用于治療血友病的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文公開用于將編碼涉及凝血的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因序列插入細(xì)胞的基因組中以治療包括血友病的病狀的方法和組合物。在一個(gè)方面，本文描述非天然存在的鋅指蛋白(ZFP)，該鋅指蛋白結(jié)合至基因組中所關(guān)注區(qū)域(例如白蛋白基因)中的靶位點(diǎn)，其中ZFP包含一個(gè)或多個(gè)工程化的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別白蛋白基因中的靶位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，鋅指蛋白質(zhì)包含稱為并且排序?yàn)镕1至F5或F1至F6的五個(gè)或六個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，如表1的單行中示出。
【專利說(shuō)明】
用于治療血友病的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年12月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/913,838和2014年2月24日 提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/943,884的權(quán)益，其公開內(nèi)容全部以引用方式并入本文。
[0003] 在聯(lián)邦科研資助下進(jìn)行的本發(fā)明權(quán)利的聲明
[0004] 不適用。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本公開是涉及基因修飾和血友病治療領(lǐng)域。
[0006] 背景
[0007] 血友病諸如甲型血友病和乙型血友病，是凝血系統(tǒng)的遺傳病癥，其特征是出血至 關(guān)節(jié)和軟組織中，和過(guò)量出血至經(jīng)歷外傷或經(jīng)歷手術(shù)的任何位點(diǎn)。甲型血友病在臨床上與 乙型血友病難分辨，但是因子VIII (FVIII或F8)在甲型血友病中缺乏或不存在，而因子IX (FIX或F. IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或不存在。因子VIII基因編碼血漿糖蛋白，所 述血漿糖蛋白以其非活性形式與馮威勒布蘭德氏因子相關(guān)聯(lián)地進(jìn)行循環(huán)。在表面損傷后， 內(nèi)在凝血級(jí)聯(lián)啟始并且因子VIII從復(fù)合物中釋放并且變得活化?；罨问脚c因子IX-起操 作來(lái)激活因子X變成活化Xa，最后導(dǎo)致纖維蛋白原變化至纖維蛋白和凝結(jié)誘導(dǎo)。參見， Levinson等人（1990)Genomics7(l): 1-11。40-50%的甲型血友病患者患有涉及因子VIII內(nèi) 含子22的染色體倒位(也稱為IVS22)。倒位的原因是因子VIII基因的內(nèi)含子22中的9.6kb序 列與位于因子VIII基因遠(yuǎn)側(cè)約300kb處的兩個(gè)密切相關(guān)反向序列中的一個(gè)之間的染色體內(nèi) 重組事件，導(dǎo)致相對(duì)于外顯子23至26的外顯子1至22倒位。參見，Textbook of Hemophilia, Lee等人(編）2005,Blackwell Publishing。其他甲型血友病患者在因子VIII中具有缺陷， 包括活性位點(diǎn)突變，和無(wú)義和錯(cuò)義突變。就其本身來(lái)說(shuō)，因子IX(F. IX或FIX)編碼涉及凝血 系統(tǒng)的絲氨酸蛋白水解酶中的一個(gè)，并且已經(jīng)證明恢復(fù)野生型因子IX蛋白質(zhì)的正常循環(huán)水 平的甚至3%可預(yù)防自發(fā)出血。額外血友病與其他凝血因子的異常表達(dá)相關(guān)聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)， 因子VII缺陷是在300，000至500，000人中的約1個(gè)人中發(fā)生的常染色體隱性性狀并且與患 者體內(nèi)的不適當(dāng)因子VII水平相關(guān)聯(lián)。類似地，因子X缺陷也是在每500,000至1百萬(wàn)人中的1 個(gè)人中發(fā)生的常染色體隱性性狀，并且由FX基因的遺傳變體導(dǎo)致。因子X缺陷可在患者群體 中具有不同程度的嚴(yán)重性。
[0008] 乙型血友病的當(dāng)前治療依賴于長(zhǎng)期、重復(fù)靜脈內(nèi)輸注純化重組因子IX并且受許多 缺點(diǎn)影響。這包括需要重復(fù)靜脈內(nèi)輸注，與抑制劑形成相關(guān)聯(lián)，并且是預(yù)防性而非治愈性 的。
[0009] 已經(jīng)描述患有甲型或乙型血友病的患者的基因療法，其涉及引入質(zhì)粒和編碼功能 因子VIII或因子IX蛋白質(zhì)的其他載體(例如，AAV)。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,936,243;7,238， 346和6,200,560;511丨等人（2007)了1'1^〇11113此6111〇81(2):352-61 ;1^6等人（2004) Pharm. Res .7:1229-1232; Graham等人（2008) Genet Vaccines Ther · 3 :6-9 ;Manno 等人 (2003)Blood 101(8):2963-72;Manno等人（2006)Nature Medicin e 12(3):342-7; Nathwani等人（2011)Molecular Therapy 19(5) :876_85;Nathwani等人（2011) ;N Engl J Med. 365(25): 2357-65。然而，在這些方案中，形成抑制性抗-因子VIII或IX(抗48或抗_ F. IX)抗體和針對(duì)遞送媒介物的抗體仍然是血友病的基于因子VIII和因子IX替換的療法的 主要并發(fā)癥。參見例如Scott&Lozier(2012)Br J Hae matol. 156(3):295-302。
[0010] 已經(jīng)描述基因組DNA的靶向裂解的各種方法和組合物。這些靶向裂解事件可用于 例如誘導(dǎo)靶向誘變、誘導(dǎo)細(xì)胞DNA序列的靶向缺失，和促進(jìn)預(yù)定染色體基因座處的靶向重 組。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)8,623,618 ;8,034,598 ;8,586,526 ;6,534,261 ;6,599,692 ;6， 503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951, 925 ;8，110,379;8,409,861;美國(guó)專利公布 20030232410;20050208489;20050026157; 20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104； 20130122591; 20130177983和20130177960和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?4/278,903,其公開內(nèi)容出于所有 目的以引用方式全部并入。這些方法經(jīng)常涉及使用工程化裂解系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)雙鏈斷裂(DSB) 或靶DNA序列中的切口以使得通過(guò)產(chǎn)生誤差的過(guò)程諸如非同源末端連接(NHEJ)來(lái)修復(fù)斷裂 或使用修復(fù)模板的修復(fù)（同源性引導(dǎo)修復(fù)或HDR)可產(chǎn)生基因的剔除或插入所關(guān)注的序列 (靶向整合）。此技術(shù)也可用于經(jīng)由使用供體寡核苷酸來(lái)在基因組序列中引入位點(diǎn)特異性變 化，包括引入基因組區(qū)域的特異性缺失，或特異性點(diǎn)突變或局部改變(也稱為基因校正）。裂 解可經(jīng)由使用特異性核酸酶諸如工程化鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應(yīng)核酸酶(TAL EN)來(lái)發(fā)生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA('單一引導(dǎo)RNA'）的CRISPR/Cas系統(tǒng)來(lái)引 導(dǎo)特異性裂解。此外，開發(fā)基于Argonaute系統(tǒng)（例如，來(lái)自嗜熱棲熱菌，被稱為'TtAgo'，參 見Swarts等人（2014)Nature 507(7491) :258-261)的靶向核酸酶，所述系統(tǒng)還可具有用于 基因組編輯和基因療法的潛力。
[0011] 如與典型整合方法相比，此核酸酶介導(dǎo)的靶向轉(zhuǎn)基因插入方法提供改進(jìn)轉(zhuǎn)基因表 達(dá)、增加安全和表達(dá)持久性的希望，因?yàn)樗试S精確轉(zhuǎn)基因定位以將基因沉默或活化相鄰 致癌基因的風(fēng)險(xiǎn)減少到最低限度。
[0012] 轉(zhuǎn)基因可靶向整合至其同源基因座中，例如，將野生型轉(zhuǎn)基因插入內(nèi)源性基因座 以校正突變基因?；蛘?，轉(zhuǎn)基因可插入非同源基因座例如"安全港"基因座中。已經(jīng)描述一些 安全港基因座，包括(〇5、!^1^4￥31、1^ &和白蛋白。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)7,951，925和 8,110,379;美國(guó)公布號(hào)20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983和20130177960和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?14/278,903。舉例來(lái) 說(shuō)，美國(guó)專利公布號(hào)20110027235涉及將功能性蛋白質(zhì)靶向整合至分離干細(xì)胞中并且美國(guó) 公布號(hào)20120128635描述治療乙型血友病的方法。也參見Li等人（2011 )Nature 475(7355): 217-221 和 Anguela 等人（2013)Bloodl22:3283-3287。
[0013] 然而，仍然需要治療血友病的額外組合物和方法。
[0014] 概述
[0015]本文公開用于靶向整合編碼蛋白質(zhì)，諸如功能凝血因子蛋白質(zhì)（例如，因子VII、因 子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI)的序列的方法和組合物。功能因子VIII("F8"）和/或因 子IX("F. IX"或"FIX"）蛋白質(zhì)的表達(dá)可導(dǎo)致例如治療和/或預(yù)防甲型血友?。ㄒ蜃覸III)和/ 或乙型血友?。ㄒ蜃覫X)，而功能因子VII或因子X的表達(dá)可治療或預(yù)防與因子VII和/或因子 X缺陷相關(guān)聯(lián)的血友病。核酸酶，例如工程化大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸酶 (TALEN，包括TALE效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與來(lái)自限制性內(nèi)切酶和/或大范圍核酸酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域的 融合(諸如兆TALE和緊湊TALEN))、Ttago系統(tǒng)和/或CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)用于在基因所插 入的細(xì)胞中使'安全港'基因座（例如CCR5、AAVS1、HPRT、Ro sa或白蛋白）處的DNA裂解。供體 轉(zhuǎn)基因的靶向插入可經(jīng)由同源性引導(dǎo)修復(fù)(HDR)或非同源性修復(fù)機(jī)制（例如，NHEJ供體捕 獲）。核酸酶可誘導(dǎo)靶DNA中的雙鏈(DSB)或單鏈斷裂(切口）。在一些實(shí)施方案中，使用兩個(gè) 切口酶通過(guò)引入兩個(gè)切口來(lái)產(chǎn)生DSB。在一些情況下，切口酶是ZFN，而在其他情況下，切口 酶是TALEN或CRISPR/Cas切口酶。在一些實(shí)施方案中，方法和組合物涉及結(jié)合至細(xì)胞中的白 蛋白基因的至少一種蛋白質(zhì)。
[0016] 在一方面，本文描述的是非天然存在的鋅指蛋白（ZFP)，該鋅指蛋白結(jié)合至基因組 中所關(guān)注的區(qū)域(例如白蛋白基因）中的靶位點(diǎn)，其中ZFP包含一個(gè)或多個(gè)工程化的鋅指結(jié) 合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，ZFP是裂解所關(guān)注靶基因組區(qū)域的鋅指核酸酶(ZFN)，其中 ZFN包含一個(gè)或多個(gè)工程化的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解 結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域可以例如從各種限制性內(nèi)切核酸酶和/或歸巢內(nèi)切核酸酶中獲得。 在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解半結(jié)構(gòu)域從IIS型限制性內(nèi)切核酸酶(例如，F(xiàn)ok I)中得到。在某些 實(shí)施方案中，鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別白蛋白基因中的靶位點(diǎn)，例如具有如在表1的單行中所示來(lái)排 序的識(shí)別螺旋結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。在一些實(shí)施方案中，鋅指蛋白質(zhì)包括稱為并且排序?yàn)镕1 至F5或F1至F6的五個(gè)或六個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，如表1的單行中示出。
[0017] 在另一方面，本文描述轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應(yīng)(TALE)蛋白質(zhì)，其結(jié)合至基因組中的所 關(guān)注的區(qū)域(例如，白蛋白基因）中的靶位點(diǎn)，其中TALE包含一個(gè)或多個(gè)工程化TALE結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，TALE是裂解所關(guān)注靶基因組區(qū)域的核酸酶(TALEN)，其中TALEN包 含一個(gè)或多個(gè)工程化的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié) 構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域可以例如從各種限制性內(nèi)切核酸酶和/或歸巢內(nèi)切核酸酶(大范圍核 酸酶）中獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解半結(jié)構(gòu)域從IIS型限制性內(nèi)切核酸酶(例如，F(xiàn)ok I) 中得到。在其他實(shí)施方案中，裂解結(jié)構(gòu)域從大范圍核酸酶得到，所述大范圍核酸酶結(jié)構(gòu)域還 可展現(xiàn)DNA結(jié)合功能。
[0018] 在另一方面，本文描述結(jié)合至基因組中的所關(guān)注的區(qū)域(例如，白蛋白基因）中的 靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas系統(tǒng)包括一種或多種工程化單一引導(dǎo)RNA或功 能等效物，以及Cas9核酸酶。
[0019] 如本文描述的核酸酶（例如，ZFN、CRISPR/Cas系統(tǒng)、Ttago和/或TALEN)可結(jié)合至 且/或裂解在基因內(nèi)或在基因附近的編碼或非編碼區(qū)域中的所關(guān)注的區(qū)域，例如像，前導(dǎo)序 列、尾隨序列或內(nèi)含子，或在編碼區(qū)域上游或下游的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，核酸 酶(例如，ZFN)結(jié)合至且/或裂解白蛋白基因。
[0020] 在另一方面，本文描述編碼一種或多種核酸酶(例如，本文描述的ZFN、CRISPR/Cas 系統(tǒng)、Ttago和/或TALEN)或其他蛋白質(zhì)的多核苷酸。多核苷酸可以是例如mRNA。在一些方 面，mRNA可化學(xué)修飾（參見例如Kormann等人（2011 )Nature Biotechnology29(2): 154-157)。在其他方面，mRNA可包含ARCA帽（參見美國(guó)專利7,074,596和8,153,773)。在其他實(shí)施 方案中，mRNA可包含未修飾和修飾核苷酸的混合物(參見美國(guó)專利公布2012-0195936)。 [0021] 在另一方面，本文描述的是表達(dá)載體（例如ZFN、CRISPR/Cas系統(tǒng)、Ttago和/或 TALEN表達(dá)載體），其包含有效地連接至啟動(dòng)子的編碼如本文描述的一種或多種蛋白質(zhì)的多 核苷酸，所述蛋白質(zhì)包括核酸酶(例如，ZFN、CRISPR/Cas系統(tǒng)、Ttago和/或TALEN)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，表達(dá)載體是病毒載體。在一方面，病毒載體展現(xiàn)組織特異性趨向性。
[0022] 在另一方面，本文描述宿主細(xì)胞，其包含一種或多種表達(dá)載體，包括核酸酶(例如， ZFN、CRI SPR/Cas 系統(tǒng)、Ttago 和/或 TALEN)表達(dá)載體。
[0023] 在另一方面，提供包含如本文描述的表達(dá)載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中， 藥物組合物可包含一種以上表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含包含第一多核 苷酸的第一表達(dá)載體，和包含第二多核苷酸的第二表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，第一多核 苷酸和第二多核苷酸是不同的。在一些實(shí)施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸是大致 上相同的。藥物組合物可進(jìn)一步包含供體序列（例如，因子IX供體序列）。在一些實(shí)施方案 中，供體序列與表達(dá)載體相關(guān)聯(lián)。
[0024] 在一方面，本發(fā)明方法和組合物包括遺傳修飾細(xì)胞，所述細(xì)胞包括表達(dá)在血友病 中異常表達(dá)的功能形式蛋白質(zhì)（因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白質(zhì)）的 轉(zhuǎn)基因，其中轉(zhuǎn)基因整合至細(xì)胞基因組的內(nèi)源性安全港基因（例如，白蛋白基因）中。在某些 實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因使用至少一種核酸酶以位點(diǎn)特異性(靶向）方式來(lái)整合。在某些實(shí)施方 案中，核酸酶(例如，ZFN、TALEN、Ttago和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)）對(duì)于安全港基因（例如CCR5、 即1?1^厶￥31、1^ &或白蛋白具有特異性。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,951，925和8，110,379;美國(guó) 公布號(hào)20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983和20130177960和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?14/278,903)。在一些實(shí)施方案中， 安全港是白蛋白基因。
[0025] 在另一方面，本文描述在體外和/或體內(nèi)遺傳修飾細(xì)胞以產(chǎn)生因子VII、因子VIII、 因子IX、因子X和/或因子XI的方法，所述方法包括使用一種或多種核酸酶（例如，ZFN、 TALEN、CRISPR/Cas)來(lái)裂解細(xì)胞中的內(nèi)源性安全港基因以使得編碼因子VII、因子VIII、因 子IX、因子X和/或因子XI的轉(zhuǎn)基因整合至安全港基因座中并且在細(xì)胞中表達(dá)。在某些實(shí)施 方案中，安全港基因是3〇^5、冊(cè)1^、六六￥51、1? 〇^或白蛋白基因。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞 是人細(xì)胞。在一組實(shí)施方案中，提供裂解細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞）中的白蛋白基因的方法，包括 將本文公開的一種或多種表達(dá)載體在使得表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)并且裂解白蛋白基因的 條件下引入細(xì)胞中。白蛋白基因可例如通過(guò)將供體序列整合至所裂解的白蛋白基因中來(lái)修 飾。
[0026] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括遺傳修飾細(xì)胞以產(chǎn)生因子IX，所述方法包括向 細(xì)胞施用表1示出的鋅指核酸酶(ZFN)(或編碼這些ZFN的多核苷酸)和編碼因子IX蛋白質(zhì)的 供體。ZFN和供體可以任何組合存在于相同或不同載體上，例如在各自攜帶一種組分的3個(gè) 獨(dú)立AAV載體上;在攜帶兩種組分的一個(gè)載體和攜帶第3種組分的獨(dú)立載體上;或在攜帶所 有3種組分的一個(gè)載體上。
[0027] 在另一方面，本文提供用于提供在哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如人靈長(zhǎng)類動(dòng)物， 諸如患有甲型血友病的人患者中缺少或缺陷的功能性蛋白質(zhì)（例如，因子VIII)的方法，例 如用于治療甲型血友病。在一些情況下，功能蛋白質(zhì)是循環(huán)血漿蛋白質(zhì)。在一些情況下，功 能蛋白質(zhì)是非循環(huán)血漿蛋白質(zhì)。在一些情況下，功能蛋白質(zhì)可為肝臟特定的。在另一方面， 本文提供用于提供在哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如患有乙型血友病的 人患者中缺少或缺陷的功能性蛋白質(zhì)(例如，因子IX)的方法，例如用于治療乙型血友病。在 另一方面，本文提供用于向哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如人患者提供 功能性蛋白質(zhì)（例如因子VII)以治療與因子VII缺陷相關(guān)聯(lián)的血友病的方法。在另一方面， 本文提供用于提供功能性蛋白質(zhì)(例如因子X)以治療與因子X缺陷相關(guān)聯(lián)的血友病的方法。 在另一方面，本文提供用于提供治療與因子XI缺陷相關(guān)聯(lián)的血友病的功能蛋白質(zhì)（例如因 子XI)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使用核酸酶以將編碼功能性因子VII、因子 VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白質(zhì)的序列整合至有需要的受試者的細(xì)胞中。在其他實(shí) 施方案中，所述方法包括將遺傳修飾細(xì)胞(表達(dá)在患有血友病的受試者中異常表達(dá)的功能 形式蛋白質(zhì))施用至受試者。因此，分離的細(xì)胞可引入受試者中（離體細(xì)胞療法)或細(xì)胞可在 它是受試者的一部分(在體內(nèi)）時(shí)加以修飾。還提供使用本文描述的供體和/或核酸酶用于 治療血友?。ɡ纾靡蜃覸III供體治療甲型血友病，用因子IX供體治療乙型血友病，用因 子VII治療因子VII缺陷，用因子X治療因子X缺陷和/或用因子XI治療因子XI缺陷），例如，在 制備用于治療血友病的藥物中。在某些實(shí)施方案中，因子VIII蛋白質(zhì)包括B-結(jié)構(gòu)域缺失。在 某些實(shí)施方案中，因子VIII-和/或因子IX-編碼序列使用病毒載體、非病毒載體(例如，質(zhì) 粒)和/或其組合來(lái)遞送。
[0028] 在所描述的任何組合物和方法中，核酸酶和/或轉(zhuǎn)基因可在AAV載體上攜帶，包括 但不限于 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 和 AAVrhlO 或假型 AAV 諸如 AAV2/8、 AAV8.2、AAV2/5和AAV2/6等。在一些實(shí)施方案中，AAV載體是AAV2/6載體。在某些實(shí)施方案 中，核酸酶和轉(zhuǎn)基因供體使用相同AAV載體類型來(lái)遞送。在其他實(shí)施方案中，核酸酶和轉(zhuǎn)基 因供體使用不同AAV載體類型來(lái)遞送。核酸酶和轉(zhuǎn)基因可使用一個(gè)或多個(gè)載體來(lái)遞送，例 如，一個(gè)載體攜帶轉(zhuǎn)基因和核酸酶;兩個(gè)載體，其中一個(gè)攜帶核酸酶(例如，例如具有2A肽的 ZFN對(duì)的左和右ZFN)并且一個(gè)攜帶轉(zhuǎn)基因；或三個(gè)載體，其中一個(gè)載體攜帶核酸酶對(duì)的一個(gè) 核酸酶(例如，左ZFN)，單獨(dú)載體攜帶核酸酶對(duì)中的另一個(gè)核酸酶(例如，右ZFN)并且第三個(gè) 單獨(dú)載體攜帶轉(zhuǎn)基因。參見圖2。在使用兩個(gè)或更多個(gè)載體的實(shí)施方案中，載體可以相同濃 度或以不同比率來(lái)使用，例如，轉(zhuǎn)基因供體載體可用比核酸酶載體高2倍、3倍、4倍、5倍或更 高的濃度來(lái)施用。舉例來(lái)說(shuō)，第一核酸酶、不同于第一核酸酶的第二核酸酶和轉(zhuǎn)基因載體可 以約1:1:1、約1:1:2、約1:1:3、約1:1:4、約1:1:5、約1:1:6、約1:1:7、約1:1:8、約1:1:9、約 1:1:10、約1:1:11、約1:1:12、約1:1:13、約1:1:14、約1:1:15、約1:1:16、約1:1:17、約1:1: 18、約1:1:19或在一些情況下約1:1: 20的比率遞送。在示例性實(shí)施方案中，第一核酸酶、不 同于第一核酸酶的第二核酸酶和轉(zhuǎn)基因載體以約1:1:8的比率遞送。在某些實(shí)施方案中，核 酸酶和/或轉(zhuǎn)基因供體經(jīng)由靜脈內(nèi)（例如，門靜脈內(nèi)）施用來(lái)遞送至完整動(dòng)物的肝臟。
[0029] 在本文描述的任何組合物和方法中，由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)可包括因子VIII蛋白 質(zhì)、或修飾因子VIII蛋白質(zhì)，例如B-域缺失因子VIII(BDD-F8)或其片段。在其他實(shí)施方案 中，由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)包括因子IX蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì) 包括因子VII蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)包括因子X蛋白質(zhì)。在本文 描述的任何組合物或方法中，轉(zhuǎn)基因還包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而在其他組合物或方法中，它不 包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并且轉(zhuǎn)錄通過(guò)內(nèi)源性調(diào)控因子來(lái)調(diào)控。在另一方面，本發(fā)明方法包括用 于治療性治療有需要的受試者的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含工程化干細(xì) 胞，其包括安全港特異性核酸酶，和編碼因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋 白質(zhì)或其功能片段和/或截?cái)嘈问降霓D(zhuǎn)基因供體。在其他實(shí)施方案中，所述組合物包含工程 化干細(xì)胞，其已經(jīng)修飾并且表達(dá)編碼因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白質(zhì) 或其功能片段和/或截?cái)嘈问降霓D(zhuǎn)基因供體。
[0030] 在本文描述的任何組合物或方法中，細(xì)胞可為真核細(xì)胞。合適細(xì)胞的非限制實(shí)例 包括真核細(xì)胞或細(xì)胞系諸如分泌細(xì)胞（例如，肝臟細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、唾液腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞 等）、血細(xì)胞(紅細(xì)胞）、先驅(qū)紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、干細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、造血干細(xì)胞(例如CD34+))或內(nèi)皮細(xì)胞(例如血管、腎小球和管狀內(nèi)皮細(xì) 胞）。因此，靶細(xì)胞可為靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞，或靶細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括獸 醫(yī)動(dòng)物），例如尤其非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和以下目的哺乳動(dòng)物:嚙齒目（小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠）、兔形 目（兔）、食肉目（貓、犬)和偶蹄目（奶牛、豬、綿羊、山羊、馬）。在一些方面，祀細(xì)胞包括組織 (例如肝臟）。在一些方面，靶細(xì)胞是干細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、肝干細(xì)胞 等)或通過(guò)本文描述的任何方法的非人類動(dòng)物胚胎，然后植入胚胎以使得活動(dòng)物出生。然后 將動(dòng)物培育至性成熟并且允許產(chǎn)生后代，其中至少一些后代包括基因組修飾。細(xì)胞也可包 括胚胎細(xì)胞，例如小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞胚胎。細(xì)胞可來(lái)自任何生物體，例如 人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、兔、貓、犬或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可分離或可為生物體 (例如，受試者)的一部分。
[0031] 在本文所述的任何方法和組合物中，轉(zhuǎn)基因可整合至內(nèi)源性安全港基因中以使得 一些、全部或無(wú)內(nèi)源性基因表達(dá)，例如具有整合轉(zhuǎn)基因的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，內(nèi) 源性安全港基因是白蛋白基因并且內(nèi)源性序列是白蛋白序列。內(nèi)源性可存在于外源性蛋白 質(zhì)的氨基(N)-末端部分和/或外源性蛋白質(zhì)的羧基(C)-末端部分上。白蛋白序列可包括全 長(zhǎng)野生型或突變型白蛋白序列或，替代地，可包括部分白蛋白氨基酸序列。在某些實(shí)施方案 中，白蛋白序列(全長(zhǎng)或部分）用于增加與其融合且/或充當(dāng)載體的轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的多肽的 血清半衰期。在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含白蛋白序列并且靶向插入基因組內(nèi)的另一個(gè) 安全港。此外，轉(zhuǎn)基因可包括驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的外源性啟動(dòng)子(例如，組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)或 其表達(dá)可由內(nèi)源性控制序列(例如，內(nèi)源性白蛋白啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，供體包 括額外修飾，包括但不限于密碼子優(yōu)化、添加糖基化位點(diǎn)、截?cái)嘈问降取?br>[0032] 在一些實(shí)施方案中，提供包括鋅指蛋白質(zhì)和野生型或工程化裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半 結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，提供藥物組合物，其包含：（i )包含編碼鋅指核酸酶的多核苷 酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu)域和包含排序?yàn)镕1至F5的5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域 的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺旋區(qū)域并且其中鋅指蛋白質(zhì)的識(shí)別螺旋區(qū) 域在表1的第一行中示出（SEQ ID N0:4-8)(例如，SEQ ID N0.15);(ii)包含編碼鋅指核酸 酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu)域和包含排序?yàn)镕1至?6的6個(gè) 鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺旋區(qū)域并且其中鋅指蛋白質(zhì)的 識(shí)別螺旋區(qū)域在表1的第二行中示出（SEQ ID N0:9-14)(例如，SEQ ID如.16);和（丨^)包 含編碼因子IX蛋白質(zhì)（例如，SEQ ID NO. 17)的供體的AAV載體。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，和（iii)以約1:1:1、約1:1:2、約1:1:3、約1:1:4、約 1:1:5、約1:1:6、約1:1:7、約1:1:8、約1:1:9、約1:1:10、約1:1:11、約1:1:12、約1:1:13、約 1:1:14、約 1:1:15、約 1:1:16、約 1:1:17、約 1:1:18、約 1:1:19 或約 1:1:20 的比率提供。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，提供藥物組合物，其包含：包含與SEQ ID NO. 15具有80%、 90%、95%、99%、99.5%或99.8%或更大同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成的 第一多核苷酸，包含與SEQ ID勵(lì).16具有80%、90%、95%、99%、99.5%或99.8%或更大同 一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成的第二多核苷酸和任選地，包含與SEQ ID 勵(lì).17具有80%、90%、95%、99%、99.5%或99.8%或更大同一性的氨基酸序列或由所述氨 基酸序列組成的供體序列。
[0036]在一些實(shí)施方案中，提供藥物組合物，其包含以下或由以下組成：包含如SEQ ID NO. 15中的序列的第一多核苷酸或有所述核苷酸組成，包含如SEQ ID NO. 16中的序列或由 所述序列組成的第二多核苷酸，和任選地，包含SEQ ID NO. 17中的序列或由所述序列組成 的供體序列。
[0037] 在本文描述的任何組合物或方法中，裂解可經(jīng)由使用特異性核酸酶諸如工程化鋅 指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)來(lái)發(fā)生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA('單一引導(dǎo)RNA'）的Ttago或CRISPR/Cas系統(tǒng)來(lái)引導(dǎo)特異性裂解。在一些實(shí)施方案中，使 用兩個(gè)切口酶通過(guò)引入兩個(gè)切口來(lái)產(chǎn)生DSB。在一些情況下，切口酶是ZFN，而在其他情況 下，切口酶是TALEN或CRI SPR/Cas系統(tǒng)。靶向整合可經(jīng)由同源性引導(dǎo)修復(fù)機(jī)制(HDR)且/或經(jīng) 由非同源性修復(fù)機(jī)制(例如，NHEJ供體捕獲)來(lái)發(fā)生。如本文描述的核酸酶可結(jié)合至且/或裂 解在基因內(nèi)或在基因附近的編碼或非編碼區(qū)域中的所關(guān)注的區(qū)域，例如像，前導(dǎo)序列、尾隨 序列或內(nèi)含子，或在編碼區(qū)域上游或下游的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，核酸酶裂解 在結(jié)合位點(diǎn)（例如，表1所示結(jié)合位點(diǎn)）處或附近的靶序列。裂解可導(dǎo)致例如經(jīng)由插入、缺失 或其組合來(lái)修飾基因。在某些實(shí)施方案中，修飾在核酸酶結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)處或附近，例 如，裂解位點(diǎn)上游或下游1-300個(gè)(或在其間的任何值)堿基對(duì)內(nèi)，更優(yōu)選地結(jié)合和/或裂解 位點(diǎn)任一側(cè)的1-100個(gè)堿基對(duì)(或在其間的任何值）內(nèi)，甚至更優(yōu)選地結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)任 一側(cè)的1至50個(gè)堿基對(duì)(或在其間的任何值）內(nèi)。
[0038] 所描述的方法和組合物可用于治療或預(yù)防有需要的受試者的血友病。在一些實(shí)施 方案中，提供治療患有乙型血友病的患者的方法，包括向患者施用本文描述的任何表達(dá)載 體或藥物組合物，其中表達(dá)載體或藥物組合物介導(dǎo)編碼功能因子IX蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因靶向整 合至內(nèi)源性白蛋白基因中。在一些實(shí)施方案中，組合物包含載體并且用于靶向肝臟細(xì)胞。在 其他實(shí)施方案中，組合物包含工程化干細(xì)胞并且作為骨髓移植物來(lái)給予患者。在一些情況 下，患者在移植之前部分或完全免疫清除。在其他情況下，在內(nèi)源性基因的核酸酶介導(dǎo)的修 飾(例如，將FIX轉(zhuǎn)基因靶向整合至白蛋白基因座中）之前、期間和/或之后，患者用一種或多 種免疫抑制劑治療。
[0039] 在其他方面，本文描述治療和/或預(yù)防乙型血友病的方法，其使用包括如表1示出 的工程化鋅指核酸酶(ZFN)的系統(tǒng)（"SB-FIX"系統(tǒng)）以在體內(nèi)位點(diǎn)特異性并入人因子9(hF9) 轉(zhuǎn)基因的校正拷貝至受試者自身肝細(xì)胞的基因組中。hF9轉(zhuǎn)基因的整合靶向白蛋白基因座 的內(nèi)含子1，導(dǎo)致因子IX在血液中的穩(wěn)定、高水平、肝臟特異性表達(dá)和分泌。SB-FIX含有作為 一系列連續(xù)靜脈內(nèi)劑量來(lái)施用的三個(gè)個(gè)別重組腺病毒相關(guān)病毒血清型2/6(rAAV2/6)載體： 編碼SBS42906的第一載體(表1的SB-42906)，編碼SBS43043的第二載體（SB-43043)，和提供 編碼無(wú)啟動(dòng)子hF9轉(zhuǎn)基因的DNA修復(fù)模板的第三載體(SB-F9供體，也稱為"SB-FIX供體"）。遞 送所有三個(gè)載體導(dǎo)致：1)通過(guò)一對(duì)工程化序列特異性ZFN(SBS42906和SBS43043)在白蛋白 基因座的內(nèi)含子1的預(yù)先界定位點(diǎn)處的特異性和選擇性裂解和2)由DNA修復(fù)模板編碼的hF9 轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合至ZFN誘導(dǎo)的DNA斷裂位點(diǎn)處。將hF9轉(zhuǎn)基因安置于基因組中，和在高度表達(dá) 內(nèi)源性白蛋白基因座的控制下在受試者終生提供因子IX的持久、肝臟特異性表達(dá)。
[0040]此外，本文描述的任何方法可進(jìn)一步包括額外步驟，包括部分肝切除術(shù)或用增強(qiáng) 轉(zhuǎn)導(dǎo)且/或誘導(dǎo)肝細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期的輔助劑治療。輔助劑的實(shí)例包括γ輻照、UV輻照、氚 化核苷酸諸如胸苷、順鉑、依托泊苷、羥基脲、阿非迪霉素、潑尼松龍、四氯化碳和/或腺病 毒。
[0041 ]本文所述方法可以在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施。在某些實(shí)施方案中，將組合物引入活 的完整哺乳動(dòng)物中。在遞送時(shí)，哺乳動(dòng)物可在任何發(fā)育階段，例如，胚胎、胎兒、新生兒、嬰 兒、幼年或成年。另外，靶向細(xì)胞可為健康或患病細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，將組合物中的一 種或多種靜脈內(nèi)遞送(例如，經(jīng)由門靜脈內(nèi)到達(dá)肝臟，例如尾靜脈注射）、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌 肉內(nèi)、進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)(例如，經(jīng)由注射）、進(jìn)入肝動(dòng)脈(例如，經(jīng)由注射），和/或經(jīng)由膽道系統(tǒng)(例 如，經(jīng)由注射）。
[0042] 在一個(gè)具體方面，本文所述的方法和組合物包括治療性組合物，其包含（i )編碼 FVIII的供體轉(zhuǎn)基因（ii)核酸酶(例如，ZFN、TALEN、Ttago或CRISPR/Cas系統(tǒng)），其靶向相應(yīng) 地除了FVIII以外的內(nèi)源性基因的基因座，例如，靶向哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人，諸如血 友病患者的內(nèi)源性白蛋白基因。在某些實(shí)施方案中，治療性組合物包含在分開的獨(dú)立載體 諸如分開AAV載體中的不同量的FVII I供體轉(zhuǎn)基因和白蛋白基因特異性核酸酶，其可一起施 用(例如，混合成單一溶液或同時(shí)施用)或替代地可個(gè)別地施用(例如，在單獨(dú)溶液中以相應(yīng) 施用之間的實(shí)質(zhì)性延遲，例如，10分鐘或更長(zhǎng)、30分鐘或更長(zhǎng)、1小時(shí)或更長(zhǎng)、2小時(shí)或更長(zhǎng)、3 小時(shí)或更長(zhǎng)或更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)施用）。）。在某些實(shí)施方案中，施用治療性組合物以將FVIII供體 轉(zhuǎn)基因整合至非FVIII基因座中并且隨后表達(dá)所整合的FVIII以在哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物 或人，或血友病患者的血漿中獲得治療水平的FVIII。在某些實(shí)施方案中，治療水平的FVIII 可包括，例如，大于2 %、大于4%、大于5 %、大于6 %、大于8 %、大于10 %、大于12 %、大于 15%、大于20%、大于25%或更大臨床可接受正常血漿濃度的FVIII。替代地或另外地，治療 水平的FVII I可包括在將FVII I供體轉(zhuǎn)基因和白蛋白基因核酸酶施用至此個(gè)體之前在個(gè)別 哺乳動(dòng)物、或靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人、或血友病患者中測(cè)量的例如大于2%、大于4%、大于5%、大 于6 %、大于8 %、大于10%、大于12%、大于15%、大于20 %、大于25%、大于30 %、大于35 % 或更大血漿濃度的功能性FVII I。
[0043] 在另一個(gè)具體方面，本文所述的方法和組合物包括治療性組合物，其包含(i)編碼 FIX的供體轉(zhuǎn)基因 （i i)核酸酶（（例如，ZFN、TALEN、Ttago或CRI SPR/Cas系統(tǒng)），其靶向相應(yīng)地 除了FIX以外的內(nèi)源性基因的基因座，例如，靶向哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人，諸如血友病 患者的內(nèi)源性白蛋白基因。在某些實(shí)施方案中，治療性組合物包含在分開的獨(dú)立載體諸如 分離AAV載體中的不同量的FIX供體轉(zhuǎn)基因和白蛋白基因特異性核酸酶，其可一起施用（例 如，混合成單一溶液或同時(shí)施用）或替代地可個(gè)別地施用（例如，在單獨(dú)溶液中以相應(yīng)施用 之間的實(shí)質(zhì)性延遲，例如，10分鐘或更長(zhǎng)、30分鐘或更長(zhǎng)、1小時(shí)或更長(zhǎng)、2小時(shí)或更長(zhǎng)、3小時(shí) 或更長(zhǎng)或更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)施用）。在某些實(shí)施方案中，施用治療性組合物以將FIX供體轉(zhuǎn)基因整 合至非FIX基因座中并且隨后表達(dá)所整合的FIX以在哺乳動(dòng)物，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人，或血友 病患者的血漿中獲得治療水平的FIX。在某些實(shí)施方案中，治療水平的FIX可包括，例如，大 于2%、大于4%、大于5%、大于6%、大于8%、大于10%、大于12%、大于15%、大于20%、大 于25%或更大臨床可接受正常血漿濃度的FIX。替代地或另外地，治療水平的FIX可包括在 將FIX供體轉(zhuǎn)基因和白蛋白基因核酸酶施用至此個(gè)體之前在個(gè)別哺乳動(dòng)物、或靈長(zhǎng)類動(dòng)物 或人、或血友病患者中測(cè)量的例如大于2%、大于4%、大于5%、大于6%、大于8%、大于 10%、大于12%、大于15%、大于20%、大于25 %、大于30%、大于35%或更大血漿濃度的功 能性FIX。
[0044] 為了將組合物靶向至具體類型細(xì)胞，例如，血小板、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等，施用的 組合物中的一種或多種可與特異性結(jié)合至細(xì)胞表面受體的歸巢劑相關(guān)聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)，載體 可偶聯(lián)至配體(例如，半乳糖），某些肝系統(tǒng)細(xì)胞具有針對(duì)所述配體的受體。偶聯(lián)可為共價(jià) 的，例如，交聯(lián)劑諸如戊二醛，或非共價(jià)的，例如，抗生物素化配體結(jié)合至生物素化載體。另 一種形式的共價(jià)偶聯(lián)通過(guò)將用于制備載體原料的AAV輔助質(zhì)粒工程化來(lái)提供以使得所編碼 的外殼蛋白中的一種或多種是原生A A V外殼蛋白和肽或蛋白質(zhì)配體的混合物，從而使配體 暴露于病毒顆粒的表面上。
[0045] 還提供試劑盒，其包括本發(fā)明的組合物（例如，表達(dá)載體、遺傳修飾細(xì)胞、ZFP、 CRI SPR/Cas系統(tǒng)和/或TALEN和任選地轉(zhuǎn)基因供體）。試劑盒可以包括編碼核酸酶的核酸(例 如包含在適合表達(dá)載體中RNA分子或核酸酶編碼基因）、供體分子、適合的宿主細(xì)胞系、用于 實(shí)施本發(fā)明方法的說(shuō)明書等。
[0046] 這些和其他方面鑒于總體公開內(nèi)容易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知。
[0047] 附圖簡(jiǎn)述
[0048]圖1是展示示例性核酸酶和供體的示意圖。示出三個(gè)載體：用于兩個(gè)核酸酶（SB-42906，左ZFN/ZFN 1 和SB-43043，右 ZFN/ZFN2)以及SB-F9 供體(底部圖）的AAV2/6 載體。
[0049] 圖2是展示ZFN SBS42906和SBS43043結(jié)合至在白蛋白基因座處的其DNA靶序列（在 SEQ ID N0:1示出的白蛋白序列內(nèi)加框)的示意圖。
[0050] 圖3是描繪核酸酶介導(dǎo)的同源性和非同源性引導(dǎo)靶向整合的示意圖。
[0051 ]圖4是描繪通過(guò)NHEJ或HDR來(lái)靶向整合hF9供體的示意圖。不論靶向整合發(fā)生的機(jī) 制為何(左側(cè)的NHEJ和右側(cè)的HDR)，由供體編碼的剪接受體序列允許hF9轉(zhuǎn)基因（外顯子2-8)適當(dāng)mRNA剪接至來(lái)自內(nèi)源性白蛋白啟動(dòng)子的外顯子1并且表達(dá)。
[0052]圖5A和5B示出白蛋白基因座處的mRNA轉(zhuǎn)錄物。圖5A是白蛋白基因座處的替代mRNA 轉(zhuǎn)錄物的示意圖。野生型白蛋白基因座(hALB外顯子1-8)處的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生2.3kb的轉(zhuǎn)錄物，而 在SB-FIX供體整合之后，表達(dá)融合轉(zhuǎn)錄物hALB(外顯子l)-hFIX(外顯子2-8)(1.7kb)。描繪 RT-PCR的引物結(jié)合位點(diǎn)。圖5B示出僅用SB-FIX供體或用hALB ZFN和SB-FIX供體轉(zhuǎn)導(dǎo)的 HepG2亞克隆的分析。頂部圖示出在分泌48小時(shí)之后通過(guò)hFIX特異性ELISA確定的亞克隆的 hFIX分泌。中間圖示出在所有亞克隆中SB-hFIX供體整合至人血白蛋白中的模式（HDR或 NHEJ)。底部圖示出使用對(duì)于野生型人血白蛋白轉(zhuǎn)錄物或hALB-hFIX融合轉(zhuǎn)錄物具有特異性 的引物從IfepG2亞克隆進(jìn)行RT-PCR。
[0053] 圖6A至6C示出hALB ZFN和如本文描述的示例性因子IX供體的序列。圖6A示出ZFN 42906的氨基酸序列（SEQ ID N0:15)(示出ZFP和裂解結(jié)構(gòu)域序列）。圖6B示出ZFN 43043的 氨基酸序列（SEQ ID N0:16)(示出ZFP和裂解結(jié)構(gòu)域序列）JFP的識(shí)別螺旋區(qū)域加下劃線并 且FokI裂解結(jié)構(gòu)域以斜體字示出（ZFN 42906中的"ELD"FokI結(jié)構(gòu)域和ZFN 43043中的"KKR" FokI結(jié)構(gòu)域）。圖6C(SEQ ID N0:17)示出示例性因子IX供體的核苷酸序列。左(堿基對(duì)271-550)和右(堿基對(duì)2121-2220)同源性臂以大寫字母示出并且加下劃線。剪接受體序列(堿基 對(duì)557-584)加下劃線。密碼子優(yōu)化因子IX-編碼序列以大寫字母示出（堿基對(duì)585-1882)并 且多聚腺苷酸化信號(hào)以粗體示出（堿基對(duì)1890-2114)。
[0054] 詳述
[0055] 本文公開用于修飾細(xì)胞以產(chǎn)生一種或多種蛋白質(zhì)的組合物和方法，所述蛋白質(zhì)的 表達(dá)或基因序列在修飾之前是異常。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)與血友病相關(guān)聯(lián)。細(xì)胞可通 過(guò)將編碼一種或多種功能蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因靶向插入細(xì)胞的安全港基因（例如，白蛋白）來(lái)修 飾。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因插入內(nèi)源性白蛋白基因中。轉(zhuǎn)基因可編碼涉及血友病的任何 蛋白質(zhì)或肽，例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI和/或其功能片段。還公開 使用如本文描述的細(xì)胞和/或通過(guò)如本文描述來(lái)修飾細(xì)胞(離體或體內(nèi)）來(lái)治療血友病的方 法。進(jìn)一步描述用于修飾細(xì)胞的包含編碼核酸酶的核酸和供體分子的組合物，和在體內(nèi)或 離體修飾細(xì)胞的方法。另外，描述包含通過(guò)本發(fā)明方法和組合物修飾的細(xì)胞的組合物。 [0056] 本文描述的基因組修飾的細(xì)胞通常經(jīng)由核酸酶介導(dǎo)（ZFN、TALEN和/或CRISPR/ Cas)靶向整合來(lái)修飾以插入編碼治療性蛋白質(zhì)（例如，因子VII、因子VIII (F8)、因子IX、因 子X和/或因子XI)的序列，其中與血友病疾病相關(guān)聯(lián)的其基因發(fā)生改變或處于異常狀態(tài)下 的蛋白質(zhì)進(jìn)入受試者的一種或多種細(xì)胞的基因組(在體內(nèi)或離體），以使得細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生 蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括誘導(dǎo)受試者的細(xì)胞，尤其肝臟細(xì)胞增殖 (進(jìn)入細(xì)胞周期），例如通過(guò)部分肝切除術(shù)和/或通過(guò)施用誘導(dǎo)肝細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期的一種 或多種化合物。受試者包括但不限于人，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，獸醫(yī)動(dòng)物諸如貓、犬、兔、大鼠、小 鼠、豚鼠、奶牛、豬、馬、山羊等。
[0057] 總則
[0058] 除非另外指示，否則這些方法的實(shí)施以及本文公開的組合物的制備和用途將使用 分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA以及本領(lǐng)域技術(shù) 內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域中的傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得以充分說(shuō)明。參見例如Sambrook等人 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989和2001 第三版；Ausubel等人，CURRENT PR0T(X0LS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley&Sons,New York, 1987和定期更新；叢書METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press，San Diego;Wolffe，CHR0MATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第三版，Academic Press，San Diego,1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY，第304卷，"Chromatin"（P.M.Wassarman 和A.P.Wolffe編），Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第119卷，"Chromatin Protocols"（P.B.Becker,編）Humana Press，Totowa, 1999。
[0059] 定義
[0060] 術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"以及"寡核苷酸"可交換使用，并且指的是呈直鏈或環(huán)狀 構(gòu)象，以及呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公開的目的， 這些術(shù)語(yǔ)不應(yīng)被解釋為相對(duì)于聚合物的長(zhǎng)度為限制性的。所述術(shù)語(yǔ)可涵蓋天然核苷酸的已 知類似物，以及在堿基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸主鏈）中被修飾的核苷酸。通常， 具體核苷酸的類似物具有相同的堿基成對(duì)特異性;即A的類似物將會(huì)與T堿基成對(duì)。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"以及"蛋白質(zhì)"可交換使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ) 也適用于其中一種或多種氨基酸是對(duì)應(yīng)的天然存在氨基酸的化學(xué)類似物或修飾衍生物的 氨基酸聚合物。
[0062]術(shù)語(yǔ)"同源性"是指聚合物分子之間，例如，核酸分子（例如，DNA分子和/或RNA分 子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。在一些實(shí)施方案中，如果聚合物分子的序列至 少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 99%、99.5%或99.8%相同，那么聚合物分子被認(rèn)為彼此"同源"。在一些實(shí)施方案中，如果 聚合物分子的序列至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或99.8%類似，那么聚合物分子被認(rèn)為彼此"同源"。 [0063]術(shù)語(yǔ)"同一性"是指聚合物分子之間，例如，核酸分子（例如，DNA分子和/或RNA分 子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。計(jì)算兩個(gè)核酸序列的同一性百分比例如可通過(guò) 出于最優(yōu)比較目的來(lái)比對(duì)兩個(gè)序列來(lái)進(jìn)行(例如，為了最優(yōu)比對(duì)，間隙可引入第一和第二核 酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)并且不相同序列可出于比較目的而忽略）。在某些實(shí)施方案中，出于 比較目的來(lái)比對(duì)的序列的長(zhǎng)度是參考序列的長(zhǎng)度的至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 %、至少70 %、至少80%、至少90 %、至少95 %、99%、99.5%、99.8 %或大致上100%。然后 比較相應(yīng)核苷酸位置的核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中的相應(yīng)位置相同核苷 酸占據(jù)時(shí)，那么在此位置的分子是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比隨著由序列共享 的相同位置的數(shù)目而變化，考慮到為了最優(yōu)比對(duì)兩個(gè)序列而需要引入的間隙的數(shù)目，和每 個(gè)間隙的長(zhǎng)度。兩個(gè)序列之間的序列的比較和同一性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完 成。舉例來(lái)說(shuō)，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比可使用邁耶斯和米勒算法（CABI0S， 1989,4:11-17)來(lái)確定，所述算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序使用PAM 120 權(quán)重殘值表、12的間隙長(zhǎng)度罰分和4的間隙罰分。兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比可替 代地使用GCG軟件包中的GAP程序來(lái)確定，所述GCG軟件包使用NWSgapdna. CMP矩陣。各種其 他序列比對(duì)程序可利用并且可用于確定序列同一性例如像Clustal。
[0064] "結(jié)合"指的是大分子之間（例如，蛋白質(zhì)與核酸之間）序列特異、非共價(jià)相互作用。 不是所有的結(jié)合相互作用的組分都需要序列特異(例如，與DNA主鏈中磷酸鹽殘基接觸），只 要相互作用總體上是序列特異即可。這種相互作用通常特征在于ΙΟΛΓ 1或更低的分解常數(shù) (Kd)Z'親和力"指的是結(jié)合的強(qiáng)度:增加的結(jié)合親和力與較低K d有關(guān)。
[0065] "結(jié)合蛋白"是能夠非共價(jià)結(jié)合另一分子的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可以結(jié)合至例如DNA 分子(DNA結(jié)合蛋白）、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白）和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白）。就蛋白 質(zhì)結(jié)合蛋白來(lái)說(shuō)，它可以結(jié)合至其自身（以形成同源二聚體、同源三聚體等)和/或它可以結(jié) 合至不同蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)分子。結(jié)合蛋白可以具有多于一種類型的結(jié)合活性。舉例來(lái) 說(shuō)，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)結(jié)合活性。
[0066] "鋅指DNA結(jié)合蛋白"（或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)鋅指以序列特異的方式結(jié) 合DNA的蛋白質(zhì)，或較大蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)鋅指是結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨 基酸序列區(qū)，該序列區(qū)的結(jié)構(gòu)通過(guò)鋅離子配位作用來(lái)穩(wěn)定。術(shù)語(yǔ)鋅指DNA結(jié)合蛋白經(jīng)?？s寫 為鋅指蛋白或ZFP。
[0067] "TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"TALE"是包含一個(gè)或多個(gè)TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)域/單元的多 肽。重復(fù)結(jié)構(gòu)域涉及TALE結(jié)合至其同源靶DNA序列。單一"重復(fù)單元"（也稱為"重復(fù)序列"）通 常是33-35氨基酸長(zhǎng)度并且展現(xiàn)至少一些與天然存在TALE蛋白質(zhì)內(nèi)的其他TALE重復(fù)序列的 序列同源性。參見例如美國(guó)專利號(hào)8，586，526。
[0068]鋅指和TALE結(jié)合結(jié)構(gòu)域可"工程化"以結(jié)合至預(yù)定核苷酸序列，例如經(jīng)由天然存在 鋅指或TALE蛋白質(zhì)的識(shí)別螺旋區(qū)域的工程化(改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸）。因此，工程化DNA結(jié) 合蛋白（鋅指或TALE)是非天然存在的蛋白質(zhì)。用于將DNA結(jié)合蛋白工程化的方法的非限制 性實(shí)例是設(shè)計(jì)和選擇。經(jīng)設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合蛋白是自然界中不存在的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的設(shè) 計(jì)/組成主要是合理標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。用于設(shè)計(jì)的合理標(biāo)準(zhǔn)包括取代規(guī)則以及用于處理數(shù)據(jù)庫(kù) 信息的計(jì)算機(jī)算法的應(yīng)用，該數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)了現(xiàn)有ZFP和/或TALE設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)的信息。參 見例如美國(guó)專利6,140,081 ;6,453,242;6,534,261;和8,586,526也參見W0 98/53058 ;W0 98/53059;W0 98/53060;W0 02/016536和W0 03/016496。
[0069] "選擇的"鋅指蛋白或TALE是沒有在自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的制造主要 是經(jīng)驗(yàn)過(guò)程的結(jié)果，如噬菌體展示、相互捕獲或雜種選擇。參見例如US 5,789,538;US 5， 925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；W0 95/19431；W0 96/06166；W0 98/ 53057;WO 98/54311;WO 00/27878;WO 01/60970W0 01/88197和WO 02/099084。
[0070] "TtAgo"是被認(rèn)為涉及基因沉默的原核Argonaute蛋白質(zhì)。TtAgo來(lái)源于細(xì)菌嗜熱 棲熱菌。參見例如Swart s 等人，同前，G. Sheng 等人(2013) Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A.lll, 652)。"TtAgo系統(tǒng)"是所需要的所有組分，包括，例如，用于由TtAgo酶裂解的引導(dǎo)DNA。
[0071] "重組"是指兩個(gè)多核苷酸之間交換遺傳信息的過(guò)程，包括但不限于通過(guò)非同源末 端連接(NHEJ)和同源重組的供體捕獲。對(duì)本公開內(nèi)容來(lái)說(shuō)，"同源重組(HR)"指的是這種交 換的特定形式，該交換發(fā)生在例如經(jīng)由同源導(dǎo)向修復(fù)機(jī)理所進(jìn)行的細(xì)胞中雙鏈斷裂修復(fù)期 間。這個(gè)過(guò)程需要核苷酸序列同源性，使用"供體"分子以成為"祀"分子（即，經(jīng)歷雙鏈斷裂 的分子)的修復(fù)模板，并且這個(gè)過(guò)程被不同地稱為"無(wú)交叉基因轉(zhuǎn)變"或"短序列基因轉(zhuǎn)變"， 因?yàn)樗鼘?dǎo)致基因信息從供體向靶傳遞。不希望被任何具體理論束縛，這種傳遞可以涉及在 斷裂的靶和供體之間形成的異源雙鏈體DNA的錯(cuò)配校正，和/或"取決于合成的鏈退火"，在 該退火中供體用來(lái)重新合成將成為靶一部分的基因信息，和/或相關(guān)的過(guò)程。這種特定的HR 經(jīng)常導(dǎo)致靶分子序列的變化，這樣使得供體多核苷酸的部分或所有序列并入靶多核苷酸 中。
[0072] 在本公開的方法中，如本文所描述的一種或多種靶向核酸酶可在預(yù)先確定的位點(diǎn) 中，在靶序列(例如，細(xì)胞染色質(zhì)）中產(chǎn)生雙鏈斷裂，并且與斷裂區(qū)中的核苷酸序列具有同源 性的"供體"多核苷酸可以引入細(xì)胞中。已經(jīng)展示了存在雙鏈斷裂可促進(jìn)供體序列的整合。 供體序列可以物理整合或，可替代地，供體多核苷酸被用作用于經(jīng)由同源組合來(lái)修復(fù)斷裂 的模板，這將導(dǎo)致引入供體中的全部或部分核酸序列至細(xì)胞染色質(zhì)中。因此，可以改變細(xì)胞 染色質(zhì)中的第一序列，并且在某些實(shí)施方案中，可以轉(zhuǎn)變成存在于供體多核苷酸中的序列。 因此，使用術(shù)語(yǔ)"替換"或"更換"可以理解為表示用另一核苷酸序列來(lái)替換一個(gè)核苷酸序 列，（即，在信息意義上替換序列），并且不必然需要用另一多核苷酸來(lái)物理或化學(xué)地替換一 個(gè)多核苷酸。
[0073] 在本文描述的任何方法中，額外的鋅指蛋白或TALEN對(duì)可以用于細(xì)胞內(nèi)額外靶位 點(diǎn)的額外雙鏈裂解。
[0074] 在用于靶向重組和/或替換和/或改變細(xì)胞染色質(zhì)中所關(guān)注區(qū)域序列方法的實(shí)施 方案中，染色體序列通過(guò)用外源"供體"核苷酸序列同源重組來(lái)改變。如果存在與斷裂區(qū)同 源的序列，那么可通過(guò)細(xì)胞染色質(zhì)中的雙鏈斷裂的存在來(lái)刺激這種同源重組。
[0075] 在本文描述的任何方法中，第一核苷酸序列（"供體序列"）可以包含與所關(guān)注區(qū)域 中基因組序列同源但不同的序列，因此將刺激同源重組以在所關(guān)注區(qū)域插入不相同序列。 因此，在某些實(shí)施方案中，與所關(guān)注區(qū)域序列同源的供體序列部分展現(xiàn)了與所替換的基因 組序列約80%至99%之間（或任何在其間的整數(shù)）的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，供體 和基因組序列之間的同源性高于99%，例如如果具有超過(guò)100個(gè)鄰接堿基對(duì)的供體與基因 組序列之間只有1個(gè)核苷酸不同。在某些情況下，供體序列的非同源部分可以包含不存在于 所關(guān)注區(qū)域中的序列，這樣使得新的序列引入所關(guān)注區(qū)域中。在這些情況下，非同源序列通 常側(cè)接具有50至1，000個(gè)堿基對(duì)(或在其間的任何整數(shù)值)或任何大于1，000個(gè)堿基對(duì)數(shù)目 的序列，這些序列與所關(guān)注區(qū)域中的序列同源或相同。在其他實(shí)施方案中，供體序列與第一 序列是非同源的，并且供體序列通過(guò)非同源重組機(jī)理插入基因組中。
[0076] 本文描述的任何方法可以通過(guò)靶向整合中斷所關(guān)注基因表達(dá)的供體序列來(lái)用于 細(xì)胞中一種或多種靶序列的部分或完全失活。也提供了具有部分或完全失活基因的細(xì)胞 系。
[0077] 此外，如本文所描述的靶向整合方法也可以用來(lái)整合一種或多種外源序列。外源 核酸序列可以包括，例如一種或多種基因或cDNA分子，或任何類型編碼或非編碼的序列，以 及一種或多種控制成分(例如，啟動(dòng)子）。另外，外源核酸序列可能產(chǎn)生一種或多種RNA分子 (例如，小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、微型RNA(miRNA)等）。
[0078] "裂解"指的是DNA分子共價(jià)主鏈的斷裂。可通過(guò)各種各樣的方法來(lái)開始裂解，所述 方法包括但不限于磷酸二酯鍵的酶水解或化學(xué)水解。單鏈裂解和雙鏈裂解均是可能的，并 且雙鏈裂解可由于兩個(gè)相異單鏈裂解事件而發(fā)生。DNA裂解可導(dǎo)致平端或交錯(cuò)端產(chǎn)生。在某 些實(shí)施方案中，融合多肽用于靶向雙鏈DNA裂解。
[0079] "裂解半結(jié)構(gòu)域"是與第二多肽(相同的或不同的）偶聯(lián)的多肽序列，從而形成具有 裂解活性(優(yōu)選地雙鏈裂解活性)的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"第一和第二裂解半結(jié)構(gòu)域"；"+和-裂解半 結(jié)構(gòu)域"以及"右和左裂解半結(jié)構(gòu)域"可交換使用，指的是二聚化的裂解半結(jié)構(gòu)域?qū)Α?br>[0080] "工程化裂解半結(jié)構(gòu)域"是已經(jīng)修飾以便與另一裂解半結(jié)構(gòu)域（例如，另一工程化 裂解半結(jié)構(gòu)域）形成專性異源二聚體的裂解半結(jié)構(gòu)域。還參見美國(guó)專利號(hào)7,914,796;8， 034，598;和8，623，618;以引用方式全部并入本文。
[0081] 術(shù)語(yǔ)"序列"指的是任何長(zhǎng)度的核苷酸序列，該核苷酸序列可以是DNA或RNA;可以 是直鏈的、環(huán)狀的或支鏈的，以及可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語(yǔ)"供體序列"指的是插入基因組 的核苷酸序列。供體序列可以是任何長(zhǎng)度，例如2與10,000個(gè)核苷酸之間的長(zhǎng)度(或任何在 其間或其上的整數(shù)值），優(yōu)選地約100與1，〇〇〇個(gè)核苷酸之間的長(zhǎng)度(或任何在其間的整數(shù) 值），更優(yōu)選地約200與500個(gè)核苷酸之間的長(zhǎng)度。
[0082] "染色質(zhì)"是包括細(xì)胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞染色質(zhì)包括核酸（主要為DNA)以 及蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白的染色體蛋白。大多數(shù)真核細(xì)胞染色質(zhì)以核小 體的形式存在，其中核小體核心包括近似150個(gè)與八聚物相關(guān)的DNA堿基對(duì)，該八聚物包括 組蛋白H2A、H2B、H3以及H4的每?jī)蓚€(gè);并且接頭DNA(取決于有機(jī)體具有可變長(zhǎng)度)在核小體 核心之間伸展。組蛋白H1分子一般與接頭DNA相關(guān)。就本公開內(nèi)容來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"染色質(zhì)"意指 包含所有類型的細(xì)胞核蛋白，不論是原核的還是真核的。細(xì)胞染色質(zhì)包括染色體染色質(zhì)和 游離基因染色質(zhì)。
[0083] "染色體"是包括細(xì)胞所有或部分基因組的染色質(zhì)復(fù)合物。細(xì)胞基因組的特征通常 在于它的核型，該核型是包括細(xì)胞基因組的所有染色體集合。細(xì)胞的基因組可以包括一種 或多種染色體。
[0084] "游離基因"是復(fù)制的核酸、核蛋白復(fù)合物或其他包含核酸的結(jié)構(gòu)，該核酸不是細(xì) 胞染色體核型的一部分。游離基因的實(shí)例包括質(zhì)粒和某些病毒基因組。
[0085] "靶位點(diǎn)"或"靶序列"是定義結(jié)合分子所結(jié)合（只要存在足以結(jié)合的條件）核酸的 一部分的核酸序列。
[0086] "外源"分子是通常不存在于細(xì)胞中，但可以通過(guò)一種或多種基因的、生物化學(xué)的 或其他方法來(lái)引入細(xì)胞中的分子。"通常存在于細(xì)胞中"是相對(duì)于細(xì)胞的具體發(fā)育階段和環(huán) 境條件而測(cè)定。因此，例如，僅在肌肉的胚胎發(fā)育期間存在的分子相對(duì)于成年肌肉細(xì)胞是外 源分子。類似地，通過(guò)熱激誘導(dǎo)的分子相對(duì)于非熱激的細(xì)胞是外源分子。外源分子可以包 括，例如功能失常的內(nèi)源分子的功能形式或功能正常的內(nèi)源分子的功能失常形式。
[0087] 其中，外源分子可以是小分子，如通過(guò)組合化學(xué)過(guò)程而產(chǎn)生的小分子，或大分子如 蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何上述分子的修飾衍生物或任何 包含上述分子的一種或多種的復(fù)合物。核酸包括DNA和RNA，可以是單鏈或雙鏈的；可以是直 鏈、支鏈或環(huán)狀的；并且可以是任何長(zhǎng)度。核酸包括能夠形成雙鏈體以及三鏈體的那些核 酸。參見例如美國(guó)專利號(hào)5，176，996和5，422，251。蛋白質(zhì)包括，但不限于DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄 因子、染色質(zhì)重塑因子、甲基化的DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脫甲基酶、乙?；D(zhuǎn)移 酶、脫乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、促旋酶以及解旋酶。
[0088] 外源分子可以是與內(nèi)源分子相同類型的分子，例如外源蛋白質(zhì)或核酸。舉例來(lái)說(shuō)， 外源核酸可以包括感染的病毒基因組、引入細(xì)胞中的質(zhì)?；蛴坞x基因、或通常不存在于細(xì) 胞中的染色體。用于將外源分子引入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不 限于脂質(zhì)介導(dǎo)的傳遞（即，脂質(zhì)體，包括中性和陽(yáng)離子脂質(zhì)）、電穿孔、直接注入、細(xì)胞融合、 粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的傳遞以及病毒載體介導(dǎo)的傳遞。外源性分子 也可為與內(nèi)源性分子相同類型的分子，但是來(lái)源于與產(chǎn)生細(xì)胞的物種不同的物種。舉例來(lái) 說(shuō)，人核酸序列可引入最初來(lái)源于小鼠或倉(cāng)鼠的細(xì)胞系。
[0089] 相反，"內(nèi)源"分子是在具體環(huán)境條件下，在具體發(fā)育階段通常存在于具體細(xì)胞中 的分子。舉例來(lái)說(shuō)，內(nèi)源核酸可以包括染色體、線粒體、葉綠體或其他細(xì)胞器的基因組、或天 然存在的游離核酸。額外的內(nèi)源分子可以包括蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子和酶。
[0090] "融合"分子是其中兩個(gè)或更多個(gè)亞單位分子得以連接優(yōu)選地共價(jià)連接的分子。亞 單位分子可以是相同化學(xué)類型的分子，或可以是不同化學(xué)類型的分子。第一種類型融合分 子的實(shí)例包括但不限于融合蛋白（例如，ZFP或TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)活化結(jié)構(gòu) 域之間融合）以及融合核酸(例如，編碼上文中描述的融合蛋白的核酸）。第二種類型融合分 子的實(shí)例包括但不限于形成三鏈體核酸與多肽之間融合以及小溝結(jié)合劑與核酸之間融合。
[0091] 細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)可以由融合蛋白向細(xì)胞遞送或通過(guò)編碼融合蛋白的多核 苷酸向細(xì)胞遞送而引起，其中轉(zhuǎn)錄多核苷酸，并且翻譯轉(zhuǎn)錄物以產(chǎn)生融合蛋白。分子間剪 接、多肽裂解以及多肽連接反應(yīng)也可以在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)中涉及到。用于向細(xì)胞遞送 多核苷酸和多肽的方法在本公開內(nèi)容別處提出。
[0092] "基因"對(duì)本公開內(nèi)容來(lái)說(shuō)包括編碼基因產(chǎn)物（參見下文）的DNA區(qū)，以及調(diào)控基因 產(chǎn)物產(chǎn)生的所有DNA區(qū)，無(wú)論這些調(diào)控序列是否與編碼和/或轉(zhuǎn)錄序列鄰近。因此，基因包 括，但不一定限于啟動(dòng)子序列、終止子、翻譯調(diào)控序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和內(nèi)核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)、增強(qiáng)子、沉默子、絕緣子、邊界元件、復(fù)制起點(diǎn)、基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)以及基因座控制區(qū)。
[0093] "基因表達(dá)"指的是將包含在基因中的信息轉(zhuǎn)變成基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可以是基因 的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其他類型的RNA)或 通過(guò)mRNA翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物也包括通過(guò)如加帽、聚腺苷酸化、甲基化以及編輯的 方法來(lái)修飾的RNA，以及通過(guò)例如甲基化、乙?；?、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆 蔻基化以及糖基化來(lái)修飾的蛋白質(zhì)。
[0094] 基因表達(dá)"調(diào)節(jié)"指的是基因活性變化。表達(dá)調(diào)節(jié)可以包括但不限于基因活化和基 因阻抑?；蚓庉?例如，裂解、變化、失活、隨機(jī)突變)可以用來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)?；蚴Щ钪傅氖?與不包括相較于如本文所描述的ZFP的細(xì)胞，基因表達(dá)的任何減少。因此，基因失活可能是 部分的或完全的。
[0095] "所關(guān)注區(qū)"是任何細(xì)胞染色質(zhì)區(qū)，如，例如基因或基因內(nèi)部或基因附近的非編碼 序列，其中結(jié)合外源分子是可取的。結(jié)合可以是為了靶向DNA裂解和/或靶向重組的目的。所 關(guān)注區(qū)可以存在于例如染色體、游離基因、細(xì)胞器基因組(例如，線粒體、葉綠體)或感染病 毒基因組中。所關(guān)注區(qū)可以在基因編碼區(qū)內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)內(nèi)，如例如前導(dǎo)序列、尾隨 序列或內(nèi)含子，或在編碼區(qū)上游或下游內(nèi)的非轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。所關(guān)注區(qū)可以小至單個(gè)核苷酸對(duì)， 或高達(dá)2，000個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)度，或任何整數(shù)值的核苷酸對(duì)。
[0096] "真核"細(xì)胞包括但不限于真菌細(xì)胞(諸如酵母）、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì) 胞和人細(xì)胞(例如，T-細(xì)胞）。
[0097] 術(shù)語(yǔ)"有效連接"或"有效地連接"（或"可操作連接"）關(guān)于并列兩種或更多種組分 (如序列成分)可交換使用，其中組分經(jīng)布置，這樣既使得組分功能正常又使得組分的至少 一種可以介導(dǎo)對(duì)于其他組分的至少一種所施加的功能。作為說(shuō)明，如果響應(yīng)于一種或多種 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子存在或缺失，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制編碼序列轉(zhuǎn)錄水平，那么轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列如啟 動(dòng)子可有效連接至編碼序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列一般以順式與編碼序列有效連接，但無(wú)需直接 鄰近編碼序列。舉例來(lái)說(shuō)，增強(qiáng)子是有效連接至編碼序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，雖然它們不是鄰 接的。
[0098] 相對(duì)于融合多肽，術(shù)語(yǔ)"有效地連接"可以指的是如下事實(shí):每個(gè)組分在與其他組 分的連接狀態(tài)下進(jìn)行與其在未這樣連接的情況下所進(jìn)行的功能相同的功能。舉例來(lái)說(shuō)，相 對(duì)于ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合至活化結(jié)構(gòu)域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合它的靶位點(diǎn)和/或它的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)活化結(jié)構(gòu)域能夠上調(diào)基因表達(dá)，那么 ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域是有效連接的。相對(duì)于ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合至裂解結(jié) 構(gòu)域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合它的靶位點(diǎn)和/或它的 結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)裂解結(jié)構(gòu)域能夠在靶位點(diǎn)附近裂解DNA，那么ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié) 構(gòu)域是有效連接的。
[0099]蛋白質(zhì)、多肽或核酸的"功能片段"是序列不同于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、多肽或核酸，但仍保 留與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、多肽或核酸相同功能的蛋白質(zhì)、多肽或核酸。功能片段可以擁有比對(duì)應(yīng)天 然分子更多、更少或相同數(shù)量的殘基，和/或可以包含一種或多種氨基酸或核酸取代物。用 于測(cè)定核酸功能(例如，編碼功能，可雜交另一核酸的能力）的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。 類似地，確定蛋白質(zhì)功能的方法是熟知的。舉例來(lái)說(shuō)，多肽的DNA結(jié)合功能可以例如通過(guò)過(guò) 濾結(jié)合、電泳迀移位移或免疫沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。DNA裂解可以通過(guò)凝膠電泳來(lái)分析。參見 Ausubel等人，同上文。蛋白質(zhì)可與另一蛋白質(zhì)相互作用的能力可以通過(guò)例如共免疫沉淀、 雙雜交實(shí)驗(yàn)或基因和生物化學(xué)兩者的互補(bǔ)作用來(lái)測(cè)定。參見例如Fields等人（1989) Nature340:245-246;美國(guó)專利號(hào)5,585,245和PCT W0 98/44350。
[0100] "載體"能夠?qū)⒒蛐蛄袀鬟f至靶細(xì)胞。典型地，"載體構(gòu)建體"、"表達(dá)載體"和"基 因轉(zhuǎn)移載體"是指能夠引導(dǎo)所關(guān)注基因的表達(dá)并且可將基因序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的任何核酸 構(gòu)建體。因此，此術(shù)語(yǔ)包括克隆，和表達(dá)媒介物，以及整合載體。
[0101] "安全港"基因座是基因組內(nèi)的基因座，其中基因可插入而對(duì)于宿主細(xì)胞沒有任何 有害效應(yīng)。最有利的是所插入基因序列的表達(dá)不受來(lái)自相鄰基因的任何通讀表達(dá)干擾的安 全港基因座。由核酸酶靶向的安全港基因座的非限制實(shí)例包括CCR5、CCR5、HPRT、AAVS1、 Rosa和白蛋白。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,951,925和8,110,379;美國(guó)公布號(hào)20080159996; 201000218264;20120017290;20110265198;20130137104;20130122591;20130177983和 20130177960和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/823,689)
[0102]核酸酶
[0103] 本文描述包含核酸酶的組合物，所述核酸酶例如適用于將編碼功能性凝血因子 (例如因子VIII和/或因子IX)蛋白質(zhì)的序列整合于來(lái)自患有甲型或乙型血友病的受試者或 在所述受試者體內(nèi)的細(xì)胞的基因組中的核酸酶。在某些實(shí)施方案中，核酸酶是天然存在的。 在其他實(shí)施方案中，核酸酶非天然存在的，即，在DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或裂解結(jié)構(gòu)域中工程 化。舉例來(lái)說(shuō)，可改變天然存在核酸酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合至選定靶位點(diǎn)（例如，已經(jīng) 工程化以結(jié)合至不同于同源結(jié)合位點(diǎn)的大范圍核酸酶）。在其他實(shí)施方案中，核酸酶包含異 源DNA-結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域(例如，鋅指核酸酶;TAL-效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合蛋白；具有異源裂解 結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域）和/或使用工程化單一引導(dǎo)RNA的CRISPR/Cas系 統(tǒng))。
[0104] A.DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0105] 任何DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于本文公開的組合物和方法中，包括但不限于鋅指DNA- 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、CRISPR/Cas核酸酶的DNA-結(jié)合部分，或來(lái)自大范圍核酸 酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0106]在某些實(shí)施方案中，核酸酶是天然存在或工程化(非天然存在的）大范圍核酸酶 (歸巢內(nèi)切核酸酶）。示例性歸巢核酸內(nèi)切酶包括1-3(^1、1-(^111、？1-?叩1、？1-5(^、1-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevlHPI-TevIIL· 它們的識(shí)別序列是已知的。還參見美國(guó)專利號(hào)5,420,032;美國(guó)專利號(hào)6,833,252 ;Belfort 等人（1997)Nucleic AcidsRes.25:3379-3388;Dujon等人（1989)Gene 82:115-118;Perler 等人（1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127;Jasin(1996)Trends Genet.l2:224-228; Gimble等人（1996) J.Mol. Biol .263:163-180 ;Argast等人（1998) J.Mol. Biol .280:345-353 和the New England Biolabs catalogue。工程化大范圍核酸酶描述于例如美國(guó)專利公布 號(hào)20070117128中。歸巢核酸內(nèi)切酶和大范圍核酸酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可在核酸酶的總體 情況下改變（即，使得核酸酶包括同源裂解結(jié)構(gòu)域)或可融合至異源裂解結(jié)構(gòu)域。來(lái)自大范 圍核酸酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可展現(xiàn)核酸酶活性(例如，cTALEN)。
[0107] 在其他實(shí)施方案中，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括天然存在或工程化(非天然存在的）TAL 效應(yīng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。參見例如美國(guó)專利號(hào)8，586,526,以引用的方式整體并入本文。黃單孢 菌屬的植物病原菌已知在重要農(nóng)作物中導(dǎo)致許多疾病。黃單孢菌屬的致病性取決于保守類 型III分泌(T3S)系統(tǒng)，其將超過(guò)25種不同效應(yīng)蛋白質(zhì)注入植物細(xì)胞中。在這些注入蛋白質(zhì) 之中的是轉(zhuǎn)錄活化劑樣(TAL)效應(yīng)物，其模擬植物轉(zhuǎn)錄活化劑并且操縱植物轉(zhuǎn)錄組(參見 Kay等人(2007)3(^61?^318:648-651)。這些蛋白質(zhì)含有0嫩結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。 最好表征的TAL-效應(yīng)物中的一種是來(lái)自野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變型的AvrBs3(參 見Bonas等人（1989)Mol Gen Genet 218:127-136和恥2010079430)<^41^-效應(yīng)物含有串聯(lián) 重復(fù)序列的集中結(jié)構(gòu)域，每個(gè)重復(fù)序列含有大約34個(gè)氨基酸，所述重復(fù)序列對(duì)于這些蛋白 質(zhì)的DNA結(jié)合特異性是關(guān)鍵性的。另外，其含有核定位序列和酸性轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(關(guān)于綜 述，參見Schornack S,等人(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。另外，在植物病原 細(xì)菌青枯菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)稱做brgll和hpxl7的兩種基因，所述基因與青枯菌生物變型1菌株 GMI1000和生物變型4菌株RS1000中的黃單孢菌的AvrBs3家族同源(參見Heuer等人(2007) Appl and Envir Micro 73(13) :4379-4384)。這些基因在核苷酸序列上彼此98.9%相同但 是不同之處在于在hpxl7的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中缺失1，575個(gè)堿基對(duì)。然而，兩種基因產(chǎn)物與黃單 孢菌屬的AvrBs3家族蛋白質(zhì)具有小于40 %序列同一性。參見例如美國(guó)專利號(hào)8，586，526，以 引用的方式整體并入本文。
[0108] 這些TAL效應(yīng)物的特異性取決于在串聯(lián)重復(fù)序列中發(fā)現(xiàn)的序列。重復(fù)序列包含大 約102個(gè)堿基對(duì)并且重復(fù)序列通常彼此91-100%同源(Bonas等人，同前）。重復(fù)序列的多態(tài) 性通常位于位置12和13并且在位置12和13處的高變雙殘基(重復(fù)可變雙殘基或RVD區(qū)域）的 同一性與TAL-效應(yīng)物的靶序列中的鄰接核苷酸的同一性之間似乎存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系(參 見Moscou和Bogdanove，（2009)Science 326 :1501 和Boch等人（2009)Science 326 :1509-1512)。實(shí)驗(yàn)上，已經(jīng)確定這些TAL-效應(yīng)物的DNA識(shí)別的天然代碼以使得位置12和13處的HD 序列(重復(fù)可變雙殘基或RVD)導(dǎo)致a結(jié)合至胞嘧啶(C)，NG結(jié)合至T，NI結(jié)合至A、C、G或T，NN結(jié) 合至A或G，和ING結(jié)合至T。這些DNA結(jié)合重復(fù)序列已經(jīng)以新的組合和多個(gè)重復(fù)序列來(lái)組裝成 蛋白質(zhì)，制得人工轉(zhuǎn)錄因子，所述因子能夠與新的序列相互作用并且活化植物細(xì)胞中的非 內(nèi)源性報(bào)道基因的表達(dá)(Boch等人，同前）。工程化TAL蛋白質(zhì)已經(jīng)連接至FokI裂解半結(jié)構(gòu)域 以產(chǎn)生TAL效應(yīng)結(jié)構(gòu)域核酸酶融合(TALEN)，包括具有非典型RVD的TALEN。參見，例如美國(guó)專 利號(hào)8,586,526。
[0109] 在一些實(shí)施方案中，TALEN包含內(nèi)切核酸酶(例如，F(xiàn)okI)裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu) 域。在其他實(shí)施方案中，TALE-核酸酶是兆TAL。這些兆TAL核酸酶是包含TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和大范圍核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。大范圍核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域作為單體來(lái)起作用并 且不需要二聚化以獲得活性。（參見Boissel等人（2013)Nucl Acid Res:l-13，doi: 10.1093/nar/gktl224)〇
[0110] 在更進(jìn)一步實(shí)施方案中，核酸酶包括緊湊TALEN。這些核酸酶是將TALE DNA結(jié)合結(jié) 構(gòu)域連接至T e v I核酸酶結(jié)構(gòu)域的單鏈融合蛋白。融合蛋白可充當(dāng)由T A L E區(qū)域定位的切口 酶，或可產(chǎn)生雙鏈斷裂，取決于TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對(duì)于TevI核酸酶結(jié)構(gòu)域安置的位置 (參見Beurdeley等人(2013)Nat Comm: 1-8D01:10.1038/ncomms2782)。另外，核酸酶結(jié)構(gòu)域 還可展現(xiàn)DNA-結(jié)合功能。任何TALEN可與具有一個(gè)或多個(gè)兆TALE的額外TALEN(例如，一種或 多種TALE N(cTALEN或Fokl-TALEN)組合使用。
[0111] 在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括鋅指蛋白。優(yōu)選地，鋅指蛋白是非天然存 在的，因?yàn)樗?jīng)過(guò)工程化以結(jié)合至選定靶位點(diǎn)。參見例如Beer li等人（2002 )Nature Bio techno 1.20:135-141; Pabo等人（2001 )Ann · Rev · Biochem. 70 : 313-340 ; I salan等人 (2001 )Nature Biotechnol · 19:656-660 ; Segal等人（2001 )Curr · Opin · Biotechnol · 12: 632-637;Choo等人（2000)Curr · Opin· Struct · Biol · 10:411-416;美國(guó)專利號(hào)6，453，242;6， 534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262, 054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273;和美國(guó)專利公布號(hào) 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061，以引用方式全部并入本文。
[0112] 與天然存在的鋅指蛋白相比，工程化的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新的結(jié)合特異性。 工程化方法包括但不限于合理設(shè)計(jì)和各種類型的選擇。合理設(shè)計(jì)包括，例如使用包括三聯(lián) 體(或四聯(lián)體)核苷酸序列和單獨(dú)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，在其中每個(gè)三聯(lián)體或四聯(lián)體核 苷酸序列與鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)，該鋅指結(jié)合具體的三聯(lián)體或四聯(lián)體序列。 參見，例如共有的美國(guó)專利6，453，242和6，534，261，該專利以引用的方式全部并入本文。
[0113] 包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)的示例性選擇方法公開于美國(guó)專利5，789，538; 5， 925,523;6,007,988;6,013,453;6,410,248 ;6，140,466;6,200,759以及6,242,568;以及恥 98/37186;W0 98/53057;W0 00/27878;W0 01/88197以及GB 2,338,237中。另外，已經(jīng)在例 如共有的W0 02/077227中描述了用于鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性增強(qiáng)。
[0114] 另外，如這些和其他參考文獻(xiàn)中所公開，鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白可使用任 何合適接頭序列，包括例如5個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的接頭來(lái)連接在一起。關(guān)于6個(gè)或更多 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的示例性接頭序列，還參見美國(guó)專利號(hào)6，479，626; 6，903，185;和7，153，949。 本文描述的蛋白質(zhì)可以包括單獨(dú)蛋白質(zhì)鋅指之間適合接頭的任何組合。
[0115] 靶位點(diǎn)的選擇;ZFP和設(shè)計(jì)并構(gòu)建融合蛋白（和編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸）的方 法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且詳細(xì)描述于美國(guó)專利號(hào)6，140，081; 5，789，538;6，453，242; 6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；W0 95/19431；W0 96/06166；W0 98/53057；W0 98/54311；W0 00/27878；W0 01/60970W0 01/88197；W0 02/099084；W0 98/ 53058;W0 98/53059;W0 98/53060;W0 02/016536和W0 03/016496中。
[0116] 另外，如這些和其他參考文獻(xiàn)中所公開，鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白可使用任 何合適接頭序列，包括例如5個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的接頭來(lái)連接在一起。關(guān)于6個(gè)或更多 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的示例性接頭序列，還參見美國(guó)專利號(hào)6，479，626; 6，903，185;和7，153，949。 本文描述的蛋白質(zhì)可以包括單獨(dú)蛋白質(zhì)鋅指之間適合接頭的任何組合。
[0117] B.裂解結(jié)構(gòu)域
[0118] 任何合適裂解結(jié)構(gòu)域可有效地連接至DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以形成核酸酶，諸如鋅指核 酸酶、TALEN或CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,951，925 ;8,110,379和8， 586,526;美國(guó)公布號(hào)20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 和 20130177960 和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/823,689。
[0119] 如以上提及，裂解結(jié)構(gòu)域可與DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域異源，例如鋅指DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 裂解結(jié)構(gòu)域來(lái)自核酸酶或TALEN DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域，或大范圍核酸酶DNA-結(jié)合 結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域來(lái)自不同核酸酶。異源裂解結(jié)構(gòu)域可從任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶 獲得?？梢詮钠渲械玫搅呀饨Y(jié)構(gòu)域的示例性的內(nèi)切核酸酶包括但不限于限制性內(nèi)切核酸酶 和歸巢內(nèi)切核酸酶。參見例如2002_2003Catalogue，New England Bio labs，Beverly，MA;和 Belfort等人（1997)Nucleic Acids Res .25: 3379-3388。裂解DNA的其他酶是己知的（例如 S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸內(nèi)切酶;還參見Linn等人 (編）Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, I"3)。這些酶（或其功能片段） 的一種或多種可以用作裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域的來(lái)源。
[0120]類似地，裂解半結(jié)構(gòu)域可以從任何核酸酶或其部分中得到，如上所闡述，該裂解半 結(jié)構(gòu)域或其部分需要用于裂解活性的二聚作用。通常地，如果融合蛋白包含裂解半結(jié)構(gòu)域， 那么裂解需要兩個(gè)融合蛋白。可替代地，可以使用單個(gè)包含兩個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。兩 個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可以從相同內(nèi)切核酸酶(或其功能片段）中得到，或每個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可以 從不同內(nèi)切核酸酶(或其功能片段）中得到。另外，兩個(gè)融合蛋白的靶位點(diǎn)是優(yōu)選地相對(duì)于 彼此布置的，這樣使得兩個(gè)融合蛋白與它們各自的靶位點(diǎn)的結(jié)合將裂解半結(jié)構(gòu)域放置于使 得裂解半結(jié)構(gòu)域例如通過(guò)二聚作用來(lái)形成功能裂解結(jié)構(gòu)域的彼此空間定位中。因此，在某 些實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)的近側(cè)通過(guò)5至8個(gè)核苷酸或通過(guò)15至18個(gè)核苷酸來(lái)分開。然而任何 數(shù)目的核苷酸或核苷酸對(duì)可以介于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間（例如，從2至50個(gè)核苷酸對(duì)或更多）。通 常地，裂解的位點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。
[0121]限制核酸內(nèi)切酶（限制酶)存在于許多物種中且能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA (在識(shí)別位點(diǎn)處），且在結(jié)合位點(diǎn)處或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型）在遠(yuǎn)離識(shí)別位 點(diǎn)的位點(diǎn)處裂解DNA且具有可分開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域。例如，IIS型酶FokI在距其 于一條鏈上的識(shí)別位點(diǎn)9個(gè)核苷酸處，并且在距其于另一條鏈上的識(shí)別位點(diǎn)13個(gè)核苷酸處 催化DNA的雙鏈裂解。參見例如美國(guó)專利5，356，802; 5，436，150和5，487，994;以及Li等人 (1992)Proc.Natl .Acad. Sci.USA89:4275-4279;Li等人（1993)Proc.Natl .Acad. Sci.USA 90: 2764-2768;Kim等人（1994a)Proc .Natl .Acad· Sci ·USA 91:883-887 ;Kim等人（1994b) J.Biol.Chem.269:31,978-31，982。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含來(lái)自至少一種 IIS型限制性酶的裂解結(jié)構(gòu)域(或裂解半結(jié)構(gòu)域）以及一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該鋅指 結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能是或可能不是工程化的。
[0122] 裂解域與結(jié)合結(jié)構(gòu)域分離的示例性IIS型限制酶是Fok I。這個(gè)具體的酶以二聚體 的形式起作用。Bitinaite 等人（1998)Proc. Natl .Acad .Sci. USA95:10,570-10,575。因此， 對(duì)本公開內(nèi)容來(lái)說(shuō)，認(rèn)為用于公開融合蛋白中的Fok頂每部分是裂解半結(jié)構(gòu)域。因此，對(duì)于 使用鋅指Fok I融合體來(lái)靶向雙鏈裂解和/或靶向取代細(xì)胞序列，可以使用兩個(gè)融合蛋白 (每個(gè)該融合蛋白包含F(xiàn)ok I裂解半結(jié)構(gòu)域)來(lái)重新構(gòu)成催化活性的裂解結(jié)構(gòu)域?？商娲?， 也可以使用包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)Fok I裂解半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽分子。在本公開內(nèi) 容別處提供了使用鋅指Fok I融合體來(lái)靶向裂解和靶向序列變化的參數(shù)。
[0123] 裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域可以是蛋白質(zhì)的任何部分，該蛋白質(zhì)保留裂解活性或 保留多聚(例如，二聚）以形成功能裂解結(jié)構(gòu)域的能力。
[0124] 示例性的IIS型限制性酶描述于國(guó)際公布W0 07/014275中，該公布以引用的方式 全部并入本文。額外的限制性酶也包含獨(dú)立的結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域，并且這些酶是本公開內(nèi) 容涵蓋的。參見例如Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
[0125] 在某些實(shí)施方案中，裂解結(jié)構(gòu)域包括最大限度地減少或防止同源二聚化的一種或 多種工程化裂解半結(jié)構(gòu)域（也稱為二聚化結(jié)構(gòu)域突變體），如例如美國(guó)專利公布號(hào) 20050064474; 20060188987; 20070305346 和 20080131962所描述，其公開內(nèi)容以引用方式全 部并入本文中。在Fok I 的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、 500、531、534、537以及538處的氨基酸殘基全部是用于影響Fok I裂解半結(jié)構(gòu)域二聚的靶。
[0126] 形成專性異源二聚體的Fok I的示例性工程化裂解半結(jié)構(gòu)域包括如下對(duì)，在該對(duì) 中第一種裂解半結(jié)構(gòu)域包括在Fok I的位置490和538處的氨基酸殘基的突變，并且第二種 裂解半結(jié)構(gòu)域包括在氨基酸殘基486和499處的突變。
[0127] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，490處的突變用Lys(K)替換Glu(E);在538處的突變用 Lys(K)替換Iso(I) ;486處的突變用Glu(E)替換Gln(Q);并且位置499處的突變用Lys(K)替 換Is〇(I)。更確切地說(shuō)，本文描述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域通過(guò)在一個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域中位置 490(E-K)和538(I-K)突變以產(chǎn)生指定的"E490K: I538K"工程化裂解半結(jié)構(gòu)域，以及通過(guò) 在另一裂解半結(jié)構(gòu)域中位置486(Q-E)和499(I-L)突變以產(chǎn)生指定的"Q486E:I499L"工程 化裂解半結(jié)構(gòu)域來(lái)制備。本文描述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域是專性異源二聚突變體，在該突 變體中異常裂解被減至最低或消除。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,914,796和8,034,598，其公開 內(nèi)容出于所有目的以引用方式全部并入。在某些實(shí)施方案中，工程化裂解半結(jié)構(gòu)域包含在 位置486、499以及496(相對(duì)于野生型FokI編號(hào)）處的突變，例如在位置486處用Glu(E)殘基 替換野生型Gln(Q)殘基、在位置499處用Leu(L)殘基替換野生型Iso(I)殘基以及在位置496 處用Asp(D)或Glu(E)殘基(也分別稱為"ELD"和"ELE"結(jié)構(gòu)域）替換野生型Asn(N)殘基的突 變。在其他實(shí)施方案中，工程化裂解半結(jié)構(gòu)域包含在位置490、538以及537 (相對(duì)于野生型 FokI編號(hào))處的突變，例如在位置490處用Lys(K)殘基替換野生型Glu(E)殘基、在位置538處 用Lys(K)殘基替換野生型Iso(I)殘基以及在位置537處用Lys(K)殘基或Arg(R)殘基(也分 別稱為"KKK"和"KKR"結(jié)構(gòu)域)替換野生型His(H)殘基的突變。在其他實(shí)施方案中，工程化裂 解半結(jié)構(gòu)域包含在位置490和537(相對(duì)于野生型FokI編號(hào)）處的突變，例如在位置490處用 Lys(K)殘基替換野生型Glu(E)殘基以及在位置537處用Lys(K)或Arg(R)殘基（也分別稱為 "KIK"和"KIR"結(jié)構(gòu)域)替換野生型His(H)殘基的突變。（參見美國(guó)專利第8,623,618號(hào)）。在 其他實(shí)施方案中，工程化裂解半結(jié)構(gòu)域包含"Sharkey"和/或"Sharkey '"突變(參見Guo等人 (2010)J.Mol.Biol.400(l):96-107)〇
[0128] 本文描述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域可以使用任何適合的方法來(lái)制備，例如通過(guò)如美 國(guó)專利號(hào)7,888，121;7,914,796;8,034,598和8,623,618中所描述的野生型裂解半結(jié)構(gòu)域 (Fok I)位點(diǎn)導(dǎo)向突變發(fā)生來(lái)制備。
[0129] 或者，核酸酶可在體內(nèi)在使用所謂"分裂酶"技術(shù)核酸靶位點(diǎn)處組裝(參見，例如美 國(guó)專利公布號(hào)20090068164)。這類分裂酶的組分可表達(dá)于分開表達(dá)構(gòu)建體中，或可在一個(gè) 開放解讀碼組中連接，其中個(gè)別組分例如通過(guò)自裂解2A肽或IRES序列來(lái)分開。組分可為個(gè) 別鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域或大范圍核酸酶核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。
[0130] 核酸酶可在使用之前針對(duì)活性來(lái)篩選，例如在基于酵母的染色體系統(tǒng)中，如 TO2009/042163和20090068164所描述。核酸酶表達(dá)構(gòu)建體可使用在本領(lǐng)域中已知的方法容 易地設(shè)計(jì)。參見例如美國(guó)專利公布 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987;20060063231;和國(guó)際公布W0 07/014275。核酸酶的表達(dá)可在組成型啟動(dòng)子或 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，例如在蜜三糖和/或半乳糖存在下活化(去抑制)并且在葡萄糖存 在下被抑制的半乳糖激酶啟動(dòng)子。
[0131] 在某些實(shí)施方案中，核酸酶包括CRISPR/Cas系統(tǒng)。編碼系統(tǒng)的RNA組分的CRISPR (集群規(guī)則間隔短旋轉(zhuǎn)對(duì)稱重復(fù)序列)基因座，和編碼蛋白質(zhì)的cas(CRISPR相關(guān)聯(lián))基因座 (Jansen等人2002 ·Mol .Microbiol .43:1565-1575 ;Makarova等人2002 ·Nucleic Acids Res.30:482_496; Makarova 等人 2006.Biol .Direct 1 :7 ; Ha ft 等人 2005.PL〇S Comput. Biol. 1: e60)構(gòu)成CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因 座含有CRISPR-相關(guān)聯(lián)(Cas)基因的組合以及能夠設(shè)計(jì)CRISPR-介導(dǎo)核酸裂解的特異性的非 編碼RNA成分。
[0132] II型CRISPR是最好表征的系統(tǒng)之一并且在四個(gè)相繼步驟中進(jìn)行靶向DNA雙鏈斷 裂。首先，兩個(gè)非編碼RNA，前crRNA陣列和tracrRNA，從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄。其次，tracrRNA 雜交至前-crRNA的重復(fù)序列區(qū)域并且介導(dǎo)將前-crRNA處理至含有個(gè)別間隔序列的成熟 crRNA。第三，經(jīng)由crRNA上的間隔序列與靶DNA上的原型間隔序列相鄰基序(PAM)附近的原 型間隔序列之間的Watson-Crick堿基配對(duì)，成熟crRNA: tracrRNA復(fù)合物將Cas9引導(dǎo)至革巴 DNA，這是靶識(shí)別的附加要求。最后，Cas9介導(dǎo)靶DNA的裂解以產(chǎn)生原型間隔序列內(nèi)的雙鏈斷 裂。CRISPR/Cas系統(tǒng)的活動(dòng)包括三個(gè)步驟：（i)將外來(lái)DNA序列插入CRISPR陣列以阻止將來(lái) 攻擊，這是稱為'適應(yīng)'的過(guò)程，（ii)表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)，以及表達(dá)并處理陣列，隨后（iii)RNA-介導(dǎo)干擾外來(lái)核酸。因此，在細(xì)菌細(xì)胞中，多個(gè)所謂'Cas '蛋白質(zhì)涉及CRISPR/Cas系統(tǒng)的天 然功能并且在諸如插入外來(lái)DNA等的功能中發(fā)揮作用。
[0133] 在某些實(shí)施方案中，Cas蛋白質(zhì)可為天然存在Cas蛋白質(zhì)的"功能衍生物"。原生序 列多肽的"功能衍生物"是具有與原生序列多肽相同定性生物特性的化合物。"功能衍生物" 包括但不限于原生序列的片段和原生序列多肽和其片段的衍生物，只要其具有與相應(yīng)原生 序列多肽相同的生物活性。在本文中涵蓋的生物活性是功能衍生物將DNA底物水解成片段 的能力。術(shù)語(yǔ)"衍生物"涵蓋多肽的氨基酸序列變體、其共價(jià)修飾和融合。Cas多肽或其片段 的合適衍生物包括但不限于Cas蛋白質(zhì)或其片段的突變體、融合、共價(jià)修飾。Cas蛋白質(zhì)，包 括Cas蛋白質(zhì)或其片段，以及Cas蛋白質(zhì)或其片段的衍生物，可從細(xì)胞獲得或化學(xué)合成或通 過(guò)這兩種程序的組合獲得。細(xì)胞可為天然產(chǎn)生Cas蛋白質(zhì)的細(xì)胞，或天然產(chǎn)生Cas蛋白質(zhì)并 且遺傳工程化以在較高表達(dá)水平下產(chǎn)生內(nèi)源性Cas蛋白質(zhì)或從外源引入核酸產(chǎn)生Cas蛋白 質(zhì)的細(xì)胞，所述核酸編碼與內(nèi)源性Cas相同或不同的Cas。在一些情況下，細(xì)胞不天然產(chǎn)生 Cas蛋白質(zhì)并且遺傳工程化以產(chǎn)生Cas蛋白質(zhì)。
[0134] 靶向安全港和其他基因的示例性CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)公開于例如美國(guó)臨時(shí)申 請(qǐng)?zhí)?61/823,689 中。
[0135] 因此，核酸酶包含DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性結(jié)合至需要插入供體(轉(zhuǎn)基因）的任 何基因中的靶位點(diǎn)。
[0136] 靶位點(diǎn)
[0137] 如以上詳細(xì)描述，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可工程化以結(jié)合至任何選定序列，例如在安全 港基因座諸如白蛋白中。工程化的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與天然存在的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比，可 以具有新的結(jié)合特異性。工程化方法包括但不限于合理設(shè)計(jì)和各種類型的選擇。合理設(shè)計(jì) 包括，例如使用包括三聯(lián)體(或四聯(lián)體)核苷酸序列和單獨(dú)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，在其 中每個(gè)三聯(lián)體或四聯(lián)體核苷酸序列與鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)，該鋅指結(jié)合具體 的三聯(lián)體或四聯(lián)體序列。參見，例如共有的美國(guó)專利6，453，242和6，534，261，該專利以引用 的方式全部并入本文。也可進(jìn)行TAL-效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的合理設(shè)計(jì)。參見，例如美國(guó)專利號(hào)8，586， 526〇
[0138] 可適用于DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)的示例性選擇方法公 開于美國(guó)專利5,789,538; 5,925,523;6,007,988;6,013,453;6,410,248 ;6，140,466;6， 200,759以及6,242,568;以及WO 98/37186;W0 98/53057;W0 00/27878;W0 01/88197以及 GB 2,338,237中。另外，已經(jīng)在例如共有的WO 02/077227中描述了用于鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 結(jié)合特異性增強(qiáng)。
[0139] 靶位點(diǎn)的選擇;核酸酶和設(shè)計(jì)并構(gòu)建融合蛋白（和編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸）的 方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且詳細(xì)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)20050064474和 20060188987中，所述公布以引用方式全部并入本文中。
[0140] 另外，如這些和其他參考文獻(xiàn)中所公開，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如多指鋅指蛋白）可使 用任何合適接頭序列，包括例如5個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的接頭來(lái)連接在一起。關(guān)于6個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的示例性接頭序列，參見例如美國(guó)專利號(hào)6，479，626; 6，903，185;和7， 153，949。本文描述的蛋白質(zhì)可以包括蛋白質(zhì)的單獨(dú)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間適合接頭的任何組 合。還參見美國(guó)專利號(hào)8,586,526。
[0141] 為了經(jīng)由靶向插入編碼功能因子VIII和/或因子IX蛋白質(zhì)的序列來(lái)治療血友病， 受試者的基因組中的任何所需插入位點(diǎn)用核酸酶裂解，所述核酸酶刺激攜帶因子VIII和/ 或因子IX編碼序列的供體多核苷酸的靶向插入。核酸酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可靶向基因組中 的任何所需位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，核酸酶的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向內(nèi)源性安全港基因座， 例如內(nèi)源性白蛋白基因座。
[0142] 在某些實(shí)施方案中，如圖6A和6B示出的一對(duì)二聚化鋅指核酸酶用于裂解白蛋白基 因以促進(jìn)靶向整合因子IX供體。ZFN包含具有表1示出的識(shí)別螺旋區(qū)域的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 工程化FokI裂解結(jié)構(gòu)域以使得ZFN形成專性異源二聚體（例如，所述對(duì)的一個(gè)成員包含 "ELD"FokI結(jié)構(gòu)域并且所述對(duì)的另一個(gè)成員包含"KKR"FokI結(jié)構(gòu)域。
[0143] 還提供與本文描述ZFN具有同源性或同一性的ZFN，包括但不限于具有至少25%、 30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 序列同源性或 同一性的ZFN序列。此外，應(yīng)了解通常對(duì)于識(shí)別螺旋區(qū)域外部的殘基確定同源性，包括但不 限于FokI結(jié)構(gòu)域、接頭結(jié)構(gòu)域、鋅指骨架殘基(例如，識(shí)別螺旋區(qū)域外部的任何殘基）。因?yàn)?可使用任何鋅指骨架(環(huán)境)和/或裂解結(jié)構(gòu)域，所以可存在識(shí)別螺旋區(qū)域鋅指殘基外部的 同源性的顯著變化。
[0144] 供體序列
[0145] 為了治療血友病，供體序列(還稱為"外源性序列"或"供體"或"轉(zhuǎn)基因"）包含編碼 功能凝血因子蛋白質(zhì)的序列或其一部分，以便在整合供體之后產(chǎn)生編碼并表達(dá)功能凝血因 子蛋白質(zhì)的序列。凝血因子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因的非限制實(shí)例包括因子VIII和/或因子IX，包括這 些蛋白質(zhì)的功能片段。在某些實(shí)施方案中，因子VIII蛋白質(zhì)的B-結(jié)構(gòu)域缺失。參見例如 Chuah等人(2003)101(5): 1734-1743。在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含編碼功能因子IX蛋白 質(zhì)的序列，或其一部分，以便在整合供體之后產(chǎn)生編碼并表達(dá)功能因子IX蛋白質(zhì)的序列。
[0146] 供體分子可插入內(nèi)源性基因中以使得所有、一些或沒有內(nèi)源性基因得以表達(dá)。舉 例來(lái)說(shuō)，包含如本文描述的功能凝血因子蛋白質(zhì)(例如，因子VIII和/或因子IX)序列的轉(zhuǎn)基 因可插入內(nèi)源性白蛋白基因座以使得一些或沒有內(nèi)源性白蛋白與轉(zhuǎn)基因一起表達(dá)。
[0147] 供體(轉(zhuǎn)基因）序列可在表達(dá)融合蛋白（例如，核酸酶)之前、同時(shí)或之后引入細(xì)胞。 供體多核苷酸可含有與基因組序列的足夠同源性(連續(xù)或不連續(xù)區(qū)域）以支持在它與和它 帶有同源性的基因組序列之間的同源重組(或同源介導(dǎo)修復(fù))或，替代地，供體序列可經(jīng)由 非HDR機(jī)制（例如，NHEJ供體捕獲)來(lái)整合，在此情況下供體多核苷酸(例如，載體)不需要含 有與細(xì)胞染色質(zhì)中的所關(guān)注區(qū)域同源的序列。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,888，121和7,972,843 和美國(guó)專利公布號(hào) 20110281361; 20100047805 和 20110207221。
[0148] 供體多核苷酸可為DNA或RNA、單鏈、雙鏈或部分單鏈和部分雙鏈并且可以線性或 環(huán)狀（例如，小環(huán)）形式引入細(xì)胞。參見例如美國(guó)專利公布號(hào)20100047805、20110281361、 20110207221。如果以線性形式引入，那么供體序列的末端可通過(guò)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法來(lái)保護(hù)(例如，避免核酸外切降解）。舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)或多個(gè)雙脫氧核苷酸殘基添加至線 性分子的3'末端且/或自身互補(bǔ)寡核苷酸連接至一個(gè)或兩個(gè)末端。參見例如Chang等人 (1987)Proc.Natl .Acad. Sci.USA84:4959-4963;Nehls等人（1996)Science 272:886-889。 用于保護(hù)外源多核苷酸免受降解的另外方法包括但不限于添加末端氨基和使用修飾的核 苷酸間鍵聯(lián)，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和〇-甲基核糖或脫氧核糖殘基。可將多核苷酸 引入到細(xì)胞中作為載體分子的一部分，所述載體分子具有額外序列例如像復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng) 子和編碼抗生素耐藥性的基因。此外，供體多核苷酸可以裸核酸形式，以與試劑諸如脂質(zhì)體 或泊洛沙姆復(fù)合的核酸形式引入，或可通過(guò)病毒（例如，腺病毒、AAV、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病 毒、慢病毒)來(lái)遞送。
[0149] 在一些實(shí)施方案中，供體可插入以使得其表達(dá)通過(guò)整合位點(diǎn)處的內(nèi)源性啟動(dòng)子 (例如，在供體整合至患者的白蛋白基因座中時(shí)的內(nèi)源性白蛋白啟動(dòng)子)來(lái)驅(qū)動(dòng)。在此等情 況下，轉(zhuǎn)基因可缺少驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的控制元件（例如，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子）（例如，還被稱為 "無(wú)啟動(dòng)子構(gòu)建體"）。但是，顯然在其他情況下供體可包含在整合后驅(qū)動(dòng)功能性蛋白質(zhì)表達(dá) 的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，例如組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)或組織特異性(例如，肝臟或血小板特 異性)啟動(dòng)子。供體序列可特異性整合至任何選定靶位點(diǎn)。
[0150] 當(dāng)白蛋白序列（內(nèi)源性或轉(zhuǎn)基因的一部分)與轉(zhuǎn)基因一起表達(dá)時(shí)，白蛋白序列可為 全長(zhǎng)序列（野生型或突變型）或部分序列。優(yōu)選地白蛋白序列是功能性的。這些全長(zhǎng)或部分 白蛋白序列的功能的非限制實(shí)例包括增加由轉(zhuǎn)基因（例如，治療性基因）表達(dá)的多肽的血清 半衰期且/或充當(dāng)載體。
[0151] 此外，雖然并非為表達(dá)所必需的，外源性序列還可包括轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列，例 如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、編碼2A肽和/或多聚腺苷酸化信號(hào)的序 列。
[0152] 任何供體序列可包括以下修飾中的一個(gè)或多個(gè):密碼子優(yōu)化(例如，人密碼子)和/ 或添加一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。參見例如McIntosh等人(2013)Blood( 17): 3335-44。
[0153] 遞送
[0154] 核酸酶、編碼這些核酸酶的多核苷酸、供體多核苷酸和包含本文所述蛋白質(zhì)和/或 多核苷酸的組合物可在體內(nèi)或離體以任何合適手段遞送。
[0155] 如本文描述的遞送核酸酶的方法描述于例如美國(guó)專利號(hào)8，586，526; 6，453，242; 6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979, 539;7,013,219;和7，163,824中，其公開內(nèi)容以引用的方式全部并入本文。如本文描述的核 酸酶和/或供體構(gòu)建體還可使用含有編碼鋅指蛋白、TALEN蛋白質(zhì)和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)中 的一個(gè)或多個(gè)的序列的載體來(lái)遞送?？梢允褂萌魏屋d體系統(tǒng)，包括但不限于質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體;皰疹病毒載體以及腺相關(guān)病毒載體等。 還參見美國(guó)專利號(hào) 6,534,261; 6,607,882 ;6,824,978; 6,933,113 ;6,979,539; 7,013,219; 和7,163,824,所述專利以引用的方式全部并入本文。此外，顯然任何這些載體可包含所需 要的序列中的一個(gè)或多個(gè)。因此，在將一種或多種核酸酶和供體構(gòu)建體引入細(xì)胞中時(shí)，可在 相同載體或不同載體上攜帶核酸酶和/或供體多核苷酸。當(dāng)使用多個(gè)載體時(shí)，每個(gè)載體可以 包含編碼一個(gè)或多個(gè)核酸酶和/或供體構(gòu)建體的序列。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)載體用于攜 帶轉(zhuǎn)基因和核酸酶。在其他實(shí)施方案中，使用兩個(gè)載體(相同或不同載體類型），其中一個(gè)載 體攜帶核酸酶(例如，例如具有2A肽的ZFN對(duì)的左和右ZFN)并且一個(gè)載體攜帶轉(zhuǎn)基因。在更 進(jìn)一步實(shí)施方案中，使用三個(gè)載體，其中第一個(gè)載體攜帶核酸酶對(duì)的一個(gè)核酸酶(例如，左 ZFN)，第二個(gè)載體攜帶核酸酶對(duì)中的另一個(gè)核酸酶(例如，右ZFN)并且第三個(gè)載體攜帶轉(zhuǎn)基 因。參見圖2。
[0156] 供體和/或核酸酶可以任何合適濃度使用。在某些實(shí)施方案中，供體和分開核酸酶 載體以相同濃度使用。在其他實(shí)施方案中，供體和分開核酸酶載體以不同濃度使用，例如， 一個(gè)載體比另一個(gè)載體多2、3、4、5、10、15、20或更大倍(例如，供體載體比核酸酶載體更多。 舉例來(lái)說(shuō)，一種核酸酶載體(或多種核酸酶載體)和供體載體可以約1: 1、約1: 2、約1: 3、約1: 4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、約1:10、約1:11、約1:12、約1:13、約1:14、約1:15、約 1:16、約1:17、約1:18、約1:19或在一些情況下約1:20的比率來(lái)使用。在一些實(shí)施方案中，第 一核酸酶載體、不同于第一核酸酶載體的第二核酸酶載體和供體載體可以約1:1:1、約1:1: 2、約1:1:3、約1:1:4、約1:1:5、約1:1:6、約1:1:7、約1:1:8、約1:1:9、約1:1:10、約1:1:11、 約1:1:12、約1:1:13、約1:1:14、約1:1:15、約1:1:16、約1:1:17、約1:1:18、約1:1:19 或在一 些情況下約1:1: 20的比率來(lái)使用。在示例性實(shí)施方案中，第一核酸酶載體、不同于第一核酸 酶的第二核酸酶載體，和供體載體以約1:1:8的比率使用。當(dāng)AAV載體用于遞送時(shí)，例如，包 括供體和/或核酸酶的病毒載體可在約lx 1〇8與約lx 1〇15載體基因組/kg/劑量之間（例如， 細(xì)胞或動(dòng)物）。
[0157] 常規(guī)基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法可用于將編碼核酸酶和供體構(gòu)建體的核 酸引入細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和靶組織中。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸核酸 和與如脂質(zhì)體或泊洛沙姆的遞送媒介物復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病 毒，在遞送至細(xì)胞中之后，其具有游離基因或整合的基因組。關(guān)于體內(nèi)遞送工程化DNA-結(jié)合 蛋白和包含這些結(jié)合蛋白的融合蛋白的綜述，參見例如，Rebar (2004)Expert Opinion Invest.Drugs 13(7) :829-839;Rossi等人（2007)Nature Biotech.25(12): 1444-1454以及 一般基因遞送參考文獻(xiàn)諸如Anderson,Science 256:808-813(1992) ;Nabel&Felgner, TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani&Caskey，TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon, TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1): 31-44( 1995) ; Haddada等人，于Current Topics in Microbiology and Immunology Doerf ler和(編輯）（1995)中；和Yu等人，Gene Therapy 1:13-26( 1994) 〇
[0158] 核酸的非病毒遞送方法包括電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、微注射、基因槍、病毒體、脂質(zhì)體、免 疫脂質(zhì)體、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì):核酸偶聯(lián)物、裸DNA、人工病毒顆粒以及DNA的試劑增強(qiáng)吸收。使 用例如Sonitron2000系統(tǒng)(Rich-Mar)的超聲穿孔也可以用于核酸遞送。
[0159] 額外示例性的核酸遞送系統(tǒng)包括由AmaxaBiosystems (Cologne，Germany)、 Maxcyte, Inc.(Rockville,Maryland)nBTX Molecular Delivery Systems(Hoi1iston,MA) 和Copernicus Therapeutics Inc(參見例如U.S.6,008,336)提供的那些。脂轉(zhuǎn)染描述于例 如美國(guó)專利號(hào)5，049，386 ; 4，946，787 ;和4，897，355中）并且脂轉(zhuǎn)染試劑有市售（例如 Transfectam?和Lipofectin?)。適用于多核苷酸有效受體識(shí)別脂轉(zhuǎn)染的陽(yáng)離子和中性脂 質(zhì)包括Felgner、W0 91/17424、W0 91/16024的那些。
[0160] 制備脂質(zhì):核酸復(fù)合物，包括靶向脂質(zhì)體諸如免疫脂質(zhì)復(fù)合物，為本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知（參見，例如，Crystal，Science 270:404-410(1995) ; Blaese等人 Cancer Gene Ther · 2 : 291-297( 1995); Behr等人，Biocon jugate Chem. 5:382-389(1994); Remy等人， Bioconjugate Chem.5:647_654(1994);Gao等人，Gene Therapy 2:710-722(1995) ;Ahmad 等人，Cancer Res.52:4817-4820( 1992);美國(guó)專利號(hào)4,186，183、4,217，344、4,235,871、4， 261，975、4,485,054、4,501，728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
[0161] 額外的遞送方法包括使用將待遞送的核酸封裝至EnGeneIC遞送媒介物(EDV)中。 這些EDV使用雙特異性抗體特異性地向靶組織遞送，其中該抗體的一個(gè)臂具有對(duì)于靶組織 的特異性，并且另一個(gè)臂具有對(duì)于H)V的特異性?？贵w將EDV帶至靶細(xì)胞表面，然后通過(guò)胞吞 作用將EDV帶入細(xì)胞中。當(dāng)在細(xì)胞中時(shí)，將釋放內(nèi)含物（參見MacDiarmid等人(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)〇
[0162] 使用基于RNA或DNA病毒的系統(tǒng)遞送核酸利用用于使病毒靶向體內(nèi)特定細(xì)胞以及 使病毒有效載荷迀移至核中的高度進(jìn)展的方法。病毒載體可直接向患者施用(體內(nèi)）或它們 可用于體外處理細(xì)胞，且接著向患者施用修飾的細(xì)胞(離體）。用于遞送核酸酶和/或供體的 常規(guī)基于病毒的系統(tǒng)包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)、痘苗和單純性皰 疹病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移。用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移方法使整合在宿 主基因組中成為可能，從而常導(dǎo)致插入的轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。另外，已在許多不同細(xì)胞類型 和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0163] 逆轉(zhuǎn)錄病毒的趨向性可通過(guò)并入外來(lái)包膜蛋白質(zhì)、擴(kuò)增靶細(xì)胞的潛在靶群體來(lái)改 變。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染非分裂細(xì)胞并且通常產(chǎn)生高病毒效價(jià)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的選擇取決于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含封裝能力高達(dá)6-10kb外來(lái)序列的順式作用長(zhǎng)末端重復(fù)序列。最小順式作用LTR就足以用于載體的復(fù)制和封 裝，其接著用于將治療基因整合至靶細(xì)胞中以提供持久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體包括基于鼠白血病病毒（MuLV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒（GaLV)、猿免疫缺陷病毒 (SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)的載體及其組合（參見，例如Buchscher等人，J.Virol.66: 2731-2739(1992) ; Johann 等人，J. Virol .66: 1635-1640(1992) ;Sommerfelt 等人， Virol · 176:58-59(1990) ;WiIson等人，J.Virol .63:2374-2378(1989) ;Miller等人， J. Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)〇
[0164] 在瞬時(shí)表達(dá)優(yōu)選的應(yīng)用中，可使用基于腺病毒的系統(tǒng)。基于腺病毒的載體能夠在 許多細(xì)胞類型中具有極高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且不需要細(xì)胞分裂。用所述載體已獲得高效價(jià)和表達(dá)水 平。此載體可在相對(duì)簡(jiǎn)單系統(tǒng)中大量產(chǎn)生。腺病毒相關(guān)病毒（"AAV"）載體還用于向細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 靶核酸，例如，體外產(chǎn)生核酸和肽，和體內(nèi)和離體基因治療程序（參見，例如，West等人， Virology 160:38-47(1987);美國(guó)專利號(hào) 4,797,368;W0 93/24641;Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994) ;Muzyczka,J. Clin· Invest ·94:1351 (1994)。構(gòu)建重組AAV載體 描述于許多公布中，包括美國(guó)專利號(hào)5，173,414;1'抑七8(*丨11等人，]\1〇1.〇611.8丨〇1.5 :3251-3260( 1985); Tratschin 等人，Mol .Cell.Biol.4: 2072-2081 (1984) ;Hermonat&Muzyczka， PNAS 81:6466-6470( 1984);和Samulski等人，J· Virol · 63:03822-3828( 1989)。
[0165] 至少六種病毒載體方法當(dāng)前可用于臨床試驗(yàn)中的基因轉(zhuǎn)移，其利用涉及通過(guò)插入 輔助細(xì)胞系的基因來(lái)補(bǔ)充缺陷載體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的方法。
[0166] pLASN和MFG-S是已被用于臨床試驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例（Dunbar等人， Blood 85:3048-305(1995) ;Kohn等人，Nat.Med. 1:1017-102(1995) ;Malech等人，PNAS 94: 22 12133-12138( 1997)) WA317/PLASN是用于基因治療試驗(yàn)中的第一種治療性載體。 (Blaese等人，Science 270:475-480(1995))。已經(jīng)觀察到MFG-S包裝載體的50%或更大的 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。（Ellem等人，Immunol Immunother.44(l): 10-20(1997) ;Dranoff等人，Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。
[0167] 重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)是基于缺陷性和非病原性細(xì)小病毒腺相關(guān)2型病毒的 有前途的替代性基因遞送系統(tǒng)。所有載體都源于僅保留側(cè)接轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的AAV 145bp堿 基對(duì)倒置末端重復(fù)序列的質(zhì)粒。歸因于整合至轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的基因組中的高效基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn) 定轉(zhuǎn)基因遞送是此載體系統(tǒng)的關(guān)鍵特征。（Wagner等人，Lancet 351:91171702-3(1998)， Kearns等人，Gene Ther .9: 748-55(1996))。其他AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV8、AAV9和AAVrhlO或假型AAV諸如△△￥2/8^八￥8.2^八￥2/5和八八￥2/6和任何新4厶￥血 清型也可根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用。
[0168] 復(fù)制缺陷重組腺病毒載體(Ad)可以高效價(jià)產(chǎn)生并且容易感染許多不同細(xì)胞類型。 大多數(shù)腺病毒載體被工程化以使轉(zhuǎn)基因替代Ad Ela、Elb和E3基因；隨后使復(fù)制缺陷性載體 在反式提供缺失的基因功能的人293細(xì)胞中增殖。Ad載體可在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的組織，包 括非分裂性分化細(xì)胞，如見于肝、腎和肌肉組織中的細(xì)胞。常規(guī)Ad載體具有大攜帶能力。在 臨床試驗(yàn)中使用Ad載體的實(shí)例涉及通過(guò)肌肉內(nèi)注射來(lái)抗腫瘤免疫接種的多核苷酸療法 (Sterman等人，Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。在臨床試驗(yàn)中使用腺病毒載體來(lái)轉(zhuǎn)移基 因的額外實(shí)例包括 Rosenecker 等人，Infection 24:1 5_10( 1996); Sterman 等人，Hum .Gene Ther.9:7 1083-1089(1998) ;Welsh等人，Hum.Gene Ther.2:205-18(1995);Alvarez等人， Hum · Gene Ther · 5:597-613 (1997); Topf 等人，Gene Ther · 5:507-513 (1998); Sterman等人， Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)〇
[0169] 封裝細(xì)胞用于形成能夠感染宿主細(xì)胞的病毒顆粒。這類細(xì)胞包括293細(xì)胞，其封裝 腺病毒，和Φ2細(xì)胞或PA317細(xì)胞，其封裝逆轉(zhuǎn)錄病毒。用于基因療法的病毒載體通常由生產(chǎn) 細(xì)胞系產(chǎn)生，所述細(xì)胞系將核酸載體封裝至病毒顆粒中。載體通常含有封裝并隨后整合至 宿主中所需要的減少病毒序列(如果可適用），其他病毒序列由編碼待表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá) 盒替換。缺失的病毒功能由封裝細(xì)胞系以反式提供。舉例來(lái)說(shuō)，用于基因療法的AAV載體通 常只具有來(lái)自AAV基因組的反向末端重復(fù)（ITR)序列，所述序列為封裝并整合至宿主基因組 中所需要。病毒DNA封裝于細(xì)胞系中，其含有編碼其他AAV基因，即rep和cap的輔助質(zhì)粒，但 是缺少ITR序列。細(xì)胞系還用作為輔助病毒的腺病毒感染。輔助病毒促進(jìn)復(fù)制AAV載體和從 輔助質(zhì)粒表達(dá)AAV基因。由于缺少ITR序列，輔助質(zhì)粒未大量地封裝。以腺病毒的污染可通過(guò) 例如熱處理來(lái)減少，與AAV相比，腺病毒對(duì)于熱處理更敏感。
[0170] 在許多基因治療應(yīng)用中，需要基因治療載體以針對(duì)具體組織類型的高度特異性來(lái) 遞送。因此，病毒載體通常被修飾來(lái)通過(guò)在病毒外表面上以與病毒外殼蛋白的融合蛋白形 式表達(dá)配體來(lái)對(duì)給定細(xì)胞類型具有特異性。選擇配體以對(duì)已知存在于目標(biāo)細(xì)胞類型上的受 體具有親和力。舉例來(lái)說(shuō)，Han等人，Proc.Natl .Acad. Sci.USA92:9747-9751 (1995)，報(bào)道 Moloney鼠白血病病毒可修飾以表達(dá)融合至gp70的人調(diào)蛋白，并且重組病毒感染表達(dá)人表 皮生長(zhǎng)因子受體的某些人乳腺癌細(xì)胞。此原理可擴(kuò)展至其他病毒-靶細(xì)胞對(duì)，其中靶細(xì)胞表 達(dá)受體并且病毒表達(dá)包含細(xì)胞表面受體的配體的融合蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，絲狀噬菌體可工程 化以展示具有實(shí)際上任何選定細(xì)胞受體的特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如，F(xiàn)AB或Fv)。 雖然以上描述主要適用于病毒載體，但是相同原則可施加于非病毒載體。這類載體可工程 化以含有有利于由特異性靶細(xì)胞吸收的特異性吸收序列。
[0171] 基因療法載體可通常通過(guò)如下所述的全身性施用（例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、 真皮下或顱內(nèi)輸注）或局部施用向個(gè)別患者施用來(lái)體內(nèi)遞送。或者，載體可離體遞送至細(xì) 胞，如自個(gè)別患者外植的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、骨髓吸出物和組織生檢體)或萬(wàn)能供血者造 血干細(xì)胞中，隨后通常在選擇已并入載體的細(xì)胞之后將細(xì)胞再植入受試者中。
[0172] 含有核酸酶和/或供體構(gòu)建體的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等）也可 直接施用至生物體以便在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。或者，可施用裸DNA。施用是通過(guò)通常用于引入分 子以最與血液或組織細(xì)胞終接觸的任何途徑，包括但不限于注射、輸注、局部施加和電穿 孔。施用這類核酸的適合方法是可用的且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，且盡管一種以上途徑 可用于施用特定組合物，但特定途徑可常提供比另一途徑更直接且更有效的反應(yīng)。
[0173] 本文描述的適合于引入多核苷酸(例如核酸酶編碼和/或因子VII、因子VIII、因子 FIX、因子X和/或因子XI編碼）的載體包括非整合慢病毒載體（IDLV)。參見例如Ory等人 (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-11388;〇1111等人（1998)了.￥卜〇1.72:8463-8471 ;Zuffery等人（1998) J. Virol · 72 :9873-9880 ;Fo 11 enzi 等人（2000) Nature Genetics25:217-222 美國(guó)專利公布號(hào) 2009/054985。
[0174] 藥學(xué)上可接受的載體部分地通過(guò)所施用的具體組合物以及通過(guò)用來(lái)施用組合物 的具體方法來(lái)確定。因此，如下所述，存在可用的藥物組合物的廣泛多種的適合制劑(例如 參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，1989) 〇
[0175] 顯然核酸酶編碼序列和供體構(gòu)建體可使用相同或不同系統(tǒng)來(lái)遞送。舉例來(lái)說(shuō)，核 酸酶和供體可由相同載體(例如，AAV)攜帶?；蛘?，供體多核苷酸可由質(zhì)粒攜帶，而一種或多 種核酸酶可由不同載體(例如，AAV載體)攜帶。此外，不同載體可通過(guò)相同或不同途徑來(lái)施 用(肌肉內(nèi)注射、尾靜脈注射、其他靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)施用和/或肌肉內(nèi)注射。載體可同時(shí) 或任何相繼順序來(lái)遞送。
[0176] 因此，在某些實(shí)施方案中，本公開包括經(jīng)由核酸酶介導(dǎo)的因子VIII編碼序列的整 合來(lái)在體內(nèi)或離體治療甲型血友病。本公開還包括經(jīng)由因子IX編碼序列的核酸酶介導(dǎo)整合 來(lái)在體內(nèi)或離體治療乙型血友病。類似地，本公開包括分別經(jīng)由因子VII、因子X或因子XI編 碼序列的核酸酶介導(dǎo)整合來(lái)治療因子VII缺陷、因子X或因子XI缺陷相關(guān)血友病。組合物以 有效獲得血清、肝臟或靶細(xì)胞中的治療性因子VII、因子VIII、因子IX或因子X多肽的所需濃 度的量來(lái)施用至人患者。施用可通過(guò)多核苷酸遞送至所需靶細(xì)胞的任何手段。舉例來(lái)說(shuō)，涵 蓋體內(nèi)和離體方法。靜脈內(nèi)注射至門靜脈是優(yōu)選施用方法。其他體內(nèi)施用模式包括例如直 接注入肝葉或膽管和在肝臟遠(yuǎn)端的靜脈內(nèi)注射，包括經(jīng)由肝動(dòng)脈，直接注入肝實(shí)質(zhì)，經(jīng)由肝 動(dòng)脈注射，和/或經(jīng)由膽道系統(tǒng)的逆行注射。離體施用模式包括切除肝細(xì)胞或其他肝臟細(xì)胞 的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后將轉(zhuǎn)導(dǎo)、切除肝細(xì)胞輸注回到人患者的門脈管、肝實(shí)質(zhì)或膽道系統(tǒng)，參見 例如，Grossman等人（1994)Nature Genetics，6:335-341。其他施用模式包括編碼因子VII、 因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI的轉(zhuǎn)基因的離體核酸酶介導(dǎo)插入患者或同種異體干 細(xì)胞中的安全港位置。修飾之后，處理細(xì)胞然后重新輸注至患者體內(nèi)以治療血友病。
[0177] 治療血友病在本文中僅作為舉例來(lái)論述，并且應(yīng)了解其他病狀可使用本文公開的 方法和組合物來(lái)治療。在一些情況下，方法和組合物可用于治療血栓性病癥。待施用的核酸 酶和因子VII、因子VIII、因子IX、因子X或因子XI供體的有效量將在不同患者之間并且根據(jù) 所關(guān)注的治療性多肽而變化。因此，有效量最好由施用組合物的醫(yī)師確定并且適當(dāng)劑量可 由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。允許足夠時(shí)間來(lái)整合并表達(dá)(通常例如4-15天)之后， 治療性多肽的血清或其他組織水平的分析和與施用之前的初始水平比較確定是否施用量 太低、在正確范圍內(nèi)或太高。在一些實(shí)施方案中，可向患者施用單一劑量。在一些實(shí)施方案 中，可向患者施用多個(gè)劑量。在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)行本文公開的組合物與其他治療劑的 共同施用。
[0178] 初始和隨后施用的合適方案也可變，但是如果有必要，典型地在初始施用之后進(jìn) 行后續(xù)施用。隨后施用可以可變時(shí)間間隔來(lái)施用，所述時(shí)間間隔在每天一次至每年一次至 每隔幾年一次范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到可建議適當(dāng)免疫抑制技術(shù)以便通過(guò)遞送載 體的免疫抑制來(lái)避免轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制或阻滯，參見例如，Vi lquin等人（1995 )Human Gene Ther.6:1391-1401〇
[0179] 離體和體內(nèi)施用的制劑包括液體或乳化液體中的懸浮液?；钚猿煞纸?jīng)常與藥學(xué)上 可接受并與活性成分相容的賦形劑混合。合適賦形劑包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇 等和其組合。另外，組合物可含有少量輔助物質(zhì)，諸如，潤(rùn)濕或乳化劑、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑或 增強(qiáng)藥物組合物的有效性的其他試劑。
[0180] 以下實(shí)施例涉及其中核酸酶包括鋅指核酸酶(ZFN)的本公開的示例性實(shí)施方案。 應(yīng)了解這只是為了示例并且可使用其他核酸酶，例如具有工程化DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的尋靶內(nèi) 切核酸酶(大范圍核酸酶)和/或天然發(fā)生工程化尋靶內(nèi)切核酸酶(大范圍核酸酶)DNA-結(jié)合 結(jié)構(gòu)域與異源裂解結(jié)構(gòu)域的融合、TALEN和/或包括工程化單一引導(dǎo)RNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)。 實(shí)施例
[0181] 實(shí)施例1:核酸酶和供體結(jié)構(gòu)
[0182] 為了靶向人血白蛋白基因座，兩個(gè)個(gè)別ZFN，SBS42906(5-指蛋白質(zhì)）和SBS43043 (6-指蛋白質(zhì))被設(shè)計(jì)成分別以高親和力和特異性來(lái)結(jié)合相鄰15個(gè)堿基對(duì)和18個(gè)堿基對(duì)靶 位點(diǎn)。ZFN展示于下表1中。
[0183] 靶序列中的大寫字母表示結(jié)合核苷酸并且小寫字母表示未結(jié)合核苷酸。
[0184] 表1:白蛋白特異性ZFN
[0186] 兩個(gè)ZFN以特定空間定向來(lái)結(jié)合至DNA上的組合33個(gè)堿基對(duì)識(shí)別序列的嚴(yán)格要求 提供了催化在白蛋白基因座中的單一預(yù)定位點(diǎn)形成雙鏈斷裂(DSB)必不可少的功能特異 性。此架構(gòu)的示意圖在圖2中示出。兩個(gè)ZFN各自靶向位于DNA的相反鏈上的白蛋白基因內(nèi)含 子區(qū)域特定序列（核苷酸447-485，相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）。
[0187] FokI核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域連接至每個(gè)ZFP的羧基末端。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,888， 121和8,623,618。實(shí)施高度特定功能的?〇1^1結(jié)構(gòu)域的額外特征是將裂解僅限制于異源二聚 體結(jié)合事件。這經(jīng)由使用已經(jīng)工程化以僅充當(dāng)異源二聚體的變體Fokl結(jié)構(gòu)域(例如，"ELD/ KKR"）來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見例如美國(guó)專利號(hào)8，623,618。這些專性異源二聚體FokI結(jié)構(gòu)域防止?jié)撛?同型二聚體位點(diǎn)處的脫靶裂解，由此進(jìn)一步增強(qiáng)ZFN特異性。
[0188] 供體載體構(gòu)建如下。編碼靶向白蛋白內(nèi)含子1基因座和hF9轉(zhuǎn)基因的ZFN的rAAV2/6 載體在圖1中示出。對(duì)于兩個(gè)ZFN編碼AAV2/6載體，SB-42906和SB-43043(分別表達(dá)左和右 ZFN)，ZFN表達(dá)在肝臟特異性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的控制下，包含人ApoE增強(qiáng)子和人α?-抗-胰蛋 白酶(hAAT)啟動(dòng)子(Miao等人·（2000)Mol.Ther. 1(6) :522-532) JpoE/hAAT啟動(dòng)子在作為 預(yù)定靶組織的肝細(xì)胞中具有高度活性，但是在其他細(xì)胞和組織類型中無(wú)活性以防止在非靶 組織中ZFN表達(dá)和活性。
[0189] 含有hF9轉(zhuǎn)基因的rAAV2/6供體載體（SB-F9供體）是編碼包括外顯子2-8的部分 hF9cDNA的無(wú)啟動(dòng)子構(gòu)建體。存在F9外顯子2剪接受體位點(diǎn)（SA)以允許hF9轉(zhuǎn)基因（外顯子2-8)有效剪接至來(lái)自白蛋白基因座的成熟mRNA中，不論機(jī)制整合為何(NHEJ或HDR;參見例如 圖3和4)。任選地側(cè)接hF9轉(zhuǎn)基因的是與白蛋白內(nèi)含子1基因座的裂解位點(diǎn)同源的序列。左同 源性臂(LA)含有白蛋白內(nèi)含子1裂解位點(diǎn)上游的相同序列的280個(gè)核苷酸，并且右同源性臂 (RA)含有裂解位點(diǎn)下游的相同序列的100個(gè)核苷酸。同源性臂用于經(jīng)由同源介導(dǎo)修復(fù)來(lái)幫 助促進(jìn)hF9轉(zhuǎn)基因靶向整合于白蛋白內(nèi)含子1基因座處。選擇同源性臂的大小以避免白蛋白 基因座中的可抑制靶向整合或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的重復(fù)序列和剪接元件。聚腺苷酸序列從牛生長(zhǎng) 激素基因得到。使用桿狀病毒(Sf 9)表達(dá)系統(tǒng)，將rAAV載體用衣殼血清型AAV2/6來(lái)封裝。
[0190] 實(shí)施例2:人原代肝細(xì)胞中的核酸酶修飾
[0191] 涂布之后一天，人原代肝細(xì)胞用一種或兩種ZFN表達(dá)rAAV2/6病毒在0.3E5-9.0E5 載體基因組(vg)/細(xì)胞的Μ0Ι下轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞在第7天收獲并且制備基因組DNA和蛋白質(zhì)以通過(guò) miSEQ來(lái)進(jìn)行插入和缺失百分比（插入和/或缺失)分析和使用針對(duì)FokI結(jié)構(gòu)域的抗體通過(guò) 蛋白質(zhì)印跡來(lái)進(jìn)行ZFN表達(dá)分析。
[0192] 本文描述的ZFN(SBS42906(5-指；左ZFN)和SBS43043(6-指；右ZFN))展示高水平修 飾(例如，10-30 %之間的插入和缺失）。
[0193] 另外，人肝癌細(xì)胞系(HepG2)用于評(píng)估白蛋白基因座處的特異性核酸酶介導(dǎo)整合 和整合模式(NHEJ或HDR)。用人血白蛋白ZFN和FIX供體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2細(xì)胞展示高于背景的較 強(qiáng)hFIX分泌（~75ng/ml)，并且通過(guò)miSEQ來(lái)分析白蛋白特異性基因修飾展示~74%插入和 缺失。亞克隆用于基因分型以確定白蛋白基因座處的特定整合和通過(guò)NHEJ或HDR的整合模 式（圖3)。亞克隆還展示較強(qiáng)hFIX分泌(高達(dá)350ng/ml)。總體上，在使用通過(guò)HDR或NHEJ的單 等位基因供體整合的亞克隆之間沒有差異。
[0194] 這些結(jié)果展示hFIX可從白蛋白基因座穩(wěn)定表達(dá)，與FIX供體整合模式無(wú)關(guān)。
[0195] 在FIX供體穩(wěn)定整合于白蛋白基因座處之后，hALB-hFIX融合蛋白質(zhì)mRNA從白蛋白 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。雖然未改變的野生型白蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)生2.3kb轉(zhuǎn)錄物，但是hALB-hFIX融 合mRNA較短，為1.7kb(圖5A)，與通過(guò)NHEJ或HDR的整合模式無(wú)關(guān)。
[0196] 我們通過(guò)產(chǎn)生具有通過(guò)NHEJ或HDR的穩(wěn)定整合FIX供體的肝癌細(xì)胞系HepG2的穩(wěn)定 亞克隆來(lái)證明此結(jié)論。在用SB-42906、SB-43043和FIX供體轉(zhuǎn)導(dǎo)Η印G2細(xì)胞之后，我們通過(guò)整 合特異性基因分型來(lái)識(shí)別多個(gè)亞克隆，這些亞克隆展示通過(guò)NHEJ或HDR的FIX供體整合并且 展示可通過(guò)hFIX ELISA檢測(cè)出的高（150-350ng/ml)分泌水平的hFIX蛋白質(zhì)（圖5B)。在總 mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄至cDNA之后，我們通過(guò)PCR和測(cè)序來(lái)分析這些亞克隆的轉(zhuǎn)錄物。在未修飾 對(duì)照細(xì)胞中，我們只可檢測(cè)到具有側(cè)接外顯子1-8的引物的預(yù)期野生型白蛋白轉(zhuǎn)錄物 (2.3kb)，但是未檢測(cè)到具有結(jié)合至FIX供體的引物的轉(zhuǎn)錄物。
[0197] 在具有整合至白蛋白基因座中的FIX供體并且分泌FIX的三個(gè)HepG2亞克隆中，我 們檢測(cè)野生型人血白蛋白轉(zhuǎn)錄物和具有結(jié)合至白蛋白5 ' UTR和FIX供體3 ' UTR的引物的預(yù)期 hALB-hFIX融合轉(zhuǎn)錄物（1.7kb)。這些RT-PCR產(chǎn)物的亞克隆和測(cè)序證實(shí)它是預(yù)期hAlb-hFIX 融合mRNA。這暗示在所有三個(gè)亞克隆中，F(xiàn)IX供體通過(guò)NHEJ或HDR整合于一個(gè)白蛋白等位基 因中，導(dǎo)致表達(dá)功能hALB-hFIX轉(zhuǎn)錄物和進(jìn)一步分泌hFIX蛋白質(zhì)。其他等位基因的MiSeq分 析展示這些亞克隆在白蛋白內(nèi)含子1中帶有10或40個(gè)核苷酸(nt)缺失或1個(gè)nt插入。盡管這 些插入和缺失，細(xì)胞如預(yù)期產(chǎn)生約一半量的野生型白蛋白轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)作為未修飾對(duì)照 細(xì)胞，證明白蛋白外顯子1中的較小插入和缺失對(duì)于白蛋白表達(dá)沒有重大影響。由于在這些 亞克隆中未檢測(cè)到具有結(jié)合至白蛋白mRNA的外顯子8的引物的其他轉(zhuǎn)錄物，我們得出的結(jié) 論是在hFIX供體整合之后，mRNA剪接只在白蛋白外顯子1的剪接供體位點(diǎn)與hF9供體的剪接 受體部位之間發(fā)生。
[0198] 總之，我們對(duì)于HepG2亞克隆中的核酸酶修飾白蛋白基因座的轉(zhuǎn)錄概況的詳細(xì)分 析證明只表達(dá)所需hALB-hF IX融合蛋白質(zhì)mRNA。
[0199]成功的靶向整合需要所有三個(gè)AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)同一肝細(xì)胞(參見例如，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) 號(hào)61/943,865)。我們發(fā)現(xiàn)靶向整合的效率取決于2?仏供體的比率。因此，^六￥編碼2?1^載體 以1:1比率來(lái)配制，并且rAAV編碼ZFN:ZFN:hF9供體DNA比率是1:1:8。
[0200]實(shí)施例3:在人體外脫靶SELEX引導(dǎo)的毒性評(píng)估
[0201]使用生物信息學(xué)方法來(lái)識(shí)別ZFN作用的潛在脫靶效應(yīng)，針對(duì)如本文描述的ZFN的預(yù) 定DNA結(jié)合位點(diǎn)的最佳擬合匹配來(lái)搜索基因組。為了獲得每個(gè)ZFN的共有偏好結(jié)合位點(diǎn)，使 用被稱為SELEX(通過(guò)實(shí)驗(yàn)富集的配體的系統(tǒng)性演進(jìn))基于親和力的靶位點(diǎn)選擇程序。
[0202] 簡(jiǎn)單地說(shuō)，SELEX實(shí)驗(yàn)通過(guò)將ZFN的ZFP部分與隨機(jī)DNA序列池一起孵育，經(jīng)由親和 色譜來(lái)捕獲ZFP蛋白質(zhì)和任何結(jié)合DNA序列，然后PCR擴(kuò)增所結(jié)合DNA片段來(lái)進(jìn)行。將這些DNA 片段克隆并且測(cè)序和比對(duì)以確定共有結(jié)合偏好。
[0203]表1的兩個(gè)ZFN的15個(gè)堿基對(duì)和18個(gè)堿基對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的每個(gè)位置的這些實(shí)驗(yàn)得到 偏好然后用于針對(duì)人基因組中的最相似位點(diǎn)來(lái)指導(dǎo)全基因組生物信息學(xué)搜索。然后將潛在 裂解位點(diǎn)的所得列表排序以優(yōu)先考慮具有與SELEX得到共有序列的最高相似性的那些位 點(diǎn)。識(shí)別人基因組中的前40個(gè)位點(diǎn)。在這些40個(gè)位點(diǎn)中，18個(gè)屬于標(biāo)注基因，但是這些位點(diǎn) 中只有1個(gè)出現(xiàn)于外顯子(蛋白質(zhì)編碼)序列內(nèi)。預(yù)計(jì)內(nèi)含子序列處的低水平修飾不影響基 因表達(dá)或功能。
[0204] 隨后，為了確定是否這些位點(diǎn)由本文描述的核酸酶裂解，人原代肝細(xì)胞和人肝癌 細(xì)胞系HepG2用高劑量(3e5vg/細(xì)胞）的SB-42906和SB-43043 (均封裝為AAV2/6)或作為對(duì)照 的表達(dá)GFP的AAV2/6載體來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)。基因組DNA在轉(zhuǎn)染后7-9天分離，并且將中靶(hALB內(nèi)含子1 基因座)和前40個(gè)預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)基因座PCR從100ng的基因組DNA擴(kuò)增（~15,000二倍體基因 組）。然后，每個(gè)基因座處的修飾水平通過(guò)11 lumina miSEQ上的成對(duì)末端深度測(cè)序來(lái)確定。 成對(duì)序列經(jīng)由開放資源軟體包SeqPrep(由Dr.John St. John開發(fā)，例如參見Klevegring等 人（2014)PL0S One doi:el04417doi.l0，1371journal.pone 0104417)來(lái)合并。
[0205] 每個(gè)序列針對(duì)在所有堿基上彡15的質(zhì)量評(píng)分來(lái)過(guò)濾，然后映射至人基因組(hgl9 組件）。映射至不正確基因座的序列從進(jìn)一步分析中排除。內(nèi)德勒曼-文施(Needleman，S.B, m and Wunsch,C.D. (1970)J.Mol Biol 48(3) :443-53)比對(duì)在靶擴(kuò)增子基因組區(qū)域與所獲 得的IIlumina Miseq讀取之間進(jìn)行以映射插入和缺失。比對(duì)序列中的插入缺失事件如 Gabriel等人（2011)Nature Biotechnology.29(9) :816-23所描述來(lái)界定，除了長(zhǎng)度中的插 入和缺失1堿基對(duì)也被視為真實(shí)插入和缺失以避免少算實(shí)際事件以外。
[0206] 應(yīng)用描述分析之后，中靶修飾在人原代肝細(xì)胞中測(cè)量為16.2%插入和缺失并且在 HepG2細(xì)胞中測(cè)量為30.0 %插入和缺失。在任一細(xì)胞類型中，在任何潛在前40個(gè)脫靶位點(diǎn) 處，未檢測(cè)到顯著插入和缺失。
[0207] 這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)ZFN試劑SBS42906和SBS43043在中靶水平（分別為16和30%)下在人 原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的極好特異性。
[0208] 實(shí)施例4:在體內(nèi)靶向整合
[0209]將如本文描述的核酸酶(和/或編碼核酸酶的多核苷酸)和供體和/或包含核酸酶 和/或供體的藥物組合物施用至人受試者以使得校正FIX轉(zhuǎn)基因整合至受試者的基因組中 (例如，在受試者的自身內(nèi)源性白蛋白基因座的控制下），由此導(dǎo)致因子IX的肝臟特異性合 成。具體地說(shuō)，根據(jù)當(dāng)前治療準(zhǔn)則接受預(yù)防FIX替換療法(>100劑量)而不產(chǎn)生針對(duì)FIX的抑 制劑并且對(duì)于重組FIX沒有過(guò)敏癥的患有嚴(yán)重乙型血友病(>6出血/年，在未治療時(shí)）的至少 18歲齡的男性受試者根據(jù)表2示出的以下排程之一給予如本文描述的核酸酶和FIX供體： [0210]表2
[0212] * 所使用的 ZFN1: ZFN2: cDNA 供體比率：1:1:8
[0213] ZFNl:ZFN2:cDNA 供體比率
[0214] "SB-FIX"含有作為靜脈內(nèi)劑量施用的三個(gè)組分，即三個(gè)個(gè)別重組腺病毒相關(guān)病毒 (rAAV)血清型2/6(rAAV2/6)載體:編碼SBS42906(稱為左ZFN并且在本文中被稱為ZFN1)的 第一載體（SB-42906)，編碼SBS43043(稱為右ZFN并且在本文中被稱為ZFN2)的第二載體 (SB-43043)，和編碼DNA修復(fù)模板的第三載體(hF9基因供體），所述模板編碼無(wú)啟動(dòng)子hF9轉(zhuǎn) 基因。
[0215] SB-FIX的3個(gè)組分(2個(gè)核酸酶和供體)例如在一或多個(gè)藥物組合物中，經(jīng)由靜脈內(nèi) 輸注(例如，門靜脈)依序和/或同時(shí)施用。
[0216]任選地受試者(在施用SB-FIX之前、期間和/或之后）用免疫抑制劑諸如糖皮質(zhì)激 素處理以例如減少或消除免疫響應(yīng)(例如，中和抗體(NAB)響應(yīng)或?qū)τ贏AV的免疫響應(yīng)）。具 體地說(shuō)，患上肝轉(zhuǎn)氨酶增加的受試者給予60mg潑尼龍隨后在4-6周內(nèi)逐漸減少的短暫免疫 抑制方案。
[0217] 受試者針對(duì)以下來(lái)評(píng)估:對(duì)于AAV2/6的免疫響應(yīng);對(duì)于FIX的免疫響應(yīng);存在AAV2/ 6載體DNA;通過(guò)血液、唾液、尿液、糞便和精液的PCR來(lái)評(píng)估白蛋白基因座基因修飾(SB-FIX 的修飾位點(diǎn)）的存在;FIX水平從基線的變化;aPTT從基線的變化;使用因子IX替換療法從基 線的任何變化；出血發(fā)作頻率和/或嚴(yán)重性從基線的任何變化;和肝功能(包括，例如，AST、 ALT、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白水平）。
[0218] SB-FIX施用恢復(fù)功能性FIX的肝產(chǎn)生。在>1 %的正常水平下，用FIX濃縮物預(yù)防性 治療的需要減少或消除并且在>5%正常水平下，除了最嚴(yán)重創(chuàng)傷以外的出血大致上減少。 因此，F(xiàn)IX cDNA的AAV介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至肝臟細(xì)胞中提供FIX在乙型血友病受試者中的長(zhǎng)期產(chǎn) 生。
[0219] 所有本文提到的專利、專利申請(qǐng)以及專利公布特此以引用的方式全部并入。
[0220] 雖然為了清楚理解，比較詳細(xì)地用說(shuō)明和實(shí)施例的方式提供了公開內(nèi)容，但本領(lǐng) 域技術(shù)人員明顯可以實(shí)施不背離本公開內(nèi)容精神或范圍的各種改變和改進(jìn)。因此，前面的 描述和實(shí)施例不應(yīng)理解為具有限制性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鋅指蛋白，其包含稱為并且排序?yàn)镕1至F5或F1至F6的五個(gè)或六個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域， 如在表1的單行中示出。2. -種融合蛋白，其包含如權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白和野生型或工程化裂解結(jié)構(gòu)域 或裂解半結(jié)構(gòu)域。3. -種多核苷酸，其編碼一種或多種如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)。4. 一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求3所述的多核苷酸。5. 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其中所述載體是AAV載體。6. 如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中所述AAV載體是AAV2/6載體。7. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其包含如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的第一表達(dá) 載體，所述第一表達(dá)載體包含第一多核苷酸，和如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的第二表達(dá) 載體，所述第二表達(dá)載體包含第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸 是不同的。9. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其包含 (i)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu)域 和包含排序?yàn)镕1至F5的5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺旋 區(qū)域并且其中所述鋅指蛋白質(zhì)的所述識(shí)別螺旋區(qū)域在表1的第一行中示出（SEQ ID N0:4- 8)； (i i)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu) 域和包含排序?yàn)镕1至F6的6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺 旋區(qū)域并且其中所述鋅指蛋白質(zhì)的所述識(shí)別螺旋區(qū)域在表1的第二行中示出（SEQ ID NO: 9_14);和 (iii)包含編碼因子IX蛋白質(zhì)的供體的AAV載體。10. 如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述第一多核苷酸包含如SEQ ID NO. 15的序 列或由如SEQ ID NO. 15的序列組成并且所述第二多核苷酸包含如SEQ ID NO. 16的序列或 由如SEQ ID NO. 16的序列組成。11. 如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含供體序列。12. 如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述供體序列與表達(dá)載體締合。13. 如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述供體序列包含如SEQ ID NO. 17的序列 或由如SEQ ID NO. 17的序列組成。14. 如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)載體是AAV載體。15. 如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述AAV載體是AAV2/6載體。16. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中至少一種蛋白質(zhì)結(jié)合至細(xì)胞中 的白蛋白基因。17. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。18. -種裂解細(xì)胞中的白蛋白基因的方法，所述方法包括： 在使得所述一或多種蛋白質(zhì)得以表達(dá)并且所述白蛋白基因得以裂解的條件下，將一或 多種如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括將供體序列整合至所述裂解的白蛋白基 因中。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述供體序列使用AAV載體來(lái)引入。21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述AAV載體是AAV2/6載體。22. 如權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述供體序列編碼因子IX(F. IX)蛋 白質(zhì)。23. 如權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。24. -種治療患有乙型血友病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如權(quán)利要 求4至6中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體或如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，所述表達(dá)載體或藥物 組合物介導(dǎo)編碼功能因子IX蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因靶向整合至內(nèi)源性白蛋白基因中。25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中將系統(tǒng)施用至所述患者，所述系統(tǒng)包括： (i)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu)域 和包含排序?yàn)镕1至F5的5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺旋 區(qū)域并且其中所述鋅指蛋白質(zhì)的所述識(shí)別螺旋區(qū)域在表1的第一行中示出（SEQ ID N0:4- 8)； (i i)包含編碼鋅指核酸酶的多核苷酸的AAV載體，所述鋅指核酸酶包含F(xiàn)okI裂解結(jié)構(gòu) 域和包含排序?yàn)镕1至F6的6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白質(zhì)，其中每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域包含識(shí)別螺 旋區(qū)域并且其中所述鋅指蛋白質(zhì)的所述識(shí)別螺旋區(qū)域在表1的第二行中示出（SEQ ID NO: 9_14);和 (iii)包括編碼因子IX蛋白質(zhì)的供體的AAV載體。26. 如權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中靜脈內(nèi)施用所述表達(dá)載體或藥物組 合物和轉(zhuǎn)基因。27. -種試劑盒，其包括如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。28. 如權(quán)利要求8或10-17所述的藥物組合物，其中所述第一核酸酶、不同于所述第一核 酸酶的所述第二核酸酶和所述轉(zhuǎn)基因供體以約1:1: 1、約1:1:2、約1:1:3、約1:1:4、約1:1: 5、約1:1:6、約1:1:7、約1:1:8、約1:1:9、約1:1:10、約1:1:11、約1:1:12、約1:1:13、約1:1: 14、約1:1:15、約1:1:16、約1:1:17、約1:1:18、約1:1:19 或約1:1:20 的比率提供。29. 如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中和（iii)以約1:1:1、約1:1:2、約1: 1:3、約1:1:4、約1:1:5、約1:1:6、約1:1:7、約1:1:8、約1:1:9、約1:1:10、約1:1:11、約1:1: 12、約1:1:13、約1:1:14、約1:1:15、約1:1:16、約1:1:17、約1:1:18、約1:1:19 或約1:1:20 的 比率提供。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK105940013SQ201480072482
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日
【發(fā)明人】J·C·米勒, D·帕斯喬恩, E·J·瑞巴
【申請(qǐng)人】桑格摩生物科學(xué)股份有限公司