檢測(cè)寨卡病毒的巢式rt-pcr方法、引物及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了兩組引物對(duì)，其中一組引物對(duì)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，另一組引物對(duì)包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，本發(fā)明還提供了所述兩組引物對(duì)在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用，同時(shí)本發(fā)明還提供了含有該兩組引物對(duì)的試劑盒及應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的兩組引物對(duì)特異性好、靈敏度高且重復(fù)性好，且基于該兩組引物對(duì)建立的寨卡病毒的檢測(cè)方法，可靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定和快速的檢測(cè)寨卡病毒的存在，對(duì)我國(guó)的寨卡病毒臨床快速診斷和公共防控都具有重要的意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
檢測(cè)寨卡病毒的巢式RT-PCR方法、引物及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別設(shè)及檢測(cè)寨卡病毒的巢式RT-PCR方法、引物及試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)于1947年首次在烏干達(dá)從恒河猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，1952 年在烏干達(dá)和坦桑尼亞的人體中分離到病毒。ZIKV通過(guò)受到感染的伊蚊屬蚊蟲(chóng)叮咬傳播到 人，運(yùn)主要設(shè)及熱帶地區(qū)的埃及伊蚊。它與傳播登革熱、基孔肯雅熱和黃熱病的蚊蟲(chóng)相同。 然而，已有兩例寨卡病毒通過(guò)性傳播的病例，在另一例病例中發(fā)現(xiàn)精液中存在寨卡病毒。
[0003] 近年來(lái)ZIKV感染病例和暴發(fā)疫情的國(guó)家及地區(qū)增加明顯，2007年首次在太平洋島 國(guó)密克羅尼西亞的雅浦島出現(xiàn)寨卡病毒暴發(fā)疫情，2013年和2015年又分別在法屬波利尼西 亞和己西發(fā)生大型疫情。已有的研究表明寨卡病毒病可能會(huì)造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā) 癥，在己西出現(xiàn)的疫情中，當(dāng)?shù)匦l(wèi)生當(dāng)局發(fā)現(xiàn)在普通民眾中寨卡病毒感染和吉蘭-己雷綜合 征同時(shí)有所上升，目前研究人員正在對(duì)吉蘭-己雷綜合征病例激增與寨卡病毒感染之間潛 在的但尚未證實(shí)的聯(lián)系進(jìn)行研究。另外越來(lái)越多的證據(jù)表明寨卡病毒與小頭癥之間存有關(guān) 聯(lián)。2015年5月，己西報(bào)告首例寨卡病毒病病例，同年10月，己西報(bào)告新生兒小頭崎形明顯上 升，時(shí)空分布與寨卡病毒流行區(qū)相吻合。然而，在能夠更好地解釋嬰兒小頭癥與寨卡病毒之 間的關(guān)系之前仍需要做出更多調(diào)查，目前對(duì)其它可能病因還在開(kāi)展進(jìn)一步調(diào)查。
[0004] 寨卡病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，為單鏈正義RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約10.8化。寨卡病毒粒子呈球形，直徑約40-70nm。分子生物學(xué)和生物信息 學(xué)分析表明，寨卡病毒主要存在非洲型和亞洲型兩個(gè)亞型，在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上與同為黃病毒 屬的登革病毒、日本腦炎病毒及西尼羅病毒相近。寨卡病毒基因組只有一個(gè)開(kāi)放讀碼框 (open reading frame，0RF)，所編碼的蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切割成不同的 功能蛋白，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM/M、E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B、NS5)。
[0005] 2016年2月9日，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)通報(bào)中國(guó)確診第一例輸入性寨卡病毒 感染病例，此后輸入性感染病例時(shí)有報(bào)告發(fā)生，說(shuō)明我國(guó)針對(duì)寨卡病毒的防控形勢(shì)嚴(yán)峻。目 前還沒(méi)有針對(duì)寨卡病毒的巢式RT-PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的巢式RT-PCR檢測(cè)寨卡病毒的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高和重復(fù)性好的 兩組引物對(duì)和含有該兩組引物對(duì)的試劑盒及應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明第一方面提供了兩組引物對(duì)，其中一組引物對(duì)包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列，另一組引物對(duì)包含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核巧酸序 列。
[0008] 本發(fā)明第二方面提供了所述的兩組引物對(duì)在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009] 在一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品還包括PCR擴(kuò)增試劑。
[0010] 本發(fā)明第=方面提供了一種試劑盒，包括所述的兩組引物對(duì)。
[0011] 在一優(yōu)選例中，還包括PCR擴(kuò)增試劑。
[001^ 在一優(yōu)選例中，所述PCR擴(kuò)增試劑包括來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的！'aKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒所包含的5XPCR Buffer和Ex hq服DNA聚合酶。
[OOU] 在一優(yōu)選例中，還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0014] 在一優(yōu)選例中，還包括RNA提取試劑。
[001引在一優(yōu)選例中，所述RNA提取試劑包括來(lái)自QIAGEN公司的貨號(hào)為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑。
[0016] 在一優(yōu)選例中，還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑。
[0017] 在一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來(lái)自^KaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒所包含的試劑。
[001引在一優(yōu)選例中，所述來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 試劑盒所包含的試劑為 MgCl2、dNTP Mixture、R化 Se Inhibi tor、AMV Reverse Transc;rip1:ase XL、Random 9mers和RNase Rree 地20中的至少一種。
[0019] 本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明第五方面提供了一種篩選易患寨卡病毒病的生物樣品的系統(tǒng)，包括：
[0021] 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的核酸樣本；
[0022] 巢式RT-PCR裝置，所述巢式RT-PCR與所述核酸提取裝置相連，適用于采用權(quán)利要 求1所述的兩組引物對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)；W及
[0023] 判斷裝置，所述判斷裝置與所述巢式RT-PCR裝置相連，W便基于巢式RT-PCR反應(yīng) 的結(jié)果，判斷所述生物樣品是否易患寨卡病毒病。
[0024] 在一優(yōu)選例中，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括：
[0025] RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從生物樣品中提取RNA樣本;W及
[0026] 逆轉(zhuǎn)錄單元，所述逆轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，W便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
[0027] 在一優(yōu)選例中，所述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血液、細(xì)胞或組織，或?yàn)橘|(zhì) 粒，或?yàn)镈NA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA、mRNA或cDNA片段的試劑。
[002引在一優(yōu)選例中，當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA或cDNA片 段的試劑，或?yàn)橘|(zhì)粒時(shí)，將其直接作為核酸樣本與所述兩組引物對(duì)進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)。
[0029] 在一優(yōu)選例中，當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、尿液、細(xì)胞或組織，或?yàn)?mRNA，或?yàn)楹衜RNA的試劑時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為DNA、CDNA或CDNA片段的核酸樣本再與所述兩組 引物對(duì)進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)。
[0030] 在一優(yōu)選例中，所述巢式RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：
[0031] 第一輪反應(yīng)體系：
[0032] 5 XPCR Buffer 10化
[003；3] Ex化9服DNA聚合酶0.2化1
[0034] 引物對(duì)沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2濃度為IOiiM，各0.化1
[0035] DNA或cDNA或cDNA片段I X IO3-I X IO9拷貝/化，化L
[0036] 加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為SOiiL得到巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物；
[0037] 第二輪反應(yīng)體系：
[0038] 5 X PCR Buffer 10化
[0039] Ex hq 服 DNA聚合酶 0.2^iL，
[0040] 引物對(duì)沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4濃度為IOiiM，各0.化1
[0041 ] 巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物化L
[0042] 加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為SOiiL
[0043] 所述5XPCRBuffer和Exl'aqHSDNA聚合酶來(lái)源于l'aKaRa公司的貨號(hào)為RR019A 的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒。
[0044] 在一優(yōu)選例中，所述第一輪反應(yīng)的程序如下：94°C45s，50°C45s，72°C Imin，35個(gè)循 環(huán);所述第二輪反應(yīng)的程序如下:94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35個(gè)循環(huán)。
[0045] 本發(fā)明有如下有益效果：
[0046] (1)本發(fā)明針對(duì)寨卡病毒設(shè)計(jì)的引物特異性好、靈敏度高且重復(fù)性好。
[0047] (2)本發(fā)明建立的寨卡病毒的巢式RT-PCR方法，可對(duì)寨卡病毒進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0048] (3)本發(fā)明建立的寨卡病毒的巢式RT-PCR方法特別適用于臨床樣品的檢測(cè)，其檢 測(cè)的靈敏度可達(dá)到IXIO 3拷貝AiL的病毒分子，操作簡(jiǎn)易，結(jié)果穩(wěn)定，對(duì)我國(guó)的寨卡病毒臨 床快速診斷和公共防控都具有重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1為本發(fā)明兩組引物對(duì)、試劑盒W及檢測(cè)方法對(duì)寨卡病毒的巢式RT-PCR特異性 驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有八條泳道:其中M為marker化2000，1為插入ZIKV E蛋白基 因 CDNA的陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為ZIKVl的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為 ZIKV2的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為登革熱病毒的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為基孔肯雅病毒的 巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;6為黃病毒的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;7為用無(wú)核酶水作為陰性對(duì)照的 巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050] 圖2為本發(fā)明兩組引物對(duì)、試劑盒W及檢測(cè)方法對(duì)寨卡病毒的巢式RT-PCR靈敏性 驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有十一條泳道:其中M為marker化2000,1-9分別為濃度依次 為lXl〇9拷貝/化、lXl〇8拷貝/化、lXl〇7拷貝/化、lXl〇6拷貝/化、lXl〇5拷貝/化、lXl〇4 拷貝AiUl X IO3拷貝/化、1 X IO2拷貝AiL和1 X 1〇1拷貝AiL的質(zhì)粒，10為無(wú)核酶水陰性對(duì)照。
[0051] 圖3為本發(fā)明第一組引物對(duì)針對(duì)寨卡病毒的RT-PCR反應(yīng)的靈敏性驗(yàn)證的瓊脂糖凝 膠電泳圖，共有^^一條泳道:其中M為marker化2000,1-9分別為濃度依次為IX IO9拷貝Ai L、1X108拷貝/化、1X107拷貝/化、1X106拷貝/化、1X105拷貝A^L、1X104拷貝/化、1X103 拷貝AiUl X IO2拷貝AiL和1 X 1〇1拷貝AiL的質(zhì)粒，10為無(wú)核酶水陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 除非特殊說(shuō)明，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。
[0053] 下面參考具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，運(yùn)些實(shí)施例僅僅 是說(shuō)明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng) 域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠 商者，均為可W通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0化4] 實(shí)施例1
[0055]本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)寨卡病毒的兩組引物對(duì)及其應(yīng)用。
[0化6] 兩組引物對(duì)的設(shè)計(jì):利用GenBank中現(xiàn)有的71條ZIKV全基因組序列進(jìn)行多序列比 對(duì)，選擇ZIKV包膜蛋白（envelope protein)的保守區(qū)域（536bp，SEQ. ID.No.5)作為祀序列 設(shè)計(jì)兩組引物對(duì)。
[0057] 兩組引物對(duì)的具體序列如表1所示：
[0化引 表1
[OOWl
[0060] 表1中，ZIKV/lst/F代表巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的上游引物，ZIKV/lst/R代表巢式 RT-PCR第一輪反應(yīng)的下游引物，ZIKV/化d/F代表巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)的上游引物，ZIKV/ 2nd/R代表巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)的下游引物。引物序列中的M代表A或C，R代表A或G，Y代表 C或T，S代表C或G。
[0061 ] 所述SEQ.ID.No.5的具體序列為：
[0062] acaggccttgacttttcagatttgtattacttgactatgaataacaagcactggttggttcacaaggagtggttcca Cg曰C曰ttcc曰tt曰CCttggC曰CgctggggC曰g曰C曰CCgg曰曰Ctcc曰C曰Ctgg曰曰C曰曰C曰曰曰g曰曰gc曰Ctggtegsgt tC曰曰gg曰CgC曰C曰tgCC曰曰曰曰ggC曰曰曰CtgtCgtggttcteggg3gtC33g33gg3gC3gttC3C3CggCCCttgCt 邑邑曰邑Ctct邑邑曰邑邑Ct邑曰邑曰t邑邑曰t邑邑t邑C曰曰曰邑邑邑曰曰邑邑Ct邑tcctct邑邑CC曰Ctt邑曰曰曰t邑tc邑CCtgsssstggs taaacttagattgaagggcgtgtcatactccttgtgtaccgcagcgttcacattcaccaagatcccggctgaaacac t邑C曰C邑邑邑曰C曰邑tc曰C曰邑t邑邑曰邑邑t曰C曰邑t曰C邑C曰邑邑邑曰C曰邑曰t邑邑曰CCtt邑C曰曰邑邑ttcc曰邑CtcsgstggCggtg g曰C曰tgc曰曰曰ctctg曰CCCC曰gttggg曰ggttg曰t曰曰CCgCt曰曰CCCCgt曰曰tc曰Ctg曰曰曰gc曰Ctg曰g曰曰etc
[0063] 上述兩組引物對(duì)均由上海生工生物工程有限公司合成。
[0064] 上述兩組引物對(duì)可應(yīng)用于在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品，所述檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品 還包括PCR擴(kuò)增試劑。
[00化]實(shí)施例2
[0066] 本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：
[0067] (1)實(shí)施例1的兩組引物對(duì)；
[0068] (2)PCR 擴(kuò)增試劑。
[0069] 所述PCR擴(kuò)增試劑包括來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR KitVer.3.0試劑盒所包含的5XPCR Buffer及Ex hq服DNA聚合酶。
[0070] 實(shí)驗(yàn)證明，上述PCR擴(kuò)增試劑與兩組引物對(duì)的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn) 在可重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)。
[0071] 所述試劑盒還可W進(jìn)一步包括：
[0072] (3)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；
[0073] (4)RNA 提取試劑；
[0074] (5)逆轉(zhuǎn)錄試劑。
[00巧]所述陽(yáng)性對(duì)照為插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA(上海生工生物工程股份有 限公司合成）的質(zhì)粒。
[0076] 所述RNA提取試劑包括來(lái)自QIAGEN公司的貨號(hào)為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑;所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來(lái)自化KaRa公司的貨號(hào)為RRO19A 的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒所包含的試劑，例如MgCl2、dNTP Mixture、 RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase XL、Random 9mers、RNase Free d出0。
[0077] 上述試劑盒可應(yīng)用于檢測(cè)寨卡病毒。
[007引實(shí)施例3
[0079] 本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)寨卡病毒的方法，例如檢測(cè)生物樣品中寨卡病毒的存 在，該方法使用了實(shí)施例1的兩組引物對(duì)及實(shí)施例2的試劑盒。
[0080] 上述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血液、尿液、細(xì)胞或組織，或?yàn)橘|(zhì)粒，或?yàn)?DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA、mRNA或cDNA片段的試劑。
[0081 ] 當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或CDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA或CDNA片段的試劑，或?yàn)?質(zhì)粒時(shí)，將其直接作為模板與所述兩組引物對(duì)進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)。
[00劇當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細(xì)胞或組織，或?yàn)閙RNA,或?yàn)楹衜RNA的 試劑時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為DNA、CDNA或CDNA片段再與所述兩組引物對(duì)進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)。
[0083] 檢測(cè)寨卡病毒的方法包括如下步驟：
[0084] 1.巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0085] 巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒所包含的5XPCR Buffer ^化，虹化q服DNA聚合酶0.25化，實(shí)施例1中的 IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L DNA或cDNA片段（lXl〇3-lXl〇9拷貝/化），加 入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50化，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為去離子水，陽(yáng)性 對(duì)照為插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增的程序如 下：94 °C 45s，50 °C 45s，72 °C Imin，35個(gè)循環(huán)，得到巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)PCR產(chǎn)物。
[00化]巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 試劑盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，實(shí)施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.扣L，1化巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)PCR產(chǎn)物，加入 無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50化，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為去離子水，陽(yáng)性對(duì) 照為插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增的程序如下： 94 °C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35個(gè)循環(huán)，得到巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)PCR產(chǎn)物。
[0087] 2.判斷生物樣品中寨卡病毒的存在
[0088] 取化L巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上 觀察結(jié)果。
[0089] 所述巢式RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：
[0090] 若所述巢式RT-PCR擴(kuò)增得到的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小約為35加 P的片段， 代表生物樣品中含有寨卡病毒，為陽(yáng)性;若所述巢式RT-PCR擴(kuò)增得到的巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物不含有大小約為35化P的片段，代表生物樣品中未含有寨卡病毒，為陰性。
[0091] 如果上述生物樣品還未轉(zhuǎn)化為DNA、CDNA或CDNA片段，上述方法步驟1巢式RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)之前還可W包括使用QIAGEN公司的貨號(hào)為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒中的試劑按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)生物樣品中的RNA進(jìn)行提取，W及用來(lái)自 hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的！'aKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒所包含的試劑對(duì) 提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的步驟。
[0092] 實(shí)施例4
[0093] 本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的兩組引物對(duì)、實(shí)施例2的試劑盒W及實(shí)施例3的檢測(cè)方法進(jìn) 行了有效性或可靠性驗(yàn)證，具體包括如下步驟：
[0094] 1.樣品制備
[00M]所用的供試材料如下：兩例輸入性ZIKV感染者的血清(均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所）W及20份臨床疑似低熱病人的血清(來(lái)自深圳市第=人民醫(yī)院檢驗(yàn)科血常規(guī)檢查 后剩余的血液樣本，"疑似"代表懷疑為ZIKV感染者但經(jīng)檢測(cè)后卻不為ZIKV感染者），用 QIAGEN公司的貨號(hào)為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒中的試劑按照 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，然后對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的貨號(hào) 為RR019A的化KaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒中的試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄體 系如下：
[0096]
[0097] 其中MgCl2、dNTP Mixture、腳ase Inhibitor'AMV Reverse Transcriptase XL、 Random 9mers、腳ase Free 加 2〇均來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver .3.0試劑盒。所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:42°C反應(yīng)30min，95°C5min終止反應(yīng)； 逆轉(zhuǎn)錄后得到CDNA。
[0098] 2.巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0099] 巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3.0 試劑盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，實(shí)施例 1中的IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L步驟1得到的cDNA，加入無(wú)核酶水至總 反應(yīng)體積為50yL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為去離子水，陽(yáng)性對(duì)照為插入人工 合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物， 所述PCR擴(kuò)增的程序如下：94°C 45s，50 °C 45s，72 °C Imin，35個(gè)循環(huán)。
[0100] 巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 試劑盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，實(shí)施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.扣L，化L DNA(巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn) 物，即祀序列），加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50yL。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照 為去離子水，陽(yáng)性對(duì)照為插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述 PCR 擴(kuò)增的程序如下：94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35 個(gè)循環(huán)。
[0101] 3.判斷生物樣品中寨卡病毒的存在
[0102] 取化L巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上 觀察結(jié)果。
[0103] 結(jié)果顯示只有插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照和兩例ZIKV 感染者的血清都可W檢測(cè)到ZIKV，而其余20份臨床疑似樣本及陰性對(duì)照均沒(méi)有檢測(cè)到 ZIKV，說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)及的兩組引物對(duì)、實(shí)施例2的試劑盒W及實(shí)施例3的檢測(cè)方法是可靠 且有效的。
[0104] 實(shí)施例5
[0105] 本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的兩組引物對(duì)、實(shí)施例2的試劑盒W及實(shí)施例3的檢測(cè)方法進(jìn) 行了特異性驗(yàn)證，具體包括如下步驟：
[0106] 1.樣品制備
[0107] 所用的供試材料如下：兩株ZIKV和一株登革熱病毒活病毒(均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所），ZIKV陽(yáng)性對(duì)照為人工合成ZIKV E蛋白基因的CDNA(上海生工生物工程股份 有限公司），人工合成基孔肯雅病毒或黃病毒的基因組全長(zhǎng)CDNA用于引物特異性檢測(cè)，合成 cDNA經(jīng)克隆分別保存在T載體(Promega公司貨號(hào)A3610的pCiEM⑥-T Vector System II) 中。
[010引用QIAGEN公司的貨號(hào)為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒中 的試劑按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，然后對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄按照化KaRa公司 的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄體系如 下：
[0109] 10 X RT Biiffer 1 jiL
[0110]
[0111]其中MgCl2、dNTP Mixture、腳ase Inhibitor'AMV Reverse Transcriptase XL、 Random 9mers、腳ase Free 加 2〇均來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 試劑盒。
[0112] 所述逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件如下：42°C反應(yīng)30min，95°C5min終止反應(yīng);逆轉(zhuǎn)錄后得到 cDNA。
[0113] 2.巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0114] 巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 試劑盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，實(shí)施例 1中的IOiiM的ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R各0.扣L，化L步驟1得到的cDNA，加入無(wú)核酶水至總 反應(yīng)體積為50yL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為去離子水，陽(yáng)性對(duì)照為插入人工 合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增的程序如下： 94°C45s，50°C45s，72°Clmin，35 個(gè)循環(huán)。
[0115] 巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)：取hKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 試劑盒所包含的 5 X PCR Buffer 10化，Ex Taq HS DNA 聚合酶 0.2^iL，實(shí)施例 1中的IOiiM的ZIKV/2nd/F和ZIKV/2nd/R各0.化L，化L DNA(巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)得到的 PCR產(chǎn)物，即祀序列），加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50化。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰 性對(duì)照為去離子水，陽(yáng)性對(duì)照為插入人工合成的ZIKV E蛋白基因 CDNA的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，所述PCR擴(kuò)增的程序如下:94°C 45s，55 °C 45s，72 °C Imin，35個(gè)循環(huán)。
[0116] 3.判斷生物樣品中寨卡病毒的存在
[0117] 取化L巢式RT-PCR第二輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。在凝膠成像系統(tǒng)上 觀察結(jié)果。
[0118] 結(jié)果如圖1所示，從圖中可W看出，只有ZIKV陽(yáng)性對(duì)照及兩株ZIKV血清樣本的巢式 RT-PCR或巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約35化P處有條帶，可W被特異性地?cái)U(kuò)增，均呈陽(yáng)性;而登 革熱病毒、基孔肯雅病毒、黃病毒W(wǎng)及陰性對(duì)照的巢式RT-PCR或巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約 355bp處均無(wú)條帶，不能被特異性地?cái)U(kuò)增，均呈陰性。由此證明本發(fā)明實(shí)施例1的兩組引物 對(duì)、實(shí)施例2的試劑盒均具有高特異性;進(jìn)一步的，本發(fā)明基于實(shí)施例1的引物和實(shí)施例2的 試劑盒建立的檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確的對(duì)寨卡病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0119] 實(shí)施例6
[0120] 本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的兩組引物對(duì)、實(shí)施例2的試劑盒W及實(shí)施例3的檢測(cè)方法進(jìn) 行了靈敏性驗(yàn)證，具體包括如下步驟：
[0121] 1.樣品準(zhǔn)備
[0122] 將SEQ. ID.No.5(巢式第一輪PCR產(chǎn)物）插入T載體（Promega公司貨號(hào)A3610的 pGEM?-T Vector System II)構(gòu)建質(zhì)粒，將所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)灿?jì)8個(gè)梯度， 使其濃度為1 X IO9-I X 1〇1拷貝/化。
[0123] 2.巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0124] W上述樣品為模板，進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，巢式RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的方法和條 件同實(shí)施例5。
[0125] 結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的巢式RT-PCR檢測(cè)方法可W檢測(cè)到的最低濃度是1 X103拷貝每微升。而僅用ZIKV/lst/F和ZIKV/lst/R直接進(jìn)行普通RT-PCR擴(kuò)增（即僅進(jìn)行巢 式RT-PCR第一輪反應(yīng)），可W檢測(cè)到的最低濃度為IX IO5拷貝/化，結(jié)果如圖3所示。W上結(jié) 果說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的巢式RT-PCR檢測(cè)方法比普通RT-PCR靈敏度高100倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 兩組引物對(duì)，其特征在于，其中一組引物對(duì)包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的 核苷酸序列，另一組引物對(duì)包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩組引物對(duì)在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 任選的，所述檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品還包括PCR擴(kuò)增試劑。3. -種試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的兩組引物對(duì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:還包括PCR擴(kuò)增試劑； 所述PCR擴(kuò)增試劑包括來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒所包含的5XPCR Buffer和Ex Taq HS DNA聚合酶； 任選的，還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照； 任選的，還包括RNA提取試劑； 任選的，所述RNA提取試劑包括來(lái)自QIAGEN公司的貨號(hào)為 52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑； 任選的，還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑； 任選的，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑盒所包含的試劑； 任選的，所述來(lái)自TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試 劑盒所包含的試劑為MgCl2、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase XL、Random 9mers和RNaseFree dH2〇中的至少一種。5. 權(quán)利要求4所述的試劑盒在制備檢測(cè)寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。6. -種篩選易患寨卡病毒病的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的核酸樣本； 巢式RT-PCR裝置，所述巢式RT-PCR與所述核酸提取裝置相連，適用于采用權(quán)利要求1所 述的兩組引物對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng);以及 判斷裝置，所述判斷裝置與所述巢式RT-PCR裝置相連，以便基于巢式RT-PCR反應(yīng)的結(jié) 果，判斷所述生物樣品是否易患寨卡病毒病。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從生物樣品中提取RNA樣本；以及逆轉(zhuǎn)錄單元，所 述逆轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得 cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血 液、細(xì)胞或組織，或?yàn)橘|(zhì)粒，或?yàn)镈NA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA、mRNA或 cDNA片段的試劑； 任選的，當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或?yàn)楹蠨NA、cDNA或cDNA片段的試劑，或 為質(zhì)粒時(shí)，將其直接作為核酸樣本與所述兩組引物對(duì)進(jìn)行巢式RT-PCR反應(yīng)； 任選的，當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、尿液、細(xì)胞或組織，或?yàn)閙RNA，或?yàn)楹?有mRNA的試劑時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為DNA、cDNA或cDNA片段的核酸樣本再與所述兩組引物對(duì)進(jìn)行巢 式RT-PCR反應(yīng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于： 所述巢式RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下： 第一輪反應(yīng)體系： 5XPCR Buffer 10yL Ex Taq HS DNA聚合酶 0.25yL 引物對(duì)SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2濃度為ΙΟμΜ，各0.5yL DNA 或 cDNA 或 cDNA 片段 1 X 103-1 X 109拷貝 AiL，2yL 加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50yL;得到巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物； 第二輪反應(yīng)體系： 5XPCR Buffer 10yL Ex Taq HS DNA聚合酶 0.25yL， 引物對(duì)SEQIDN0:3和SEQIDN0:4濃度為10μM，各0.5μL 巢式RT-PCR第一輪反應(yīng)的PCR產(chǎn)物lyL 加入無(wú)核酶水至總反應(yīng)體積為50yL; 所述5XPCR Buffer和Ex Taq HS DNA聚合酶來(lái)源于TaKaRa公司的貨號(hào)為RR019A的 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于:所述第一輪反應(yīng)的程序如下：94 °C45s，50 °C45s，72°Clmin，35 個(gè)循環(huán)； 所述第二輪反應(yīng)的程序如下:94°C45s，55 °C45s，72 °C lmin，35個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861753SQ201610353475
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】高福, 劉映霞, 王強(qiáng), 畢玉海, 楊揚(yáng), 鄭海霞
【申請(qǐng)人】深圳市第三人民醫(yī)院