結(jié)束PCR的最后循環(huán)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述PCR芯片的反應(yīng)腔室體現(xiàn)為: 向所述PCR芯片的滑動方向隔離布置2個以上；或向與所述PCR芯片的滑動方向相垂直的方向隔離布置2個以上;或向與所述PCR芯片的滑動方向相垂直的方向連續(xù)通過的流路形??τ O5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述PCR芯片的反應(yīng)腔室體現(xiàn)為具有流入部/流出部整合型孔形態(tài)或流入部/流出部不同流路形態(tài)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 還包括:光源，向所述PCR芯片的反應(yīng)腔室提供光;及 光檢測部，收容從所述PCR反應(yīng)部放出的光。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PCR裝置，其特征在于， 所述光源或光檢測部重復(fù)布置于所述PCR加熱組合單元的鄰接加熱器之間的空間。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PCR裝置，其特征在于， 所述光源或光檢測部對應(yīng)所述PCR芯片的移動路徑而移動。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述PCR芯片具備檢測電極，用于檢測所述反應(yīng)腔室的內(nèi)部因增幅核酸與活性物質(zhì)的結(jié)合而產(chǎn)生的電化學(xué)信號。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的PCR裝置，其特征在于， 還包括:電化學(xué)信號測定模塊，與所述檢測電極電氣性地連接而能夠?qū)崟r測定所述PCR芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)部發(fā)生的電化學(xué)信號。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 所述PCR芯片具備:固定化(immobilizat1n)層，用形成于所述反應(yīng)腔室內(nèi)部的一區(qū)域而能夠與增幅標(biāo)的核酸的一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的捕獲探針(capture probe)進(jìn)行了表面處理;及檢測電極，形成于所述反應(yīng)腔室內(nèi)部的另一區(qū)域而檢測電化學(xué)信號，并且包括:復(fù)合體，具備金屬納米粒子及連接到所述金屬納米粒子而能夠與所述增幅標(biāo)的核酸的另一區(qū)域互補(bǔ)性結(jié)合的信號探針(signaling probe)。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的PCR裝置，其特征在于， 還包括:電化學(xué)信號測定模塊，與所述檢測電極電氣性地連接而實時測定所述PCR芯片的反應(yīng)腔室內(nèi)部發(fā)生的電化學(xué)信號。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR裝置，其特征在于， 還具備:收容多個PCR芯片的芯片等待部，第IPCR芯片與所述PCR加熱組合單元依次進(jìn)行熱接觸之后，為了使第2PCR芯片與所述PCR加熱組合單元開始熱接觸而可驅(qū)動地連接。
【文檔編號】C12Q1/68GK105940097SQ201580006243
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年2月9日
【發(fā)明人】金成佑
【申請人】納米生物系統(tǒng)株式會社