抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體D2-scFv及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體D2?scFv，它是利用人工合成的重組蛋白BontAL，及篩選抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體的底物GFP?HIS6?SNAP25（62）?VAMP（57）?C，在人源化抗A型肉毒毒素酶抗體庫中篩選出來的，親和常數(shù)為（6.89±0.65）×106L/mol，為生產抗A型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測A型肉毒毒素奠定了基礎。
【專利說明】
抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體D2-SCFV及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬生物技術領域，具體設及抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體D2-SCFV，及其 在生產治療A型肉毒毒素中毒藥物方面、檢測A型肉毒毒素方面的應用。
【背景技術】
[0002] 肉毒毒素是一種嗜神經蛋白毒素，能致使人及動物毒，少至0.1~1.化g含量可致人 中毒身亡。它已被美國疾病控制和預防中屯、指定為對人類的威脅類似于炭痘的生物武器， 被列為六個最主要的生物戰(zhàn)劑之一。依據(jù)毒素進入體內途徑的不同分為四個類型，一、食源 性中毒;二、嬰兒感染性肉毒中毒;S、創(chuàng)傷性肉毒中毒;四、吸入性中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然狀態(tài)下或者是在培養(yǎng)基中形成，通過細菌裂解釋放到 環(huán)境或培養(yǎng)液中，運種形態(tài)的毒素被稱為前體毒素，其分子量范圍在300 W)a到900 kDa。前 體毒素通常W復合體的形式存在，由神經毒素(Bont),由一個或多個能夠包圍和保護毒素 的非毒性蛋白組成，包括血凝素(HA)，非毒素非血凝素(NTNH)。臨床上所說的肉毒毒素通常 指具有神經毒性作用的神經毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根據(jù)其抗原性的不同，共存在屯種血清型(4、8、(：、0、6、。、6、），近年來又 發(fā)現(xiàn)第八種血清型。盡管屯種血清型的肉毒毒素組成成分與它的作用機制略有差別，但是 它們有著相近的分子量和相似結構。成熟肉毒毒素均由約150 kDa的單鏈多膚組成，蛋白質 成熟時通過細菌介導的蛋白酶將ISOkDa的單鏈多膚切割裂解成兩個不相等的多膚片段，兩 個片段由一個二硫鍵連接，形成一個分子量為SOkDa的輕鏈片段（LC)和一個分子量為 100W)a的重鏈片段(HC)。其中輕鏈有一個催化功能域，重鏈由同輕鏈并列的a-螺旋轉導域 化區(qū)，激發(fā)轉導的Hcn功能區(qū)和神經節(jié)巧脂結合區(qū)也細成。與化區(qū)緊鄰是一個含有54個氨基 酸膚段，即所謂的帶區(qū)，具有封閉輕鏈酶活性區(qū)，防止輕鏈折疊構象改變。輕鏈為鋒離子膚 鏈內切酶活性功能區(qū)，由Q-螺旋和e-折疊共同組成球形結構。單獨的輕鏈和重鏈均無毒性， 只有雙鏈才具有生物學毒性。
[0005] 輕鏈由細胞內毒素蛋白組成，具有鋒離子依賴內切酶活性，可抑制神經遞質的釋 放。肉毒毒素的活性區(qū)埋藏(~20 A深)于輕鏈中，表面負電荷，可通過一個通道獲得。梭狀神 經毒素的活性位點包括一個單一的鋒原子，運個鋒原子歷來被認為有功能，但是不起結構 性作用?？蒞通過用金屬馨合劑去除鋒，但是通過在二級結構上加入游離的鋒原子來重新 獲得鋒，毒素與底物結合的能力幾乎不變，但輕鏈的生物學活性卻大大的降低了，只相當于 原來的30%。位于輕鏈中屯、有一個高度保守的鋒結合模塊肥xxH (X是任意的氨基酸)序列。 皿XXH序列中含有一個由3個組氨酸整合的鋒離子，并對突觸泡膜蛋白質具有特異性蛋白 水解活性，運個催化位點位于蛋白質表面較深的裂縫中。
[0006] 在人類肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占據(jù)最重要的地位，其中A型肉毒 毒素輕鏈上的化S 222, Glu223和化S226殘基共同組成了鋒結合模塊肥X址序列的一部 分，并且在協(xié)調活性區(qū)鋒(His 222和化S226)和一個水分子(Glu223殘基）的作用機制中起 了直接的作用。G1U261是協(xié)調鋒的第=配體。甚至有人認為A型肉毒毒素的催化機理與嗜 熱菌蛋白酶是相似的，運是因為基于結構和序列相似的基礎上，他們的活性位點也是相似 的。從G1U223到Asp的突變使得活性幾乎全部失去，去除化S226使A型肉毒毒素失去了催化 活性。肉毒毒素中中和殘基的突變使催化速度常數(shù)明顯降低，但是不影響鋒結合和底物結 合，人們提出，運些殘基在過渡態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮了作用。
[0007] 另外，在LC活性中屯、還有一些氨基酸殘基，如化e266、Glu350Arg363和Tyr366。它 們的功能主要是維持和穩(wěn)定輕鏈活性中屯、的結構和/或它與被結合底物的相對位置，W此 保證輕鏈最佳的酶解能力。
[0008] LC通過二硫鍵與肥的N端連接。在二硫鍵存在的狀態(tài)下，毒素重鏈化結構域形成一 條loop結構，將深陷于輕鏈表面裂縫中的Zn2+催化部位遮蔽住，從而不表現(xiàn)酶活性。在雙鏈 毒素進入神經細胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現(xiàn)鋒離子內膚酶活性，催化部位 能夠容納底物16個氨基酸殘基。催化部位的鋒離子除同4個組氨酸殘基的咪挫環(huán)、1個結合 于保守谷氨酸的水分子形成配位鍵外，還與另一分子的谷氨酸簇基形成配位鍵，1個色氨酸 分子很可能也參與鋒離子的配位。毒素輕鏈的運種獨特鋒離子配位形式、空間結構與其他 所有已知的金屬蛋白酶的=維結構都不同，應當屬于一個新型的金屬蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病機理 1、祀細胞的識別與結合 前體毒素進入胃腸道，在消化過程中，非毒素組分對神經毒素起到保護作用，使其不會 受到各種消化酶和胃酸的侵蝕。由于分子量過大，毒素分子不是W擴散的方式，而是W"內 凹"和細胞攝入的方式通過腸粘膜上皮屏障，而不會破壞胃腸道。然后進入小腸中，在小腸 的微堿性環(huán)境下，前提毒素中的神經毒素解離出來，進入血液及淋己循環(huán)，在運動神經和交 感神經處發(fā)揮其毒性作用。盡管神經毒素可侵入不同的組織和器官，但不能穿透血腦屏障， 其惟一的親和祀點是外周膽堿能神經末梢。在膽堿能神經末梢，毒素的輕鏈能夠抑制神經 遞質乙酷膽堿在神經肌肉接頭處的釋放，導致肌肉麻搏。在運一毒性作用過程中，神經毒素 的各功能域都有參與，具體的過程可分為=個階段。
[0010] 祀細胞的結合與內化在祀細胞的識別與結合運一過程中，肉毒毒素重鏈的結合域 發(fā)揮了作用。結合域能夠識別膽堿能神經末梢，并與其發(fā)生特異性結合。結合域結合到運動 神經元的神經節(jié)巧脂和位于末端神經細胞膜表面小結上的蛋白受體，特別是具有親和力的 GD化，GHb和GQ化類神經節(jié)巧脂。然后由含有唾液酸的寡糖組成的神經節(jié)巧脂連接到神 經酷胺。通過對神經節(jié)巧脂分布及對其親和結合力的研究，可W確定，神經節(jié)巧脂不是唯一 能促進肉毒毒素結合的分子，而雙受體模型的提出表明，在發(fā)生內化作用前，肉毒毒素就已 經結合到了蛋白受體上。盡管有一些證據(jù)表明，突觸結合蛋白可能參與了A、B和E型的內化 作用，但是梭菌屬家族每一個成員的受體，還沒有完全確定。每個毒素與其蛋白共受體都是 特異性同源的，B型肉毒毒素與唾液酸乳糖的混合物就與肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神 經毒素與神經節(jié)巧脂結合的一個"鎖和鑰匙"原理。運個觀察成功說明了一個觀點，那就是 神經節(jié)巧脂結合使肉毒毒素靠近蛋白受體，促進了毒素的識別和內化。
[0011] -旦結合到神經元表面，母體分子裂解，重鏈和輕鏈通過鋒原子結合到達神經元 細胞膜，并且被內化進入細胞囊泡，形成一個包裹著毒素分子的酸性小囊泡。即內化過程。 運一受體介導的內吞過程與時間，溫度及突觸活動均有關。
[0012] 2、易位肉毒毒素的輕鏈必須從囊泡小室或者胞內體中出來，并且在H鏈N-末端作 用下的通過膜運輸能夠成功進入細胞溶質的祀蛋白，運一過程是稱為輕鏈易位； 與其它梭菌毒素一樣，肉毒毒素進入細胞內的酸性小泡后，會因 pH的變化而發(fā)生結構 重組。盡管進入突觸小泡和胞內小泡是顯而易見，但是肉毒毒素易位進入胞內小泡的特性 尚未斷然確定。抑的降低使肉毒毒素結構發(fā)生變化，從而導致其在分子中有較大的疏水性， 并且增加了脂雙層的滲透性。運樣毒素的重鏈和輕鏈能夠嵌入小泡的脂雙層內，一旦嵌入， 就會在憐脂雙層和PC12膜上形成離子通道。運個通道是具有選擇性的，分子量大的分子無 法通過，所W目前普遍認為毒素輕鏈可W通過離子通道從小泡腔內轉運到神經細胞胞質。 據(jù)此有S種輕鏈跨膜轉運假說模型，即管道模型（tunnel model),裂縫模型山16的model) 和裂解模型（lysis model)。其中裂縫模型理論認為，在低抑時，蛋白質的分子構想發(fā)生了 改變，此時HC可形成一個親水性的裂隙，并且在輕鏈穿膜過程中將其親水表面包圍。在此模 式中形成了親水性和疏水性的相互作用。輕鏈的簇基端因為二硫鍵與重鏈氨基端相連而最 先進入到胞質。實現(xiàn)易位后，由于胞質的抑高于酸性小泡，使輕鏈結構重新折疊，重新回到 具有催化活性。
[0013] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域發(fā)生構象上的變化，最終跨越人工膜形成離 子通道，并且在體內抑的環(huán)境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成的 離子通道與白喉毒素形成的相似，并且也是只在低pH下形成。肉毒毒素離子通道只允許陽 離子通過，但是可W在體外阻止氯哇。然而對于小孔徑離子通道的研究，我們尚未清楚肉毒 毒素形成的通道是不是毒素輕鏈進入細胞溶質的必經之路。數(shù)據(jù)顯示，在低抑下輕鏈的結 構有一個戲劇性的變化，就是可能產生一個選擇性的LC結構并且更適合于易位。盡管運在 體內還沒被證實，但是通過低P出秀導結構變化是完全可逆的。
[0014] 肉毒毒素能夠在神經傳遞發(fā)揮作用，就必須通過蛋白水解使LC與HN接頭處暴露的 表面產生缺口，從而使非活性的單鏈分子量為150-kDa的毒素活化。少數(shù)的細菌和組織蛋白 酶能夠實現(xiàn)運個裂解反應，并產生有活性的雙鏈神經毒素。產生切口后，輕鏈和重鏈仍然通 過非共價鍵相互作用，并且由一個單一的二硫鍵連接。運種鏈間的二硫鍵(A型肉毒毒素中 的切S430-切S454)的減少是輕鏈活化的第二階段，運是輕鏈自由進入運動神經元胞質溶膠 和與底物間相互作用必不可少的階段。正如前面提到的，在低抑情況下，輕鏈有一個戲劇性 的變化。運種結構的變化有助于易位帶(如果在易位點HN域確實是靠近輕鏈)的重組和導致 輕鏈的最終活化。神經元信號轉導通路可W與肉毒毒素-LC活動密切聯(lián)系在一起的。因此， 輕鏈活化的完成最終可能是發(fā)生在胞質溶膠中的，緊接著從低抑的小室中易位。
[00巧]3、抑制神經遞質釋放 神經小結處有突觸小囊泡，其中包含乙酷膽堿，它是能穿過神經肌肉接頭刺激肌肉收 縮的一種神經遞質。該乙酷膽堿的小囊泡被一個叫做SNARE復合體的蛋白聚合物所結合。為 了穿過神經肌肉交界處實現(xiàn)信號的傳遞，突觸前神經小結中的乙酷膽堿小囊泡必須被釋放 到突觸間隙中。在運里，神經遞質在肌肉板上結合到特定受體上，觸發(fā)離子通道打開，從而 導致相鄰橫紋肌的去極化和收縮。乙酷膽堿的釋放，需要有SNARE蛋白的參與，它能夠介導 突觸小泡與神經元細胞膜的融合。
[0016] SNARE復合體蛋白參與突觸小泡上質膜融合，而肉毒毒素輕鏈的作用是阻礙胞吐 作用。更具體地說，就是在肌肉接頭處，神經毒素通過切割SNARE蛋白（乙酷膽堿分子胞吐作 用所必須的物質)阻斷了囊泡內容物釋放到細胞外環(huán)境中，抑制乙酷膽堿的釋放，從而抑制 神經傳遞。據(jù)證實，單獨的SNARE蛋白裂解不會妨礙SNARE復合體形成，但是卻會導致非功能 性復合物在化h內流和融合之間的禪合被破壞。毒素在抑制神經遞質釋放時，需要化h的參 與，而在突觸末梢化濃度增加會影響肉毒毒素的作用效果。
[0017]輕鏈作為鋒膚鏈內切酶蛋白切割致使SNARE復合物不穩(wěn)定，成為非功能性，從而抑 制乙酷膽堿釋放到突觸間隙。囊泡釋放到突觸間隙的數(shù)量越少，動作電位傳播的概率就越 低，從而引起肌肉纖維的收縮。結果導致肌肉自身的化學去神經術而引起弛緩性麻搏?，F(xiàn)有 研究表明SNARE復合物由VAMP、SNAP-25和syntaxinS種蛋白質組成，下表所示為不同類型 的肉毒毒素的祀蛋白及其切割位點。
[001 引
隧菌體展示技術的基本原理是把外源DNA插入隧菌體編碼外殼蛋白pin或pVIiI的基 因中，使外源DNA片斷對應的表達產物融合在隧菌體的外殼蛋白中形成融合蛋白（fusion protein),呈現(xiàn)在隧菌體表面。隧菌體展示技術的顯著優(yōu)點是:建立了基因型(genotype)和 表型(phenotype)之間直接的物理聯(lián)系，從而使篩選簡便高效。將外源蛋白或多膚表達于隧 菌體表面，就可根據(jù)其性質利用它與其他生物或非生物物質的親和性對含目的基因的隧菌 體進行篩選。W隧菌體抗體庫的篩選為例，將化Mfragment antigen binding)表達在隧菌 體表面，W相應的抗原為親和性配體篩選，可W快速高效地從大量克隆中篩選表達特異性 抗體的隧菌體。因此，用隧菌體展示技術制備高親和性抗體與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技 術相比具有明顯的優(yōu)勢。
[0019] 隧菌體抗體在膜表面表達，是通過化b段或ScFv與單鏈隧菌體外殼蛋白形成融合 蛋白而完成。其特點是"它既可識別相應的抗原并與其結合，又能夠感染宿主菌進行再擴 增"。利用其可再擴增的特性，W祀抗原通過親和吸附-洗脫-擴增，可篩選到祀分子的配體 膚鏈。再經突變和鏈置換方法改進抗體親和力，最終便獲得高親和力的特異性抗體。隧菌體 抗體庫的篩選包括兩個主要步驟:淘篩和鑒定。淘篩是將隧菌體抗體庫與選擇用的抗原共 同解育，通過幾輪洗脫，收集結合的隧菌體。將獲得的隧菌體感染細菌并擴增，再進行下一 輪的淘篩。經幾輪淘篩后，便可富集到與抗原特異性結合的隧菌體感染的多克隆菌株。鑒定 過程是從隧菌體感染的多克隆菌株中挑選出單克隆菌株。即將淘篩出的隧菌體感染細菌、 鋪板、挑選，即可得到高特異性單克隆菌株。
[0020] 從隧菌體抗體庫中篩選表達特異性抗體的隧菌體的經典方法主要有兩種：（1)將 純抗原包被在固相介質上，如酶標板、免疫試管或親和層析柱，然后加入待篩選的隧菌體， 洗去非親和性或低親和性的隧菌體，回收高親和性的隧菌體。（2)將抗原與生物素基團相 連，再將其固定在包被有Streptavidin的順磁珠上對隧菌體進行篩選。兩種方法中均需加 脫脂牛奶(或BSA，其效果較差)封閉未被抗原占據(jù)的位點，W避免隧菌體非特異性的結合。 對于前一方法，回收與抗原特異性結合的隧菌體可用堿性溶液（如S乙基胺，Uriethy- Iamine)或酸性溶液(如甘氨酸一鹽酸，glycine_HCl)洗脫，或用可溶的抗原或半抗原洗脫； 對于后一方法，用二琉基蘇糖醇(dithiothret01，DTT)通過破壞抗原與生物素之間的二硫 鍵來洗脫?；厥盏乃砭w感染宿主菌，增殖后進行下一輪篩選。一般經過3-5輪運樣的篩選 可得到表達高親和性的目的抗體的克隆。每一輪篩選都需要進行檢測，W證實篩選的有效 性。
[0021] 英國MRC HGMP資源中屯、創(chuàng)建的Human Single Fold scFv Libraries I+J( Tomlinson I + J)是當今成熟的全人源隧菌體抗體庫，其庫容超過IO8全人源隧菌體單鏈 抗體，本研究利用該隧菌體庫淘選特異性抗A型肉毒毒素單鏈抗體，并對陽性單鏈抗體進行 系統(tǒng)分析，W期創(chuàng)制A型肉毒毒素中毒治療抗體類藥物奠定物質基礎。
[0022] 本發(fā)明人通過對肉毒毒素的作用機理的了解及研究，確定肉毒毒素能夠引起人畜 共患病，且主要攻擊體內的神經突觸系統(tǒng)，其致病機理為，肉毒毒素通過其重鏈C端結構域 結合于膽堿能神經元的突觸前膜，形成毒素受體復合物內化進入細胞囊泡，然后輕鏈鋒內 膚酶酶活性區(qū)從細胞內的酸性空間釋放進入細胞質。一旦從囊泡中釋放出來，輕鏈通過切 害化NARE復合物蛋白來阻止乙酷膽堿的釋放，引起肌肉麻搏。因此輕鏈為主要的致病部位。 目前，世界上中毒還是WA型居多，運是由于A型毒素在美容領域和醫(yī)學領域應用的增加，其 中毒的風險和幾率也相應增加。

【發(fā)明內容】

[0023] 本發(fā)明的目的是為解決異源性血清抗體在治療A型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反應或傳染疾病的問題，而提供一種全人源的單鏈抗體ScFv,抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗 體D2-scFv。
[0024] 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體02-scFv，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 5所 示； 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體02-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示； 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFV在生產治療A型肉毒毒素酶中毒藥物方面的 應用； 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFV在檢測A型肉毒毒素方面的應用。
[0025] 本發(fā)明提供了抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFV，它是利用人工合成的重 組蛋白BontA輕鏈蛋白，及篩選抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體的底物GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP(57)-C，人源化抗A型肉毒毒素酶抗體庫中篩選出來的，親和常數(shù)為（6.89± 0.65) X 106IVmo 1，為生產抗A型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測A型肉毒毒素奠定了基 礎。
【附圖說明】
[00%] 圖1為雙酶切重組質粒祀T-28(a)-BoNT/AL質粒鑒定結果；1.3.5.7為祀T-28(a)- 8〇饑'/41^切前;2.4.6.8質粒酶切后;]\1.0臟111曰'1?5'01^2000; 圖2為重組蛋白表達形式鑒定其中：1.3.5.7分別為37°(：、陰性對照、25°(：、30°(：誘導上 清;2、4、6、8:37 °C、陰性對照、25 °C、30°C誘導沉淀;M:蛋白質Marker; 圖3為重組蛋白包涵體洗涂的SDS-PAGE結果分析;其中：1-3:0.5%、1%、2%Trition洗涂 上清;4-9: Imol、2mol、3mol、4mol、6mol、SmolUrea洗涂上清；10-12: 4mol、6moUSmolUrea 洗涂沉淀樣品;M:蛋白質Marker; 圖4為重組蛋白純化產物SDS-PAGE結果分析；1:0.1mol/LNaOH ; 2:200mmol/L咪挫洗脫 樣品；3-4:50 mmol/L咪挫洗脫峰2、峰1; 5-6:20 mmol/L咪挫洗脫峰2、峰1; 7:流川;8:原樣； M:蛋白Marker; 圖5重組蛋白復性結果分析，1:復性蛋白；M:蛋白Marker; 圖6純化后E3-scFvSDS-PAGE結果分析；l:流穿2:55%硫酸錠原樣3:純化后scFv。
【具體實施方式】 [0027] 實施例1: A型肉毒毒素輕鏈基因與PET-2fe載體連接 WpGEM-BontA質粒為模板，設計特異性引物如下： PIa:5' -CATGCATATGAATAAACAATTTAATTATAAAGATC-3' P2a:5' - CGGAATTCTTAATTGTATCCTTTATCTAATGATT-3' PCR合成兩端插入Eco昭和Me；[酶切位點的BontAL基因，產物經瓊脂糖凝膠電泳分析后 回收目的片段。經測序其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[002引將EcoR!和Nde!雙酶切的載體陽T-2姑大片段與目的基因 BontAL小片段回收，并用 T4 DNA連接酶連接，得到重組質粒陽T-28a-BontAL，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，含kan 抗性的瓊脂糖平板進行初步篩選。挑選單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；用質?；厥赵噭┖?提取質粒。
[0029] 用限制性內切酶進行雙酶切鑒定，并送檢測序鑒定。瓊脂糖凝膠電泳分析酶切前 后條帶位置變化，并且在預期目的條帶位置處有相應大小的片段(見圖1)。證明目的基因已 連接至載體上，成功構建陽T-28a-BontAL。
[0030] 實施例2:重組蛋白陽T-28a-BontAL表達產物的SDS-PAGE結果分析 將重組質粒陽T-28a-BontAL轉化至表達菌-大腸桿菌化2UDE3)，不同溫度條件下IPTG 誘導表達后，SDS-PAGE結果顯示：37 °C、30 °C沉淀中重組蛋白陽T-28a-BontAL在50邸左右處 有一明顯表達帶，大小與理論值相符;見圖2;并且絕大部分蛋白位于沉淀中，因此此目的蛋 白為包涵體表達。
[0031] 實施例3:包涵體蛋白BontAL的洗涂 包涵體的純化處理，首先對包涵體進行洗涂，除去部分雜質，然后溶解打開包涵體，使 聚合在一起的蛋白彼此在裂解液的條件下打開分離，然后進一步純化目的蛋白。
[0032] 用不同含量的化ition對包涵體進行洗涂，Trition變形能力弱，只能起到初步洗 涂的作用。隨后逐步增加尿素濃度，漸進的洗涂打開包涵體，SDS-PAGE分析得到，2%的 Trition能夠去除部分雜質，2M尿素也有此作用，4M尿素開始目的蛋白開始分離，8M尿素能 夠完全打散包涵體，如圖3。
[0033] 實施例4:包涵體蛋白BontAL的純化和復性 經8M尿素溶解的包涵體，上清經金屬馨合層析Cu2+柱，收集200mmol咪挫洗脫蛋白。 SDS-PAGE分析如圖4，除去了大部分雜質。
[0034]用逐步透析復性的方法，每隔12個小時更換透析液，直至完全透析至化is中，用金 屬馨合層析化進行濃縮。蛋白透析至PBS中。SDS-PAGE鑒定如圖5,復性蛋白純度W達到。 [0(X3日]實施例5:全人源抗Bont-AkscFv抗體的篩選 純化的重組蛋白為抗原包被于96孔酶標板上，4°C過夜。次日棄上清，用2%的Milk-PBS 37°C封閉化，加入隧菌體抗體庫(隧菌體庫原始來源:Source Moscience(英國），中國經銷 商：北京西美科技有限公司），滴度為I.OXIOU，室溫下劇烈晃動解育60min，靜置60min。后 棄去液體，用含0.1%Twenn-20的PBS洗涂10次，洗涂后將每孔中殘留的液體輕輕拍干，每孔 加入5化L洗脫液巧mg/mL的膜酶-PBS)，室溫下劇烈晃動lOmin，洗脫隧菌體，收集4°C保存。
[0036] 用洗脫下的隧菌體侵染E. COli TGl，并涂布于TYE平板上(含10化g/mLAmp和1%的 葡萄糖）37°C過夜培養(yǎng)。利用輔助隧菌體KM13擴增隧菌體庫，通過PEG/化Cl回收隧菌體。重 復W上過程3次，共4輪篩選，收集篩選的隧菌體庫。
[0037] 實施例6:抗Bont-AkscFv陽性菌株鑒定 篩選后的隧菌體侵染凡皿2151，誘導表達后，利用化ISA鑒定，置酶標儀測定OD值 (波長為490nm)，每個樣品做雙孔測定，取OD平均值。W2%MUk-PBS為陰性對照，陽性克隆菌 株確定標準為:〇D值為陰性對照的3倍W上，共獲得27株陽性克隆菌株。
[0038] 陽性菌株生物活性檢測，將GFP-SNAP25-VAMP(氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2 所示，其基因序列SEQ ID NO. 3所示）用包被液稀釋，每孔包被30yg于檢測板（Pierce Maleimide Activated 96-well Plates,Black, 15153)中，4°C過夜，用Wash buffer洗涂3 次，將27株陽性菌株，誘導表達離屯、后，將10化L上清和6 yg Bont-AL混勻，加入到檢測板 中，37°C作用化，每份樣品做雙孔測定，再用Wash buffer洗涂3次，在多功能酶標儀上檢測 巧光強度，得出2株活性較好的菌株。按照Tomlinson I+J試劑盒上的pIT-2載體的基因序 列，合成兩條特異性PCR引物擴增SCFv全基因片段。
[0039] Pl LMB3: 5'一CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' P2 P肥N: 5' 一CTA TGC GGC CCC ATT CA-3' 經檢測2株陽性菌株，均能夠出現(xiàn)明顯867bp條帶，含有完整的scFv。
[0040] 測序鑒定其序列并經Blast數(shù)據(jù)庫分析得出：得出2株陽性菌株均為人源單鏈抗 體，分析如下：



實施例7:抗Bont-AkscFv純化W及抗體親和常數(shù)KD值測定 2株強陽性克隆菌株在37°C培養(yǎng)，至0D600到0.9,加入誘導劑30°C培養(yǎng)過夜（1化），過夜 培養(yǎng)物4°C，3500 X g離屯、30min，上清為表達的SCFv，大小為31000。誘導上清先后經過55%飽 和度硫酸錠沉淀和巧rotein-A親和層析后，得到純度在90%W上的樣品。
[0041 ]利用非競爭酶免疫法測定D2和E3單鏈抗體的親和常數(shù)，分別W4 yg/mL、化g/mL、l yg/mL和0.5 yg/血包被Bont-AL，將單鏈抗體濃度調整到10-6 mol/L，倍比稀釋1: 2~1:512， 用1: 5000倍稀釋的Protein A-HRP抗體作為二抗，OPD顯色，測定0D49化m吸光值，每個樣品 做雙孔測定，取OD平均值。根據(jù)抗原抗體結合反應的S形曲線圖，能夠求解出在不同抗原濃 度下板書吸光值的抗體濃度，帶入到公式KA=(n-l)/2(nAb'-Ab)計算親和常數(shù)，其中Ab'和 Ab表示當抗原為Ag'和Ag時，產生半數(shù)吸光值的抗體濃度(mol/L)，n=Ag/Ag'，當n=2時可W 得到3個KA值，n=4時可得2個KA值，n=8時得1個KA值，把六個KA值取平均數(shù)就是最終的親和 常數(shù)數(shù)值。
[0042] 從下表可看出D2單鏈抗體的親和常數(shù)為(6.89±0.65) X IO6IVmol，E3的親和常數(shù) 為（1.92±0.47)Xl〇7L/mol。
【主權項】
1. 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體似，其特征在于:堿基序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。2. 抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFv，其特征在于：氨基酸序列如序列表SEQ ID NO .6所示。3. 根據(jù)權利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFV在生產治療A型肉 毒毒素酶中毒藥物方面的應用。4. 根據(jù)權利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體D2-SCFV在檢測A型肉毒毒 素方面的應用。
【文檔編號】A61K39/40GK105924520SQ201610520548
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】岳玉環(huán), 徐艷玲, 張國利, 田園, 吳廣謀, 劉雨玲, 李澤鴻, 周博, 田多, 王冬冬, 馬洪媛, 吉元剛, 李健
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所