微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體及其制備方法和應(yīng)用，該方法從殼聚糖低聚寡糖出發(fā)，合成了含酰腙鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖(SRCS)。采用共價(jià)接枝方法對(duì)SRCS進(jìn)行聚乙烯亞胺和聚乙二醇接枝，得到氧化還原微環(huán)境和酸微環(huán)境雙重響應(yīng)聚合物SRCS?g?PEI?g?PEG。本發(fā)明所制備的SRCS?g?PEI?g?PEG聚合物具有對(duì)微環(huán)境雙重響應(yīng)控制釋放基因的性能。本發(fā)明還提供該方法獲得的SRCS?g?PEI?g?PEG聚合物作為基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，表現(xiàn)出良好的生物相容性和高的基因轉(zhuǎn)染效率，是基因轉(zhuǎn)染的優(yōu)良載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體，具體地說(shuō)，涉及一種酰腙鍵和 二硫鍵交聯(lián)殼聚糖接枝聚乙烯亞胺和聚乙二醇的聚合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因治 療領(lǐng)域新型高效非病毒基因載體的制備方法與技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療通過(guò)將外源基因?qū)氲桨屑?xì)胞核內(nèi)以修復(fù)導(dǎo)致疾病的缺陷基因或者抑 制導(dǎo)致疾病的有害基因，從而使機(jī)體恢復(fù)正常功能，達(dá)到治療疾病的目的【1.中國(guó)發(fā)明專 利，公開(kāi)號(hào)CN 102140171A，發(fā)明名稱為：用作非病毒基因載體材料的谷胱甘肽修飾殼聚糖 共聚物及其制備和應(yīng)用】?；蛑委熂夹g(shù)為常規(guī)醫(yī)療手段難以治愈的疾病提供了新的治療 方法。分子生物學(xué)的發(fā)展和人類基因庫(kù)的建立推動(dòng)了基因治療的臨床應(yīng)用，使其不僅在治 療遺傳性先天疾病和惡性腫瘤等領(lǐng)域發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，并且越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于各種普遍性疾病 的治療。基因治療的關(guān)鍵在于開(kāi)發(fā)安全、高效的基因遞送載體。
[0003] 殼聚糖，作為唯一一種天然陽(yáng)離子堿性多糖，具有良好的生物降解性、生物相容 性、低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，其所攜帶的氨基陽(yáng)離子能夠復(fù)合DNA形成納米微球，正成為非病毒 基因載體的熱門研究?jī)?nèi)容之一。殼聚糖對(duì)DNA的保護(hù)壓縮能力與其分子量密切相關(guān)。大分子 殼聚糖可以很好的保護(hù)和壓縮DNA，但進(jìn)入細(xì)胞后難以釋放DNA，而低分子量殼聚糖卻因不 能很好的保護(hù)DNA使DNA在進(jìn)入細(xì)胞之前即被降解。因而設(shè)計(jì)即能在細(xì)胞外環(huán)境中很好地保 護(hù)DNA、又能使DNA在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中快速釋放的殼聚糖基非病毒基因載體，對(duì)殼聚糖基基因 載體的研究具有十分重要的意義。
[0004] 人體病變部位(如腫瘤)的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)存在明顯的氧化還原環(huán)境差異，細(xì)胞外 傾向于氧化性環(huán)境，以保持細(xì)胞膜蛋白等二硫鍵的穩(wěn)定性，而細(xì)胞內(nèi)則是過(guò)度表達(dá)的高濃 度谷胱甘肽形成的還原性環(huán)境【2. ChemSoc Rev ,2013,42(17) :7289-325 .Functional block copolymer assemblies responsive to tumor and intracellular microenvironments for site-specific drug delivery and enhanced imaging performance】。載體和基因的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)經(jīng)歷不同pH值梯度的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從生 理pH值條件到早期內(nèi)涵體(pH = 5.5-6.2 )、再到晚期內(nèi)涵體和溶酶體(pH = 5.0-5.5)。因此 可以利用病變部位細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的氧化還原物質(zhì)和酸性物質(zhì)濃度的梯度差異，設(shè)計(jì)具有環(huán) 境刺激響應(yīng)性能的殼聚糖基因載體，巧妙解決載體壓縮與釋放DNA的矛盾，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的控 制釋放，提尚載體的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率。
[0005] 采用環(huán)境敏感的化學(xué)鍵對(duì)小分子聚合物進(jìn)行交聯(lián)，得到大分子聚合物，是解決上 述問(wèn)題的有效途徑之一【3 · Biomacromolecules ,2015,16(4): 1390-1400. Reversibly Cross-Linked Polyplexes Enable Cancer-Targeted Gene Delivery via Self-Promoted DNA Release and Self-Diminished Toxicity】。從目前文獻(xiàn)的調(diào)研結(jié)果看，尚 未有任何報(bào)道是以酸和還原敏感化學(xué)鍵交聯(lián)殼聚糖，合成酸和還原環(huán)境響應(yīng)大分子交聯(lián)殼 聚糖，再進(jìn)行聚乙烯亞胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)接枝，構(gòu)建具有具有"質(zhì)子海綿效應(yīng)"和長(zhǎng) 循環(huán)穩(wěn)定性、還原環(huán)境和酸性環(huán)境雙重響應(yīng)控釋基因的殼聚糖基非病毒基因載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有殼聚糖基因載體的缺陷，提供一種新型 酰腙鍵和二硫鍵交聯(lián)殼聚糖接枝PEI和PEG聚合物及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種新型含酰腙鍵和二硫鍵交聯(lián)殼聚糖(SRCS)，其 具有式(I)結(jié)構(gòu)：
[0008]
[0018] 乙二醇（3此5飛^^1飛^^〇，其具有式（11)結(jié)構(gòu)：
[0019]
[0020] 其中，Ri、R2獨(dú)立地為C^e的烷基或C24的烯基或含1~3個(gè)苯環(huán)的芳基；
[0021 ] U為酰脲鍵或者氨基甲酸酯鍵;L2為酰脲鍵。
[0022]優(yōu)選地，、R2 獨(dú)立地為-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。
[0023] 所述SRCS-g-PEI-g-PEG通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):含酰腙鍵和二硫鍵的大分子殼聚 糖與聚乙烯亞胺和聚乙二醇的進(jìn)行接枝共聚反應(yīng)，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
[0024] 將制備的含酰腙鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖加入離子液體中，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的CDI，犯氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)充分并加入mPEG和PEI， 反應(yīng)混合物在去離子水中透析，冷凍干燥得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。優(yōu)選地，mPEG與 SRCS質(zhì)量比為：（0.1~1):1，更優(yōu)選(0.2~0·7):1;PEI與SRCS質(zhì)量比為 ：（0·1~1):1，更優(yōu) 選(0.1 ~0.6):1。
[0025] 本發(fā)明所用離子液體優(yōu)選咪唑類離子液體，但不限于咪唑類離子液體（比如1-丁 基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體)或者離子液體反應(yīng)介質(zhì)(如氨基酸鹽酸鹽離子液體）；更優(yōu) 選采用羰基二咪唑等偶聯(lián)試劑對(duì)SRCS進(jìn)行聚乙烯亞胺和聚乙二醇接枝，但本發(fā)明不限于偶 聯(lián)試劑共價(jià)接枝，還可以使用本領(lǐng)域常用的其他接枝方法，如在反應(yīng)體系中加入引發(fā)劑甲 基苯磺酸甲酯和2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化鉀/甲醇溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接 枝或者向體系中加入鹽酸和氮丙啶聚合，進(jìn)行PEI接枝。
[0026] 本發(fā)明同時(shí)請(qǐng)求保護(hù)上述微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明通過(guò)含酰腙鍵和二硫鍵的化合物對(duì)殼聚糖低聚寡糖進(jìn)行交聯(lián)，得到以酸和 還原敏感大分子殼聚糖SRCS，再對(duì)SRCS進(jìn)行聚乙烯亞胺和聚乙二醇接枝，得到微環(huán)境雙重 響應(yīng)聚合物基因載體SRCS-g-PEI-g-PEG，巧妙解決基因轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外基因壓縮與釋 放的矛盾，有效提高基因轉(zhuǎn)運(yùn)，是基因轉(zhuǎn)運(yùn)的優(yōu)良載體。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] 1.本發(fā)明從低分子殼聚糖低聚寡糖出發(fā)，制備了二硫鍵和酰腙鍵交聯(lián)大分子殼聚 糖SRCS，具有在酸環(huán)境和氧化還原環(huán)境中響應(yīng)斷裂的環(huán)境敏感性能。
[0030] 2.本發(fā)明對(duì)所獲得的SRCS聚合物進(jìn)行聚乙烯亞胺和聚乙二醇接枝，得到SRCS-g-PEI -g-PEG聚合物基因載體，協(xié)同SRCS的微環(huán)境雙重響應(yīng)性能、PE I的質(zhì)子海綿效應(yīng)和PEG的 血液循環(huán)穩(wěn)定性。
[0031] 3.SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物表現(xiàn)出良好的生物相容性和高的基因轉(zhuǎn)染效率，是基 因轉(zhuǎn)染的優(yōu)良載體，基因載體在細(xì)胞外能夠有效壓縮基因，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)胞內(nèi)微環(huán)境進(jìn)行響 應(yīng)，釋放基因，有效解決基因壓縮與釋放的矛盾，基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率高、細(xì)胞毒性低，在基因治療 領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為實(shí)施例1所制備的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的FTIR譜圖；
[0033] 圖2為實(shí)施例1所制備的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的1HNMR譜圖；
[0034] 圖3為實(shí)施例1所制備的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的13C-CP/MASNMR譜圖；
[0035]圖4為實(shí)施例1所制備的SRCS-g-PEI-g-PEG與DNA形成的穩(wěn)定的復(fù)合物在酸和還原 環(huán)境中響應(yīng)釋放DNA的能力考查結(jié)果；其中，0泳道為DNA標(biāo)記，1泳道為DNA，圖4-a的2-12泳 道pH值分別為7·4，7.0,6.5,6.0,5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0,2.5;圖4-b的2-12泳道分別含 lOyg/yL DTT為0，l，2,3,4,5,6,7,8,9，10yL;
[0036] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例9制備的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的基因轉(zhuǎn)染效率;其 中，PEI25表示PEI分子量為25kDa; PEI 1.8表示PEI分子量為1.8kDa;
[0037] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例9制備的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的MTT細(xì)胞毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面通過(guò)具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具 體實(shí)施例和附圖僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú) 特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從化學(xué)藥品 店購(gòu)買得到的。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 低分子量殼聚糖(CS0)0.8554g，溶于50mL的NaAc/HAc(pH=4.5)的緩沖溶液中，超 聲30min，使其溶解。高碘酸鈉0.1093g，溶于50mL的NaAc/HAc(pH=4.5)的緩沖溶液中，超聲 30min。以上兩種溶液分別置于冰浴，并通入高純氮?dú)饷摎?0min，將兩種溶液混合，在0-4 °C 下攪拌反應(yīng)26h，加入10mL乙二醇中止反應(yīng)。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋(MW⑶= 3000Da)中，在 NaAc/HAc緩沖溶液中透析24h，再經(jīng)去離子水透析48h，凍干，得到醛基殼聚糖。稱取醛基殼 聚糖0.16g，3，3 ' -二硫代二（丙酸肼)0.10g，冰醋酸三滴，無(wú)水乙醇30mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)，68 °C下 攪拌回流42h，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，殘余物加去離子水轉(zhuǎn)移到透析袋中，去離子水中透 析48h，凍干。產(chǎn)物經(jīng) 1HNMR、13C-CP/MAS ^?小111?、1^、6?(：表征進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，31^3中二硫鍵 的含量采用紫外可見(jiàn)吸光度法通過(guò)Ellman試劑法測(cè)定，氧化得到的醛基殼聚糖的醛基含量 通過(guò)鹽酸羥胺反滴定的方法確定。
[0041 ]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙猓?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH2，犯氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.45mol殼聚糖氨基葡 萄糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 將制備的SRCS加入[BMIM]C1離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，犯氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.45mol殼聚糖氨基葡 萄糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0044] 實(shí)施例3
[0045]將制備的SRCS加入DMF中，40°CN2氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枋咕鶆蚍稚?，加入與殼聚糖氨 基葡萄糖單元等摩爾量的〇01，％氣保護(hù)下40°C攪拌反應(yīng)12h，再加入0.3mol殼聚糖氨基葡 萄糖單元的mPEG-NH 2，Nd保護(hù)下40°C反應(yīng)12h，最后加入0.45mol殼聚糖氨基葡萄糖單元的 卩已1，他氣保護(hù)下40°C攪拌反應(yīng)12h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至 透析袋中（MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0046] 實(shí)施例4
[0047]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-OH，N 2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.45mol殼聚糖氨基葡 萄糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0048] 實(shí)施例5
[0049] 將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，他氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入0. lmol對(duì)甲基苯磺酸甲酯引 發(fā)劑和殼聚糖氨基葡萄糖單元〇. 6倍摩爾量的2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化 鉀/甲醇溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0050] 實(shí)施例6
[00511將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-OH，N 2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入對(duì)甲基苯磺酸甲酯引發(fā)劑和 〇. 6倍殼聚糖氨基葡萄糖單元摩爾量的2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化鉀/甲醇 溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移 至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
[0052] 實(shí)施例7
[0053]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙猓?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入殼聚糖氨基葡萄糖單元0.1 倍摩爾量的鹽酸，再滴加殼聚糖氨基葡萄糖單元5倍摩爾量氮丙啶聚合，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
[0054] 實(shí)施例8
[0055]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-OH，N 2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入殼聚糖氨基葡萄糖單元0.1 倍摩爾量的鹽酸，再滴加殼聚糖氨基葡萄糖單元5倍摩爾量氮丙啶聚合，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da )，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PE I -g-PEG聚合物。
[0056] 實(shí)施例9
[0057]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0058] 實(shí)施例10
[0059] 將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.6mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0060] 實(shí)施例11
[00611將制備的SRCS加入[BMIM]C1離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0062] 實(shí)施例12
[0063] 將制備的SRCS加入[BMIM]C1離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.6mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0064] 實(shí)施例13
[0065]將制備的SRCS加入DMF中，40°CN2氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枋咕鶆蚍稚?，加入與殼聚糖氨 基葡萄糖單元等摩爾量的〇01，％氣保護(hù)下40°C攪拌反應(yīng)12h，再加入0.3mol殼聚糖氨基葡 萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下40°C反應(yīng)12h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄糖單元的 卩已1，他氣保護(hù)下40°C攪拌反應(yīng)12h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至 透析袋中（MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0066] 實(shí)施例14
[0067]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-〇H，N：^保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0068] 實(shí)施例15
[0069] 將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙猓?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.6mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-〇H，N：^保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，最后加入0.3mol殼聚糖氨基葡萄 糖單元的PEI，N2氣保護(hù)下80 °C攪拌反應(yīng)2h。在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合 物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0070] 實(shí)施例16
[0071]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙猓?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，他氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入0. lmol對(duì)甲基苯磺酸甲酯引 發(fā)劑和殼聚糖氨基葡萄糖單元〇. 3倍摩爾量的2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化 鉀/甲醇溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0072] 實(shí)施例17
[0073]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.6mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，他氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入0. lmol對(duì)甲基苯磺酸甲酯引 發(fā)劑和殼聚糖氨基葡萄糖單元ο. 6倍摩爾量的2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化 鉀/甲醇溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0074] 實(shí)施例18
[0075]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.6mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，他氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入0. lmol對(duì)甲基苯磺酸甲酯引 發(fā)劑和殼聚糖氨基葡萄糖單元〇. 3倍摩爾量的2-乙基-2-噁唑啉，經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合后，以氫氧化 鉀/甲醇溶液閉環(huán)，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混 合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(MWC0 = 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。
[0076] 實(shí)施例19
[0077]將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入殼聚糖氨基葡萄糖單元0.1 倍摩爾量的鹽酸，再滴加殼聚糖氨基葡萄糖單元3倍摩爾量氮丙啶聚合，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da)，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
[0078] 實(shí)施例20
[0079] 將制備的SRCS加入[BMIM]Ac離子液體中，80 °C油浴犯氣保護(hù)下充分?jǐn)嚢枞芙?，?入與殼聚糖氨基葡萄糖單元等摩爾量的⑶1，犯氣保護(hù)下80°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0.3mol殼 聚糖氨基葡萄糖單元的mPEG-NH 2，N2氣保護(hù)下80°C反應(yīng)2h，加入殼聚糖氨基葡萄糖單元0.1 倍摩爾量的鹽酸，再滴加殼聚糖氨基葡萄糖單元1倍摩爾量氮丙啶聚合，進(jìn)行PEI接枝，反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入適量去離子水，將反應(yīng)液混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中（MW⑶= 8000-14000Da )，去離子水中透析3天，冷凍干燥，得到SRCS-g-PE I -g-PEG聚合物。
[0080] SRCS-g-PE I -g-PEG/DNA復(fù)合物的環(huán)境響應(yīng)性能測(cè)定
[00811 采用瓊脂糖凝膠電泳考察SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA復(fù)合物在酸環(huán)境中響應(yīng)釋放DNA 的性能：以pH值從7.4到4.0變化的roS緩沖溶液，新鮮制備SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA復(fù)合物， 孵育lh后，加入Loading Buffer進(jìn)行電泳?？疾鞆?fù)合物還原環(huán)境中響應(yīng)釋放DNA的性能：新 鮮制備SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA復(fù)合物，加入不同濃度的DTT，孵育lh后加入Loading Buffer 進(jìn)行電泳測(cè)試。
[0082] SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率的測(cè)定
[0083]采用pGL3質(zhì)粒為報(bào)告基因，對(duì)SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物載體的基因轉(zhuǎn)運(yùn)性能進(jìn)行 評(píng)價(jià)，10%血清條件下的基因轉(zhuǎn)運(yùn)和無(wú)血清條件下的基因轉(zhuǎn)運(yùn)作對(duì)比，所用細(xì)胞為人非小 細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞系。將培養(yǎng)好的細(xì)胞鋪板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80% 后，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，將完全培養(yǎng)基吸去，用PBS洗滌兩次，血清條件下轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，加入 400yL含10%血清的培養(yǎng)基和不同N/P比（質(zhì)量比）的SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA復(fù)合物(每孔含 lyg DNA)，培養(yǎng)18h后，吸出培養(yǎng)基，換上新鮮的含10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)32h后，進(jìn)行 檢測(cè)，無(wú)血清條件下的轉(zhuǎn)運(yùn)僅僅在轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，將加入的400yL含10%血清的培養(yǎng)基替換為無(wú)血 清培養(yǎng)基，與不同N/P比（質(zhì)量比）的SRCS-g-PEI -g-PEG/DNA復(fù)合物(每孔含lyg DNA)孵育5h 后，再將無(wú)血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)45h進(jìn)行檢測(cè)。按照熒光素酶試劑盒所提 供的說(shuō)明書(shū)在BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)光子的強(qiáng)度，用BCA檢測(cè)出總蛋白的濃 度，從而將結(jié)果統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化成RLU/mg蛋白（每毫克蛋白所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光子數(shù)）。
[0084] SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的細(xì)胞毒性
[0085] 載體的細(xì)胞毒性采用MTT法進(jìn)行評(píng)價(jià)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上種植細(xì)胞，平行3孔，每 孔種植5 X 104個(gè)細(xì)胞，在37 °C，5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到85 %以上。移去 培養(yǎng)基，用PBS洗2次后，加入新鮮培養(yǎng)基和待測(cè)載體，培養(yǎng)24h后，每孔加入20yL 5mg/mL的 MTT溶液，37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4h，移去培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原 MTT生成甲臢，每孔加入150yL DMS0使溶解，在37°C繼續(xù)孵育30min。在多功能酶標(biāo)儀 (Sunrise Tecan)上測(cè)定570nm波長(zhǎng)各孔的吸收值，檢測(cè)前震動(dòng)96孔板自動(dòng)混勾600s，并采 用無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)酶標(biāo)儀調(diào)零。細(xì)胞存活率按公式1.1計(jì)算：
[0086] 細(xì)胞存活率（％)=A570smp/A570ctlX100 (1.1)
[0087] 其中A570smp為加入待測(cè)載體或復(fù)合物的細(xì)胞孔板的吸光值，A570CTL為只含培養(yǎng)基 的細(xì)胞孔板的吸光值。
[0088] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖，其特征在于，具有式(I)結(jié)構(gòu)：其中，Ri、R2獨(dú)立地為打的烷基或C2~6的締基或含1~3個(gè)苯環(huán)的芳基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖，其特征在于，Ri、R2獨(dú)立地 為-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。3. -種如權(quán)利要求1所述含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖的制備方法，其特征在于， 采用高艦酸鹽、殼聚糖低聚寡糖在醋酸-醋酸鹽緩沖溶液中，0-4°C攬拌反應(yīng)10-3化，再加入 乙二醇終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)透析、冷凍干燥，制備醒基殼聚糖，再將醒基殼聚糖分散到醇溶 液中，加入二硫代二酷阱化合物，再加入適量冰醋酸，在惰性氣體保護(hù)下，20-100°C的反應(yīng) 溫度下攬拌回流2-80h，去離子水透析后，冷凍干燥，得到酷腺鍵和二硫鍵交聯(lián)殼聚糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖的制備方法，其特征在于，所 述殼聚糖低聚寡糖的重均分子量為500-10000Da，脫乙酷度為65-95%。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖的制備方法，其特征在于，所 述二硫代二酷阱化合物為二硫代雙乙酷阱、二硫代雙丙酷阱或二硫代雙苯酷阱中的一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖的制備方法，其特征在于，二 硫代二酷阱化合物用量為醒基殼聚糖重復(fù)單元摩爾當(dāng)量的0.1-2倍，反應(yīng)條件為20-100°C 回流2-8化。7. 微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體，其特征在于，具有式（n)結(jié)構(gòu)：式nn 其中，Ri、R2獨(dú)立地為Cl~6的烷基或C2~6的締基或含I~3個(gè)苯環(huán)的芳基。優(yōu)選地，Ri、R2獨(dú) 立地為-C出-或-C2此-或-C6H4-山為酷脈鍵或者氨基甲酸醋鍵;L勸酷脈鍵。8. -種如權(quán)利要求7所述的微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體的制備方法，其特征在于， 含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖與聚乙締亞胺和聚乙二醇進(jìn)行接枝共聚反應(yīng)，得到 SRCS-g-PEI-g-PEG 聚合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體制備方法，其特征在于，將制 備的含酷腺鍵和二硫鍵的大分子殼聚糖加入離子液體中，充分?jǐn)埌枞芙夂蠹尤肱c殼聚糖氨 基葡萄糖單元等摩爾量的CDI，化氣保護(hù)下攬拌反應(yīng)加入mPEG和PEI，反應(yīng)混合物在去離子 水中透析，冷凍干燥得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。10. 權(quán)利要求7所述的微環(huán)境雙重響應(yīng)殼聚糖基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105906815SQ201610482178
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】張樹(shù)彪, 陳會(huì)英, 崔韶暉, 海華
【申請(qǐng)人】大連民族大學(xué)