一種艱難梭菌顯色培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種艱難梭菌顯色培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述顯色培養(yǎng)基組成：胰酪蛋白胨1?20g/L，動物組織消化物1?20g/L，葡萄糖0.1?5.5g/L，酵母提取物0.2?5.5g/L，氯化鈉0.5?15g/L，亞硫酸鈉0.05?1g/L，七葉苷0.1?20g/L，鐵0.1?5g/L，氨基酸0.2?25g/L，瓊脂粉5?20g/L，環(huán)絲氨酸0.1?2.5g/L和頭孢西丁鈉0.01?0.15g/L，溶劑為去離子水，pH值7.0～7.6；本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)周期24小時，菌落為特異性的黑色，在使用該培養(yǎng)基時可以通過顏色準(zhǔn)確地從臨床糞便樣本中獲得艱難梭菌分離株。
【專利說明】
一種艱難梭菌顯色培養(yǎng)基及其應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)艱難梭菌的培養(yǎng)基，特別涉及一種培養(yǎng)梭菌的顯色培養(yǎng)基， 縮短培養(yǎng)時間，提高檢出率和準(zhǔn)確率。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 艱難梭菌(Clostridium difficile)為革蘭陽性厭氧產(chǎn)芽孢桿菌，是人類腸道中 的正常菌群之一，廣泛分布于自然環(huán)境和動物糞便中。據(jù)報道25 %~30 %抗生素相關(guān)性腹 瀉是由艱難梭菌引起的，而偽膜性腸炎則幾乎100%由艱難梭菌所致。在過去二十年中艱難 梭菌出現(xiàn)了發(fā)病率、嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)率上升的趨勢，所有這些都與預(yù)后不佳有關(guān)，并已成為 歐美排名第1的"超級臭蟲"。現(xiàn)在美國已將艱難梭菌感染與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐 萬古霉素的腸球菌并列于美國三大醫(yī)院獲得性感染之列。根據(jù)國外經(jīng)驗，為控制艱難梭菌 的廣泛傳播，最重要的是發(fā)展更為敏感和快速的檢測方法，以及時發(fā)現(xiàn)，及早診治。
[0003] 1935年Hall和O'Toole首次培養(yǎng)艱難梭菌，因為其培養(yǎng)非常困難而被命名為艱難 梭菌。1940年Snyder從10周-1歲的嬰兒分離到艱難梭菌。其后一直到1960年才有艱難梭菌 培養(yǎng)的報道。目前成人艱難梭菌感染的臨床操作指南：（SHEA和IDSA更新的2010版)推薦艱 難梭菌的糞便用CCFA培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)48小時后形成4-6_直徑的不規(guī)則，不透明的灰白色 菌落。菌落的特征及識別主要依賴于檢驗人員的肉眼觀察和經(jīng)驗判斷，對于不典型形態(tài)特 征的菌落可能會造成漏檢。由于細(xì)菌的培養(yǎng)在臨床耐藥及其他研究中的重要性，因此，實驗 室開發(fā)一種培養(yǎng)時間短、特異性好、對主觀依賴較小的艱難梭菌培養(yǎng)基意義重大。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種艱難梭菌的顯色培養(yǎng)基，縮短培養(yǎng)時間，從傳統(tǒng)培養(yǎng)48小 時縮短到24小時，同時提高菌落的檢出率和準(zhǔn)確率，普通艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基上生長的 艱難梭菌為灰白色，而該顯色培養(yǎng)基上艱難梭菌的菌落周圍為特異性黑色。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，所述顯色培養(yǎng)基終濃度組成:胰酪蛋白胨 l-20g/L，動物組織消化物l-20g/L，葡萄糖0.1-5.5g/L，酵母提取物0.2-5.5g/L，氯化鈉 0 · 5-15g/L，亞硫酸鈉0 · 05-lg/L，七葉苷0 · l-20g/L，鐵0 · l-5g/L，氨基酸0 · 2-25g/L，瓊脂粉 5-20g/L，環(huán)絲氨酸0 · 1-2 · 5g/L和頭孢西丁鈉0 · 01-0 · 15g/L，溶劑為去離子水，pH值7 · 0~ 7.6;所述動物組織消化物為肝浸粉。
[0007] 進(jìn)一步，所述氨基酸為脯氨酸和亮氨酸以質(zhì)量比1:1的混合。
[0008] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基終濃度組成:胰酪蛋白胨3-18g/L，動物組 織消化物3_18g/L，葡萄糖0.2-5.2g/L，酵母提取物1-5.5g/L，氯化鈉 l-13g/L，亞硫酸鈉 0 · 09-0 · 9g/L，七葉苷 0 · 2-18g/L，鐵0 · 1-4 · 5g/L，氨基酸 0 · 5-20g/L，瓊脂粉 5-20g/L(更優(yōu)選 10-20g/L)，環(huán)絲氨酸0.1-2.5g/L和頭孢西丁鈉0.01-0.15g/L，溶劑為去離子水，pH值7.0~ 7.4。
[0009]更進(jìn)一步，優(yōu)選所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配比的原料組成:胰酪蛋白 胨10g/L，肝浸粉10g/L，葡萄糖2g/L，酵母提取物4g/L，氯化鈉4g/L，亞硫酸鈉0.3g/L，七葉 苷5g/L，鐵0.7g/L，氨基酸5g/L，瓊脂粉15g/L，環(huán)絲氨酸0.16g/L和頭孢西丁鈉0.07g/L，溶 劑為去離子水，pH值7.2~7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以質(zhì)量比1:1的混合。
[0010]更進(jìn)一步，優(yōu)選所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配比的原料組成:胰酪蛋白胨lg/L，肝 浸粉20g/L，葡萄糖0. lg/L，酵母提取物5.5g/L，氯化鈉0.5g/L，亞硫酸鈉 lg/L，七葉苷0. lg/ L，鐵0.1g/L，氨基酸25g/L，瓊脂粉10g/L，環(huán)絲氨酸0. lg/L和頭孢西丁鈉0.15g/L，溶劑為去 離子水，pH值7.0;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以質(zhì)量比1:1的混合。
[0011]更進(jìn)一步，優(yōu)選所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配比的原料組成:胰酪蛋白胨20g/L， 肝浸粉1 g/L，葡萄糖5.5g/L，酵母提取物0.2g/L，氯化鈉15g/L，亞硫酸鈉0.05g/L，七葉苷 20g/L，鐵5g/L，氨基酸0.2g/L，瓊脂粉20g/L，環(huán)絲氨酸2.5g/L和頭孢西丁鈉0.01g/L，溶劑 為去離子水，pH值7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以質(zhì)量比1:1的混合。
[0012] 本發(fā)明還提供一種所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基在培養(yǎng)艱難梭菌中的應(yīng)用，所述應(yīng)用 是將艱難梭菌接種至顯色培養(yǎng)基，37土TC厭氧培養(yǎng)18-24h，菌落周圍有黑色素沉著的為艱 難梭菌，菌落周圍無色素沉著的不是艱難梭菌。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)周期從現(xiàn)有技 術(shù)分離時間48-72小時縮短到24小時；同時培養(yǎng)出的菌落從現(xiàn)有方法的灰白色菌落改進(jìn)為 特異性的黑色，在使用該培養(yǎng)基時可以通過顏色準(zhǔn)確地從臨床糞便樣本中獲得艱難梭菌分 離株。 (四）
【附圖說明】
[0014] 圖1艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株在顯色培養(yǎng)基上的生長情況，A為艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC700057)，B為艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC43255)。
[0015]圖2為對照菌株在顯色培養(yǎng)基上的生長情況，A為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25933，B為 奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)ATCC12453，C為產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13124。
[0016] 圖3為臨床腹瀉患者糞便樣本分離結(jié)果，A為S393臨床腹瀉患者糞便樣本，B為S379 臨床腹瀉患者糞便樣本，C為S357臨床腹瀉患者糞便樣本，D為S345臨床腹瀉患者糞便樣本。 (五)
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0018] 實施例1標(biāo)準(zhǔn)菌株測試
[0019] 1、顯色培養(yǎng)基成分： 胰酪蛋白胨 10g 肝浸粉 log 葡萄糖 2g 酵母提取物 4g 氯化鈉 4g
[0020] 亞硫酸鈉 0.3g 七葉苷 5g 鐵 〇 7g 氨基酸 5g 瓊脂粉 15g
[0021]加環(huán)絲氨酸0.16g，頭孢西丁鈉0.07g，溶劑為去離子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以質(zhì)量比1:1的混合，pH值7.2，傾注平板后使用。
[0022] 2、標(biāo)準(zhǔn)菌株：
[0023] 選取購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)艱難梭 菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700057、ATCC43255)作為陽性對照，用購自ATCC的產(chǎn)氣夾膜梭菌ATCC13124， 奇異變形桿菌ATCC12453,大腸桿菌ATCC25922作為陰性對照。
[0024] 3、實驗操作
[0025]將菌株復(fù)蘇后分別接種到該顯色培養(yǎng)基，37±1°C厭氧培養(yǎng)18_24h，觀察結(jié)果。
[0026] 結(jié)果顯示艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700057、ATCC43255)在顯色培養(yǎng)基上顯示黑色菌 落，菌落周圍有黑色素沉著，見圖1。而產(chǎn)氣夾膜梭菌ATCC13124,奇異變形桿菌ATCC12453， 大腸桿菌ATCC25922在該培養(yǎng)基上生長出白色菌落，沒有黑色色素沉淀，結(jié)果見2。上述結(jié)果 說明該培養(yǎng)基只針對艱難梭菌出現(xiàn)特異性顯色，對其他陰性細(xì)菌均無顯色現(xiàn)象出現(xiàn)。
[0027]實施例2實際樣本檢測 [0028] 1、顯色培養(yǎng)基成分： 胰酪蛋白胨 lg 肝浸粉 20g 葡萄糖 〇.lg 酵母提取物 5.5% 氯化鈉 0 5g
[0029] 亞硫酸鈉 lg 七葉苷 Olg 鐵 o.lg 氨基酸 25g 瓊脂粉 l〇g
[0030] 加環(huán)絲氨酸O.lg，頭孢西丁鈉0.15g，溶劑為去離子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以質(zhì)量比1:1的混合，pH值7.0，傾注平板后使用。
[0031] 2、實驗操作
[0032] 取臨床腹瀉病人糞便200mg與無水乙醇800μ1在1.5ml離心管中混合，蓋上管蓋，渦 旋震蕩混勻。
[0033] (2)上述樣本混勻后在室溫下靜置1小時。
[0034] (3)靜置后將離心管放入高速離心機(jī)以800rpm離心10分鐘。離心后將上清液吸去， 保留沉淀。
[0035] (4)在沉淀中加入800μ1的生理鹽水，混勻。
[0036] (5)將混勻后的糞便標(biāo)本全部傾倒至顯色培養(yǎng)基，涂布均勻至無液體流動。
[0037] (6)37±1°(：厭氧培養(yǎng)18-2411，觀察結(jié)果。同樣條件下用艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC43255)作為陽性對照，用產(chǎn)氣夾膜梭菌ATCC13124作為陰性對照。
[0038]糞便樣本的培養(yǎng)結(jié)果見圖3。糞便標(biāo)本(S379和S393)的培養(yǎng)基顯示糞便的淺黃色， 菌落顯示白色，培養(yǎng)基不變色，表明S379和S393兩個樣本為艱難梭菌陰性，見圖3中Α和圖3 中B。糞便標(biāo)本（S345和S357)的培養(yǎng)基顯示黑色，菌落周圍有黑色素沉著，說明糞便標(biāo)本 S345和S357為艱難梭菌陽性樣本，見圖3中C和圖3中D。通過上述結(jié)果顯示本培養(yǎng)基在培養(yǎng) 臨床艱難梭菌感染陽性患者糞便樣本時，培養(yǎng)基變黑色，且菌落周圍有黑色素沉著的提示 為艱難梭菌菌落；當(dāng)培養(yǎng)臨床艱難梭菌感染陰性患者糞便樣本時，菌落周圍無色素沉著的 提示沒有艱難梭菌生長。
[0039] 實施例3與現(xiàn)有艱難梭菌選擇性平板的比較
[0040] 1、顯色培養(yǎng)基成分： 胰酪蛋白胨 20g 肝浸粉 ：lg 葡萄糖 5 5g 酵母提取物 0.2g
[0041 ] 氯化鈉 15g 亞硫酸鈉 0.05g 七葉苷 20g 鐵 5:g 氨基酸 a:2g
[0042] 瓊脂粉 20g
[0043] 加環(huán)絲氨酸2.5g，頭孢西丁鈉 O.Olg，溶劑為去離子水1L，氨基酸是脯氨酸和亮氨 酸以質(zhì)量比1:1的混合，pH值7.4，傾注平板后使用。
[0044] 2、環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊脂(CCFA)培養(yǎng)基為對照。
[0045] 3、實驗操作
[0046] 取臨床腹瀉病人糞便200mg與無水乙醇800μ1分別放在1.5ml離心管中混合，蓋上 管蓋，渦旋震蕩混勻。每個樣本重復(fù)操作一次。
[0047] (2)上述樣本混勻后在室溫下靜置1小時。
[0048] (3)靜置后將離心管放入高速離心機(jī)以800rpm離心10分鐘。離心后將上清液吸去， 保留沉淀。
[0049] (4)在沉淀中加入800μ1的生理鹽水，混勻。
[0050] (5)將混勻后的糞便標(biāo)本分別全部傾倒至CCFA和顯色培養(yǎng)基，涂布均勻至無液體 流動。
[0051] (6)將顯示培養(yǎng)基放置37 土 TC厭氧培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。同樣條件下用艱難梭 菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC43255)作為陽性對照，用產(chǎn)氣夾膜梭菌ATCC13124作為陰性對照。
[0052] (7)將CCFA培養(yǎng)基放置37 ± 1°C厭氧培養(yǎng)48-7 2h，觀察結(jié)果。同樣條件下用艱難梭 菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC43255)作為陽性對照，用產(chǎn)氣夾膜梭菌ATCC13124作為陰性對照。
[0053]結(jié)果顯示，CCFA培養(yǎng)基需要培養(yǎng)48小時才能在平板上生長出艱難梭菌，而該顯色 培養(yǎng)基可在24小時內(nèi)生長出艱難梭菌。并且，艱難梭菌在CCFA上長出的菌落為典型灰白色 形狀，而在顯色培養(yǎng)基上則可生長出黑色菌落。因此，本發(fā)明涉及的艱難梭菌顯色培養(yǎng)基與 現(xiàn)有艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基相比，具有菌株分離周期短，陽性菌落易挑選等特點。具體兩種 比對如下表1。
[0054]表 1
【主權(quán)項】
1. 一種艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基終濃度組成：胰酪蛋白胨1-20g/L，動物組織消化物l-20g/L，葡萄糖0 · 1-5 · 5g/L，酵母提取物0 · 2-5 · 5g/L，氯化鈉0 · 5-15g/L，亞硫酸鈉0 · 05-lg/L，七葉苷0 · l-20g/L，鐵0 · l-5g/L，氨基酸0 · 2-25g/L，瓊脂粉5-20g/L，環(huán)絲氨酸0 · 1-2 · 5g/L和頭孢西丁鈉0 · 01-0 · 15g/L，溶劑為去離子水，pH值7 · 0~7 · 6; 所述動物組織消化物為肝浸粉。2. 如權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸 以質(zhì)量比1:1的混合。3. 如權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配 比的原料組成:胰酪蛋白胨3-18g/L，動物組織消化物3-18g/L，葡萄糖0.2-5.2g/L，酵母提 取物 1-5.5g/L，氯化鈉 1-13g/L，亞硫酸鈉0.09-0.9g/L，七葉苷0.2-18g/L，鐵0.1-4.5g/L， 氨基酸0 · 5-20g/L，瓊脂粉5-20g/L，環(huán)絲氨酸0 · 1-2 · 5g/L和頭孢西丁鈉0 · 01-0 · 15g/L，溶劑 為去離子水，pH值7.0~7.4。4. 如權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配 比的原料組成:胰酪蛋白胨l〇g/L，肝浸粉10g/L，葡萄糖2g/L，酵母提取物4g/L，氯化鈉4g/ L，亞硫酸鈉0.3g/L，七葉苷5g/L，鐵0.7g/L，氨基酸5g/L，瓊脂粉15g/L，環(huán)絲氨酸0.16g/L和 頭孢西丁鈉0.07g/L，溶劑為去離子水，pH值7.2~7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以質(zhì) 量比1:1的混合。5. 如權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配 比的原料組成:胰酪蛋白胨lg/L，肝浸粉20g/L，葡萄糖0.1g/L，酵母提取物5.5g/L，氯化鈉 0.5g/L，亞硫酸鈉 lg/L，七葉苷0 . lg/L，鐵0.1 g/L，氨基酸25g/L，瓊脂粉10g/L，環(huán)絲氨酸 0. lg/L和頭孢西丁鈉0.15g/L，溶劑為去離子水，pH值7.0;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以 質(zhì)量比1:1的混合。6. 如權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色培養(yǎng)基由如下質(zhì)量配 比的原料組成:胰酪蛋白胨20g/L，肝浸粉lg/L，葡萄糖5.5g/L，酵母提取物0.2g/L，氯化鈉 15g/L，亞硫酸鈉0.05g/L，七葉苷20g/L，鐵5g/L，氨基酸0.2g/L，瓊脂粉20g/L，環(huán)絲氨酸 2.5g/L和頭孢西丁鈉0.01g/L，溶劑為去離子水，pH值7.4;所述氨基酸是脯氨酸和亮氨酸以 質(zhì)量比1:1的混合。7. -種權(quán)利要求1所述艱難梭菌顯色培養(yǎng)基在檢測艱難梭菌中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是將艱難梭菌接種至顯色培養(yǎng)基，37 ±1°C厭氧培養(yǎng)18-24h，菌落周圍有黑色素沉著的為艱難梭菌，菌落周圍無色素沉著的不是 艱難梭菌。
【文檔編號】C12R1/145GK105838774SQ201610380128
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】羅蕓
【申請人】浙江省疾病預(yù)防控制中心