結(jié)合rt-pcr與nest-pcr的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種結(jié)合RT?PCR與NEST?PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法。設(shè)計巢式PCR反應(yīng)(NEST?PCR)，以RT?PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，進行NEST?PCR擴增，有效提高了檢測的靈敏度，可檢測到攜帶較低病毒拷貝數(shù)的樣品。
【專利說明】結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測 方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法，尤其設(shè)及一種結(jié)合RT- PCR與肥ST-PCR的草魚出血病病毒(GCRV-GD108)檢測試劑盒和檢測方法，屬于魚類病毒檢 測技術(shù)領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 草魚是我國重要養(yǎng)殖品種，但養(yǎng)殖過程極易發(fā)生病害，尤其是病毒性出血病可導 致草魚高發(fā)病率與死亡率。草魚出血病成為制約草魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。該病主要發(fā)生在 魚種階段，是一種流行廣、危害極大的傳染性魚病，病毒的感染可導致病魚各器官組織出現(xiàn) 不同程度的充血、出血，嚴重時死亡率可高達90% W上。1983年我國首次報道草魚出血病的 病原為草魚出血病病毒（Grass Ca巧haemorrhage，GCHV)。1995年國際病毒分類委員會將 其命名為草魚呼腸孤病毒(Grass carp Reovirus,GCRV)，歸屬于呼腸孤病毒科、水生呼腸 孤病毒屬。GCRV是中國分離鑒定的第一株魚類病毒，GCRV 873株為其代表株，也是中國在國 際上完成全基因組序列分析的第一株水生呼腸孤病毒。
[0003] 近年，中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所從廣東養(yǎng)殖草魚患出血病病魚體上分 離到一株病毒株(GCRV-GD108株），證實該毒株對草魚具有強致病性，并成功克隆其全基因 組，成為第二個獲得全基因組序列的草魚出血病病毒株。序列分析顯示其隸屬水生呼腸孤 病毒屬，但其分子特性顯著有別于草魚呼腸孤病毒GCRV-873等已知病毒株，并發(fā)現(xiàn)GCRV- GD108株在我國南方草魚各主養(yǎng)區(qū)的病毒流行株中具有代表性(Xing Ye,化an-yuan Tian, Guo-cheng Deng,Yan-yan Chi,Xia〇-yan Jiang. Complete genomic sequence of a reovirus isolated from grass carp in China.Virus Research,2012,163:275-283…； 田園園，葉星，鄧國成，黎炯，王杭軍.南方養(yǎng)殖草魚呼腸孤病毒的分子特性比較及雙重PCR 檢測方法的建立.病毒學報，2011，27(4):358-365[2];Ye X，Tian Y.Advances in GCRV research:Virus molecular type and immunogen.SM Virol.2016,1(I):1003…）。
[0004] 同時近年對南方多個草魚主養(yǎng)區(qū)的隨機抽樣檢測發(fā)現(xiàn)，草魚苗種攜帶病毒的情況 普遍存在，且多與GD108株相同。有些病魚外表具有明顯病癥(如體表罐條基部、腹部、口腔、 肌肉等出血），往往經(jīng)過RT-PCR即可檢測到病毒GD108株，但有些苗種外觀及攝食活動正常 的草魚苗種也可能帶有病毒、但由于病毒的數(shù)量較少而未能通過RT-PCR檢測到，選購此類 外表健康但實際上攜帶有病毒的草魚苗種進行池塘養(yǎng)殖常常導致大批量的死亡，給養(yǎng)殖生 產(chǎn)帶來極大經(jīng)濟損失。因此提高草魚出血病病毒GD108株的檢測效率與靈敏度，對保障草魚 成魚養(yǎng)殖的高存活率與養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，真正從苗種供給源頭上進行有效監(jiān)控，并對選擇使 用特異性疫苗進行免疫、實現(xiàn)草魚出血病的有效防控具有重要的意義。
[0005] 申請?zhí)枮?01310430466.0的中國發(fā)明專利公開了一種草魚呼腸孤病毒I型和II型 的雙重巧光定量PCR檢測方法，可W實現(xiàn)在一個待測樣本中同時檢測草魚呼腸孤病毒I型和 n型的存在，并能對兩種病毒的負載水平進行定量。但是該方法需要在提取病毒總RNA后進 行獨立的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，W獲得cDM第一鏈作為下一步PCR檢測的模板；申請?zhí)枮?201210398483.6公開了一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，根據(jù)S種類型 草魚呼腸孤病毒的第二節(jié)段的共有序列設(shè)計引物，通過RT-PCR法檢測樣品或細胞中是否有 草魚呼腸孤病毒的感染，但此法無法區(qū)分是哪種類型的草魚呼腸孤病毒?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未 見針對GCRV-GD108株、提高其檢測效率與靈敏度的檢測方法的相關(guān)報道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、針對性 強的結(jié)合RT-PCR與肥ST-PCR的草魚出血病病毒(GCRV-GD108株)檢測試劑盒，包括：
[0007] (1)一步法RT-PCR反應(yīng)混合液：2扣L的反應(yīng)體系中，包括One step Enzyme Mix化 L，2XlSt邱Buffer 12.化L，引物對I的濃度為0.4iiM，所述引物對I具有沈Q ID N0:l-2所 示的核巧酸序列，具體地，引物對1的序列如下：
[000引 正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(沈Q ID N0:1)
[0009]反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID N0:2)
[0010] 其中，One Step Elnzyme Mix包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、化ase抑制劑。
[0011] 2X1 Step Buffer包括：反應(yīng)buffer、dNTP混合物（終濃度400uM)、One Step Enhsncer Solution〇
[0012] (2)肥ST-PCR反應(yīng)混合液：20化的反應(yīng)體系中，包括Premixhq MixlOiiL，引物對2 的濃度為0.化M，所述引物對2具有SEQ ID N0:3-4所示的核巧酸序列，具體地，引物對2的序 列如下：
[0013] 正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID N0:3)
[0014] 反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(沈Q ID N0:4)
[0015] 其中，PremixTaq Mix包括:2倍濃度的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合物。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供一種結(jié)合RT-PCR與肥ST-PCR的草魚出血病病毒(GCRV- GD108株)檢測方法，具體包括W下步驟：
[0017] (1)、RNA的獲取:提取待現(xiàn)略魚組織的總RNA，作為RT-PCR反應(yīng)的模板；
[001引 （2)、RT-PCR擴增：采用25化的擴增體系，將反應(yīng)混合液置于PCR儀進行RT-PCR擴 增，所述反應(yīng)混合液中，包括步驟（1)獲取的RNA模板化L，化e Step En巧me Mix 1化，2X1 Step Buf fer 12.扣L，引物對1的濃度為0.4iiM，余量由DEPC處理水補足，放入PCR儀進行RT- PCR擴增，其中，所述引物對1具有SEQ ID NO: 1-2所示的核巧酸序列，具體地，引物對1的序 列如下：
[0019] 正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(沈Q ID NO: 1)
[0020] 反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID N0:2)
[0021] (3)、檢測RT-PCR擴增結(jié)果:取RT-PCR擴增產(chǎn)物，用I %的瓊脂糖凝膠電泳后，置于 凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在349bp大小處有條帶，則確定該樣品攜帶草魚出血病病毒 GCRV-GD108株，若電泳圖片在349bp大小處沒有條帶，則繼續(xù)進行步驟(4);
[0022] (4)、肥ST-PCR擴增：W電泳圖片在349bp大小處沒有條帶的RT-PCR擴增產(chǎn)物作為 模板，進行肥ST-PCR擴增，采用20化的擴增體系：DNA模板化UPremix化q Mix 1化L，引物對 2的濃度為0.4咖，其余由滅菌d地2〇補足，其中，所述引物對2具有SEQ ID N0:3-4所示的核 巧酸序列，具體地，引物對2的序列如下：
[0023] 正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID N0:3)
[0024] 反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(沈Q ID N0:4)
[0025] (5)檢測肥ST-PCR擴增結(jié)果:取肥ST-PCR擴增產(chǎn)物，用I %的瓊脂糖凝膠電泳后，置 于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在206bp大小處有條帶，判定該樣品帶有草魚出血病病毒 GCRV-GD108 株。
[00%]優(yōu)選的，上述步驟(1)具體包括：
[0027] A、組織預(yù)處理:樣品預(yù)處理:取待測草魚樣品的組織300mg，加入60化L TN緩沖液 (20mMTris-肥l，0.4M化Cl，pH7.4)勻漿（電動勻漿機，打5次，每次5-6sec)，室溫12000g離 屯、15min，取上清；
[002引 B、T r i Z 01試劑提取病毒R N A:在1 m L T r i Z 01試劑中加入15 0化粗提取液，依照 Trizol試劑提取RNA的步驟進行，最后溶解30化DEPC水，用槍頭輕打幾次或室溫20min，直接 用于RT-PCR擴增，或-20度短暫保存、或-80°C冰箱保存。
[00巧]優(yōu)選的，上述步驟(2)中，RT-PCR擴增的條件為:PCR反應(yīng)的條件為：50°C30min; 94 °C 2min;進入循環(huán):94°C 30sec，55 °C 30sec，72 °C Imin，共35個巧cle;最后一個反應(yīng)結(jié)束時， 72°(：延伸1〇111111，4°(：結(jié)束。
[0030] 優(yōu)選的，上述步驟(4)中，肥ST-PCR擴增的條件為：94°C，預(yù)變性2min;進入35個循 環(huán):98°C IOsec，56°C30sec，72°C50sec;最后一個循環(huán)結(jié)束后 72°C 延伸 IOmin，4°C 保存。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點及應(yīng)用效果：
[0032] 本發(fā)明針對目前我國草魚養(yǎng)殖區(qū)普遍存在的草魚呼腸孤病毒GCRV-GD108株，提供 一種結(jié)合RT-PCR與肥ST-PCR的檢測方法，該方法根據(jù)GCRV-GD108株的特異性基因片段設(shè)計 引物，保證檢測的特異性；
[0033] 本發(fā)明采用一步法PT-PCR，改變了常見的將RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，再取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作 為模板進行PCR反應(yīng)的做法，通過將反轉(zhuǎn)錄與PCR反應(yīng)所需的各主要成分配制為混合液，簡 化操作步驟、縮短操作時間，并減少操作誤差和出錯、污染等可能性；
[0034] 本發(fā)明設(shè)計巢式PCR反應(yīng)(肥ST-PCR)，WRT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，進行肥ST-PCR 擴增，有效提高了檢測的靈敏度，可檢測到攜帶較低病毒拷貝數(shù)的樣品；
[0035] 優(yōu)化了待檢測樣品取樣方法，常規(guī)直接方法中，直接取一定量的待測樣品提取 RNA，1血化izol試劑加入組織的量不能大于30mg，本發(fā)明通過勻漿和離屯、，取其上清液提取 RNA，使每次用于提取RNA的實際組織用量增加，顯著提高病毒RNA的獲取量和檢測靈敏度；
[0036] 將本發(fā)明應(yīng)用于草魚苗種的病毒檢測中，有利于保障草魚成魚養(yǎng)殖的高存活率與 養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，真正從苗種供給源頭上進行有效監(jiān)控，并對選擇使用特異性疫苗進行免疫、 實現(xiàn)草魚出血病的有效防控具有重要意義。 【【附圖說明】】
[0037] 圖1為本發(fā)明實施例中RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[003引圖2為本發(fā)明實施例中肥ST-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。 【【具體實施方式】】
[0039] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。 在未作說明的情況下，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的試劑、設(shè) 備和常規(guī)使用的方法。
[0040] 實施例1
[0041 ] 本實施例設(shè)及一種結(jié)合RT-PCR與肥ST-PCR的草魚出血病病毒檢測方法，為了驗證 本發(fā)明的應(yīng)用效果，挑選A、B、C、D、E共5尾草魚樣品，其中A為健康草魚樣品，作為陰性對照； B、C為疑似感染有GCRV-GD108株出血病病毒的草魚;D為外表正常的草魚;E為具有明顯病毒 性出血病病癥的草魚，作為陽性對照。采用W下步驟提取各草魚樣品的RNA:
[0042] (1)組織預(yù)處理：每尾魚剪取300mg的觸與腸組織，加入eOOiil TN緩沖液 (20mMTris-HCl，0.4M化Cl，pH7.4)進行勻漿（電動勻漿機，打5次、每次5-6sec)，室溫 12000g離屯、15min，取上清。
[0043] (2)Trizol試劑提取病毒RNA:在ImL Trizol試劑中加入150iU粗提取液，依照 Trizol試劑提取RNA的步驟進行提取RNA，最后溶解30化DEPC水，用槍頭輕打幾次或室溫 20min，直接用于反轉(zhuǎn)錄，或-20°C短暫保存、或-80°C冰箱保存，并分別編號為1#、2#、3#、4#、 5#。
[0044] 為了驗證本發(fā)明中RNA提取方法的應(yīng)用效果，本實施例還按照普通方法采用 Trizol試劑直接提取草魚B和C的組織RNA(不經(jīng)過上述步驟（1)的組織勻漿處理），并將獲取 的RNA編號為II#和III#。
[0045] 將上述獲取的1#、11#、111#、2#、3#、4#、5#共7個3酷模板按照下述步驟(3)-(6)繼 續(xù)進行草魚出血病病毒GCRV-GD108株的檢測：
[0046] (3 )RT-PCR擴增:采用25化的擴增體系，將反應(yīng)混合液置于PCR儀進行RT-PCR擴增， 所述反應(yīng)混合液中，包括步驟獲取的RNA模板化L，0ne Step Enzyme Mix 1化，2 X IStep Buffer 12.扣L(0ne Step Enzyme Mix、2 X ISt邱 Buffer使用TAKARA公司One Step RT- PCR試劑盒(Cat. Nos. RR055A)，引物對I的濃度為0.4iiM，余量由DEPC處理水補足，放入PCR儀 進行RT-PCR擴增。其中，
[0047] PCR 反應(yīng)的條件為：50 °C 30min; 94°C 2min;進入循環(huán)：94°C 30sec，55 °C 30sec，72 °C Imin，共35個巧cle;最后一個反應(yīng)結(jié)束時，72°C延伸10min，4°C結(jié)束。
[004引所述引物對1具有SEQ ID NO: 1-2所示的核巧酸序列，具體地，引物對1的序列如 下：
[0049] 正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(沈Q ID N0:1)
[0050] 反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID N0:2)
[0051 ] (4)檢測RT-PCR擴增結(jié)果:取RT-PCR擴增產(chǎn)物，用I %的瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓 為120V，時間為28min，于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在349bp大小處有條帶，則確定該 樣品攜帶草魚出血病病毒GCRV-GD108株，若電泳圖片在349bp大小處沒有條帶，則將該擴增 產(chǎn)物作為模板繼續(xù)進行肥ST-PCR擴增。如圖1所示，本實施例中，1#陰性對照樣品在349bp處 未出現(xiàn)擴增條帶，11#、111#、2#、3#、4#、5#在34%9處有擴增條帶，但是11#、111#的擴增條帶 比2#、3#的條帶弱。說明本實施例的步驟（1)所述的組織預(yù)處理步驟可W顯著提高病毒RNA 的獲取量。
[0052] (5)肥ST-PCR擴增：分別^1#、11#、111#、2#、3#、4#、5#34飾莫板的腳斗0?擴增產(chǎn)物 作為模板，進行肥ST-PCR擴增，采用20化的擴增體系：RNA模板化L，Premixhq Mix(TAKARA 公司，化t. Nos. R004A) 1化L，引物對2的濃度為0.4iiM，余量由滅菌dd肥O補足。其中，
[0053] 肥ST-PCR反應(yīng)的條件為：94°C，預(yù)變性2min ;進入35個循環(huán)：98°C IOsec，56°C 3〇36。，721：5〇36(3;最后一個循環(huán)結(jié)束后72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[0054]所述引物對2具有SEQ ID N0:3-4所示的核巧酸序列，具體地，引物對2的序列如 下：
[0化5]正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID N0:3)
[0化6]反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(沈Q ID N0:4)
[0057] (6)檢測肥ST-PCR擴增結(jié)果:取肥ST-PCR擴增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，置 于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在206bp大小處有條帶，判定該樣品帶有草魚出血病病毒 GCRV-GD108株。如圖2所示，本實施例中，1#樣品（陰性對照）的肥ST-PCR擴增產(chǎn)物于206bp處 依然沒有擴增條帶，而II#、III#、2#、3#、5#樣品在206bp處均有明亮的擴增條帶。在RT-PCR 中沒有擴增條帶的4#樣品，肥ST-PCR后也出現(xiàn)明亮的20化P擴增條帶。說明本實施例的步驟 (5)所述的NEST-PCR擴增步驟可W提高病毒檢測的靈敏度。
[005引因此，判定除陰性對照外的所有草魚均感染有草魚出血病病毒GCRV-GD108株，且 WRT-PCR產(chǎn)物作為模板，進行肥ST-PCR擴增，可W提高檢測靈敏度，檢測到攜帶較低病毒拷 貝數(shù)的樣品。
[0059] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實施例，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 構(gòu)思加 W等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括： (1) 一步法RT-PCR反應(yīng)混合液：25yL的反應(yīng)體系中，包括One Step Enzyme Mix lyL，2 XlStep Buffer 12.5yL，引物對I的濃度為0.4μΜ，所述引物對I具有SEQ ID NO: 1-2所示的 核苷酸序列，具體地，引物對1的序列如下： 正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO: 1) 反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO:2) (2) NEST-PCR反應(yīng)混合液:20yL的反應(yīng)體系中，包括Premix Taq Mix 10yL，引物對2的 濃度為〇.4μΜ，所述引物對2具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列，具體地，引物對2的序列 如下： 正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO:3) 反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID N0:4)。2. -種結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 、RNA的獲取:提取待測草魚組織的總RNA，作為RT-PCR反應(yīng)的模板； (2) 、RT-PCR擴增:采用25yL的擴增體系，將反應(yīng)混合液置于PCR儀進行RT-PCR擴增，所 述反應(yīng)混合液中，包括步驟（1)獲取的RNA模板2yL，IStep Enzyme Mix lyL，2 X IStep Buffer 12.5yL，引物對I的濃度為0.4μΜ，余量由DEPC處理水補足，放入PCR儀進行RT-PCR擴 增，其中，所述引物對1具有SEQ ID NO: 1 -2所示的核苷酸序列，具體地，引物對1的序列如 下： 正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO: 1) 反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO:2) (3) 、檢測RT-PCR擴增結(jié)果:取RT-PCR擴增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠 成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在349bp大小處有條帶，則確定該樣品攜帶草魚出血病病毒 GCRV-GD108株，若電泳圖片在349bp大小處沒有條帶，則繼續(xù)進行步驟(4); (4) 、NEST-PCR擴增：以電泳圖片在349bp大小處沒有條帶的RT-PCR擴增產(chǎn)物作為模板， 進行NEST-PCR擴增，采用20yL的擴增體系:DNA模板2yL，EX Taq Mix 10yL，引物對2的濃度 為〇.4μΜ，其余為由滅菌ddH20補足，其中，所述引物對2具有SEQ ID N0:3-4所示的核苷酸序 列，具體地，引物對2的序列如下： 正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO:3) 反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID N0:4) (5) 、檢測NEST-PCR擴增結(jié)果：取NEST-PCR擴增產(chǎn)物，用I %的瓊脂糖凝膠電泳后，置于 凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片在206bp大小處有條帶，判定該樣品帶有草魚出血病病毒 GCRV-GD108 株。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測方法，其特征 在于，所述步驟(1)具體包括： A、 組織預(yù)處理:樣品預(yù)處理:取待測草魚樣品的組織300mg，加入600yL TN緩沖液(20mM Tris-HC1，0.4M NaCl，pH 7.4)勻漿（電動勻漿機，打5次，每次5-686(：)，室溫1200(^離心 15min，取上清； B、 Trizo 1試劑提取病毒RNA:在ImL Trizo 1試劑中加入150yL粗提取液，依照Trizo 1試 劑提取RNA的步驟進行，最后溶解30uL DEPC水中，用槍頭輕打幾次或室溫20min，直接用于 RT-PCR擴增，或-20度短暫保存、或-80°C冰箱保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測方法，其特征 在于，所述步驟(2)中，RT-PCR擴增的條件為:PCR反應(yīng)的條件為:50 °C 30min; 94 °C 2min;進入 循環(huán)：94￡€3〇86(：，551€3〇86(3,72°(：1111丨11，共35個〇7(316 ;最后一個反應(yīng)結(jié)束時，72°(：延伸 IOmin，4 °C 結(jié)束。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測方法，其特征 在于，所述步驟（4)中，NEST-PCR擴增的條件為：94°C，預(yù)變性2min;進入35個循環(huán)：98°C IOsec，56°C30sec，72°C50sec;最后一個循環(huán)結(jié)束后72 °C 延伸 IOmin，4 °C 保存。
【文檔編號】C12Q1/70GK105925730SQ201610537898
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】葉星, 董浚鍵, 趙立祥, 曾慶凱, 孫成飛, 田園園
【申請人】中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所