膽茶堿的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了膽茶堿的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的膽茶堿的藥物組合物中含有膽茶堿和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，膽茶堿、化合物(Ⅰ)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)，膽茶堿和化合物(Ⅰ)聯(lián)合使用可以進(jìn)一步提高免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)，效果優(yōu)于膽茶堿或化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用效果，可以開發(fā)成提高免疫力的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
膽茶堿的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及膽茶堿的新用途，具體涉及膽茶堿的藥物組合物 及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽茶堿用于支氣管哮喘，也用于心源性肺水腫引起的哮喘。
[0003] 迄今為止，尚未見膽茶堿及其藥物組合物與增強(qiáng)免疫力的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種膽茶堿的藥物組合物，該藥物組合物中含有膽茶堿和 一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，膽茶堿和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同增強(qiáng)免疫力。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0008] -種膽茶堿的藥物組合物，包括膽茶堿、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥學(xué)上 可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0010] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將茵陳粉碎，用85~95%乙醇 熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取， 分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物用 大孔樹脂除雜，先用8 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用90%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0013]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0014]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制備增強(qiáng)免疫力的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 上述膽茶堿的藥物組合物在制備增強(qiáng)免疫力的藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 本發(fā)明提供的膽茶堿的藥物組合物中含有膽茶堿和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，膽 茶堿和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，具有增強(qiáng)免疫力作用;二者聯(lián)合作用時(shí)，增強(qiáng)免疫力效果進(jìn) 一步提高，可以開發(fā)成增強(qiáng)免疫力的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0020] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0021] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0022] 分離方法：（a)將茵陳（2kg)粉碎，用90 %乙醇熱回流提取（20L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用8%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫12 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1 (8個(gè)柱體積）、20:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (8個(gè)柱 體積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用 正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0023] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 293.1338，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C16H2Q〇5，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH(ppm，CDC13，500MHz): H-1 (4 ? 03，s)，H-3(3 ? 31， s)，H-6(6.O3，d，J = 4.4Hz)，H-7(2.71，ddd，J = 4.4，13.1，4.6Hz)，H-8a(1.72，m)，H-80 (1.81，m)，H-9a(l .56，m)，H-90(1.63，m)，H-13(5.76，d，J = 3.3Hz)，H-13(6.29，d，J = 3.3抱），11-14(1.02,8)，11-15(1.47,8)，12-016(3.77,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)知(卯 111，〇)(：13， 125MHz):78.7(CH，l-C)，204.3(C，2-C)，62.7(CH，3-C)，62.3(C，4-C)，152.6(C，5-C)，125.7 (CH，6-C)，43.5(CH，7-C)，20.3(CH2,8-C)，33.5(CH2,9-C)，34.3(C，10-C)，144.6(C，n-C)， 167.3(C，12-C)，124.9(CH2，13-C)，19.2(CH3，14-C)，21.6(CH 3，15-C)，52.7(CH3，12-0Me)。 13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有16個(gè)碳信號(hào)，包括三個(gè)甲基(一個(gè)甲氧基），三個(gè)亞甲基(一 個(gè)烯烴碳），四個(gè)次甲基(兩個(gè)連氧碳和一個(gè)烯烴碳），以及六個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴碳，兩個(gè)羰基 碳和一個(gè)連氧季碳）。以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為三環(huán)結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié) 合HSQC譜顯示三個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)SH 1.02(3H，s)、1.47(3H，s)與3.77(3H，s)，一對(duì)端烯烴質(zhì) 子信號(hào)知5.76(111，(1，1 = 3.3他）與6.29(111，(1，1 = 3.3泡），兩個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)知 4.03(111，8)、3.31(111，8)，一個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)知6.03(111，(1，了 = 4.4抱）。匪1?譜數(shù)據(jù)知3.77 (3H，s)與Sc 52.7可知該化合物中存在甲氧基，腿8(：譜中11-(?3與(：-12相關(guān)信號(hào)表明了甲氧 基連接在C-12位。根據(jù)NMR譜數(shù)據(jù)S H 3.31(lH，s)與Sc 62.7、62.3可知該化合物中存在個(gè)環(huán) 氧結(jié)構(gòu)。通過七-咕COSY譜中H-6/H-7/H2-8/H 2-9相關(guān)信號(hào)，以及HMBC譜中顯示的H-1與C-2、 C-3 和C-11，H-3 與 C-1、C-2、C-4和C-5，H-6 與C-5、C-7、C-8和C-10，H-7 與 C-6、C-8和C-11，H2-13與C-7、C-11和C-12，H3-14與C-10相關(guān)信號(hào)，可以構(gòu)建該化合物的連接方式，并且上述波 譜數(shù)據(jù)表明該化合物為桉葉烷型倍半萜，該化合物中的C-l、C-3、C-4、C-7和C-10為手性碳， 通過N0ESY試驗(yàn)與H-H偶合常數(shù)確認(rèn)了相對(duì)構(gòu)型。通過N0ESY譜中H-3/H 3-14、H-3/H3-15以及 H3-14/H3-15相關(guān)信號(hào)確定C-3與C-4的環(huán)氧結(jié)構(gòu)為a構(gòu)型。N0ESY譜中H-1/H-90、H-1/H 3-14、 11-3/出-15、11-7/11-13、11-邪/11-13、11-郎/出-14以及出-14/113-15相關(guān)信號(hào)表明該化合物(：-1、 C-3、C-4、C-7和C-10構(gòu)型為11?、31?、43、73和101?。綜合氫譜、碳譜、腿8(：譜和勵(lì)￡3￥譜，以及文 獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確 定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0025] 實(shí)施例2:藥理作用
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動(dòng)物
[0028] 清潔級(jí)昆明種小白鼠120只，體重20±2g，雌雄各半，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030]膽茶堿購自中國食品藥品檢定研究院?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。環(huán)磷 酰胺(cyclophosphamide，CTX)(江蘇恒瑞），黃芪多糖(APS，江蘇華東貝爾生物藥業(yè)），臺(tái)盼 藍(lán)（Sigma)，RPMI 1640培養(yǎng)液(HycIon)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma)，脂多糖（LPS，Sigma)，MTT (Si gma)，二甲亞砜(DMSO)，pH7.2TOS，5 %雞紅細(xì)胞(CRBC)，豚鼠血清(廣州蕊特生物），小鼠 細(xì)胞因子IL-2，IL-4和IFN-y 檢測(cè)試劑盒(B0STER)，CD3+(FITC Hamster anti-mouse)單克 隆抗體，⑶4+(PE rat anti-mouse)單克隆抗體，Q)8+(PerCP rat anti-mouse)單克隆抗體 (BOSTER)，溶血素（Versalyse ? Lysing Solution)。
[0031] 1.3儀器
[0032] 紫外可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器），流式細(xì)胞儀（BD FACSCcalibur TM)，超凈工作臺(tái)（AIRTECH)，倒置顯微鏡(Motic)，離心機(jī)(Thermo)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIORAD )， C02 培養(yǎng)箱 (Thermo) 。
[0033] 1.4動(dòng)物分組及處理
[0034] 將60只健康小鼠隨機(jī)分空白組、模型組、陽性組、膽茶堿組、化合物（I)組、膽茶堿 與化合物（I)組合物組，每組10只。空白組和模型組每天腹腔注射生理鹽水〇. 2ml、陽性組每 天腹腔注射20g ? I^APS 0.2!111，膽茶堿組、化合物（1)組、膽茶堿與化合物（1)組合物組分別 每天腹腔注射膽茶堿20g ? I/1、化合物（I)20g ? I/1、膽茶堿與化合物（I)組合物【膽茶堿 l〇g ? I/1-化合物（I)10g ? LlOJml，連續(xù)7d;給藥后d5~7，除空白對(duì)照組外其余各組每天 腹腔注射CTX 100mg ? kg一、
[0035] 1.5腹腔巨噬細(xì)胞功能及免疫器官指數(shù)檢測(cè)
[0036] 按"1.4"處理，各組分別于給藥后d7稱重，并腹腔射5 %雞紅細(xì)胞0.5ml，8h后處死 小鼠，腹腔注入PBS 2ml，輕揉小鼠腹部lmin，吸取腹腔液體0.5ml于載玻片上在37 °C孵育 30min，1:1丙酮-甲醇液固定5min，Giemsa染色，每張涂片油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)巨細(xì)胞，按以 下公式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)：
[0037] 吞噬率/% =(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù)）X 100% ;
[0038] 吞噬指數(shù)=(被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù)）+2。
[0039] 另取各組小鼠脾和胸腺稱重，按以下公式計(jì)算：
[0040] 脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g);
[0041] 胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg) /體重(g)。
[0042] 1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0043]采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，方差分析組間差異。
[0044] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0045] 2.1對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)的影響
[0046]與空白組比較，模型組的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性組 的黃芪多糖(APS)、膽茶堿組、化合物（I)組均能明顯提高吞噬率和吞噬指數(shù)(P<0.05);與 模型組相比，膽茶堿與化合物（I)組合物組小鼠的吞噬率、吞噬指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù) 均明顯升高(P<〇.〇l)。結(jié)果見表1。
[0047]表1對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能和免疫器官指數(shù)的影響
[0049] 上述結(jié)果表明，膽茶堿、化合物（I)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞功能和免疫 器官指數(shù)，膽茶堿和化合物（I)聯(lián)合使用可以進(jìn)一步提高免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞功能和 免疫器官指數(shù)，效果優(yōu)于膽茶堿或化合物（I)單獨(dú)作用效果，可以開發(fā)成提高免疫力的藥 物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
[0050] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)，2. -種膽茶堿的藥物組合物，其特征在于:包括膽茶堿、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的膽茶堿的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體包 括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或 潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的膽茶堿的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠囊 劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓 劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將茵 陳粉碎，用85~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用8%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用90%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備增強(qiáng)免疫力的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的膽茶堿的藥物組合物在制備增強(qiáng)免疫力的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C07D301/32GK105820143SQ201610258328
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】吳珺
【申請(qǐng)人】吳珺