中裂解。允許樹脂在裂解混合物中漂浮1/2小時。然后使用Buchner漏斗通過重力過 濾溶液，并將濾液收集在50ml離屯、管中。通過用冷凍的二乙酸沉淀來分離膚。離屯、并傾析出 二乙酸之后，用二乙酸再次洗涂粗膚，之后在真空干燥器中干燥2小時。然后將膚溶解在去 離子水中（IOml)，在80°C下凍結(jié)并凍干。然后將干燥的膚準(zhǔn)備好用于HPLC純化。
[0089] 由于運些膚的親水性，二乙酸膚的分離不能進行。因此，需要氯仿萃取。蒸發(fā)TFA并 將得到的膚殘留溶解在10%乙酸（15ml)中。通過用氯仿（30ml)洗涂溶液兩次，從乙酸膚溶 液中除去雜質(zhì)和凈化劑。然后在-80°C下冰凍膚的水溶液并凍干，得到準(zhǔn)備用于HPLC純化的 粉末膚。
[0090] 膚+RIxVPA(沈Q ID NO.33)和+RIVPAx(沈Q ID NO.34)各自包含一個N-甲基氨基 酸。通過將N-甲基氨基酸、PyBroP和N-徑基苯并S挫地2(K冊化）和DIEPA溶液一起組合在包 含樹脂的RV中，進行運種偶聯(lián)。允許偶聯(lián)45分鐘之后，然后雙倍偶聯(lián)N-甲基氨基酸W保證偶 聯(lián)完成。觀察到繼N-甲基氨基酸之后的偶聯(lián)沒有完全完成。因此，使用N，N，N'，N'-四甲基-0-(7-氮雜苯并S挫-1-基)脈六氣憐酸鹽(HATU)代替皿TU，進行運種偶聯(lián)。運仍然得到通常 包含兩種雜質(zhì)的粗膚，總雜質(zhì)總共占30-40%。在改性的HPLC條件下純化膚，W從封閉洗脫 的雜質(zhì)中分離最多的純膚。
[0091] 3(*8旨)￥化1?(*8旨)￥2(56〇10^.91)是8殘基膚樹枝狀聚合物，對稱的支鏈存在于 具有兩個功能氨基的第四氨基酸賴氨酸上。用固相膚合成技術(shù)，利用二-Fmoc保護的第四氨 基酸來促進支鏈的偶聯(lián)，使用上述的一般合成技術(shù)合成了上述膚。
[0092] 此外，運些膚還可W用溶液相膚合成技術(shù)(Tsuda et al.2010)合成且是本領(lǐng)域?qū)?家通常已知的。
[0093] 口腔粘膜炎的療效
[0094] RIVPA(SEQ ID NO.5)和其他IDR調(diào)節(jié)對組織傷害的先天防御響應(yīng)，降低由炎癥級 聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的損傷嚴(yán)重度并加快疾病恢復(fù)。在小鼠的化療誘發(fā)的口腔和GI粘膜炎中、在倉 鼠的放射誘發(fā)的口腔粘膜炎中W及在小鼠的DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎中已經(jīng)證實了IDR的屬性。在 運些模型的每個中，認為最初的損傷引發(fā)先天防御信號的級聯(lián)反應(yīng)，其增加傷害的嚴(yán)重度 (1曰'48 2011;5〇1113 2010)。1?1￥?4(569 10顯.5)和其他10巧氏消信號級聯(lián)反應(yīng)，降低產(chǎn)生 的傷害的嚴(yán)重度并降低嚴(yán)重的組織損傷的持續(xù)時間。
[OOM] 在傷害模型中進一步確認了在MRSA菌血癥模型中定性的RIVPA(SEQ ID NO. 5)和 其他IDR的最佳劑量方案，其中，較長的疾病持續(xù)時間使得重復(fù)劑量更有益。發(fā)現(xiàn)每=天 25111旨/蛇的劑量是最佳的，響應(yīng)了1?1￥?4和其他101?(56〇10顯.5)的持續(xù)藥效影響，而不管 其在小鼠循環(huán)中快速的PK清除(數(shù)分鐘內(nèi)）。
[0096] RIVPA(SEQ ID NO.5)顯著降低了倉鼠中放射誘發(fā)的口腔粘膜炎的模型中的粘膜 炎的嚴(yán)重度和持續(xù)時間，特別是當(dāng)部分放射療法期間每S天給予時。運些研究確認RIVPA (SEQ ID NO.5)的最佳劑量包括每S天給藥且25mg/kg劑量水平是有效的。在該模型中，在 第0、1、2、3、6、7、8和9天用7.5Gy放射治療插入導(dǎo)管的雄性金黃倉鼠，在外翻的左邊頰囊引 導(dǎo)。在第7和35天之間每兩天評價粘膜炎，其中，峰值粘膜炎嚴(yán)重度一般發(fā)生在約第19天。在 第一次研究中，從第0天開始并繼續(xù)到第33天（Q3d dO-33)每=天，或在放射療法的天里 (第0、1、2、3、4、7、8、9)或從第6天開始繼續(xù)到第24天(93(1(16-24)每^天給予1?1￥?4(569 10 ^).5)。在給予1?1￥?4(569 10肋.5)和放射兩者的天里，放射后2小時給出1?1￥?4(569 10 NO.5)。該研究的結(jié)果示于圖1中。當(dāng)在放射期間或放射的天里每S天給予時，RIVPA(SEQ ID NO.5)治療是最有效的，而從發(fā)起放射后6天開始的治療沒有益處（即，Q3d d6-24)。進行后 續(xù)研究W評價Q3d dO-33、放射的天里、或放射治療期間每=天（即，第0、3、6和9天)的25mg/ kg IV RIVPA(SEQ ID NO.5)的劑量。該研究的結(jié)果示于圖2中。發(fā)現(xiàn)在放射期間每S天的治 療是最佳的，似乎反應(yīng)RIVPA(SEQ ID NO.5)藥效效果的持久性，伴隨著由運些小型曬齒類 中較少的IV注射劑引起的注射壓力的降低。
[0097] 還示出了RIVPA(SEQ ID NO. 5)在化療誘發(fā)的口腔和胃腸粘膜炎的小鼠模型中的 療效，與對化療和/或放射損傷的先天免疫響應(yīng)的響應(yīng)一致。在運些研究中，RIVPA(SEQ ID NO.5)給予與小鼠中化療誘發(fā)的粘膜炎的模型中的嚴(yán)重口腔粘膜炎的持續(xù)時間的統(tǒng)計學(xué)顯 著降低相關(guān)。還觀察到傾向于降低的結(jié)腸炎，盡管對照組中輕度的GI損傷致使結(jié)果不是統(tǒng) 計學(xué)顯著的。在每個研究中，在第-4天和第-2天，將5-氣尿喀晚（60mg/kg IP)給予至雄性 C3H/胎N小鼠。在第0天，將化學(xué)燒傷施加至小鼠舌頭的下側(cè)，誘發(fā)一般在第2天達到峰值的 粘膜炎。從第1天至第14天每天記錄小鼠舌頭粘膜炎的等級，等級含3代表嚴(yán)重的粘膜炎。而 且每天測量體重，并通過在第4天和第7天視頻內(nèi)窺鏡檢查確定結(jié)腸炎嚴(yán)重度。在第一次研 究中，或者在化療之前第-4天立即一次，或者在化療之后立即在第-4天和第-2天兩次或在 第-1、2和5天3次給予RIVPA(SEQ ID N0.5)(25mg/kg IV)。在峰值粘膜炎損傷期間的多個時 機的RIVPA(SEQ ID ^.5)給予是最有效的（即，在第-1、2和5天）。該研究的結(jié)果示于圖4中。 在第二次研究中，在第-1、2和5天或第-1、1和3天或第0、2和4天給予RIVPA(SEQ ID N0.5) (25mg/kg IV)。該研究的結(jié)果示于圖5中。嚴(yán)重粘膜炎的持續(xù)時間（圖5-面(panel)A)、第4天 結(jié)腸炎的嚴(yán)重度（圖5-面B)和平均體重減輕（圖5-面C)的統(tǒng)計學(xué)顯著變化在組之間存在聯(lián) 系。在第S次研究中，在第-1、2和5天或第1和3天給予RIVPA(SEQ ID ^).5)(25或5111邑/4邑 IV，根據(jù)指示）。再次，每S天利用RIVPA(SEQ ID NO.5)的劑量方案是最有效的，其中，降低 的劑量水平導(dǎo)致降低的療效。來自該研究的粘膜炎、結(jié)腸炎和體重結(jié)果分別示于圖6的A、B 和C中。使用卡方檢驗分析評估口腔粘膜炎的統(tǒng)計學(xué)顯著性，并用ANOVA排列評估曲線下面 積(411〇的體重的統(tǒng)計學(xué)顯著性。還證實了1?(巧旨)￥化1?(18旨)￥2(569 10^.91)和92在化療 誘發(fā)的粘膜炎的小鼠模型中的療效，其中，在誘發(fā)粘膜炎4天后評價粘膜炎等級（圖16,圖 17)。在第-1 天和第2天W25mg/kg IV的劑量給予通過R(tBg)V化R(tBg)V2(SEQ ID N0.91) 和尺^(111口2)4-畑2(沈9 10^.92)的治療。
[009引對放射損傷的響應(yīng)療效
[0099] RIVPA(SEQ ID NO.5)和其他IDR調(diào)節(jié)對組織傷害的先天防御響應(yīng)，降低由炎癥級 聯(lián)反應(yīng)引起的損傷嚴(yán)重度并加快疾病恢復(fù)。如上述，IDR在口腔粘膜炎模型中可W緩解對放 射損傷的響應(yīng)(圖1，圖2)。在另一個模型中，評估對放射誘發(fā)的粘膜炎的預(yù)防(在第0天給予 25Gy至小鼠嘴中），RIVPA(SEQ ID N0.5K每兩天給予5劑量的25mg/kg IV)對疾病進展沒有 任何顯著影響。通過組織病理學(xué)分析每單位面積和每單位長度基本的和上基部的調(diào)亡的、 有絲分裂的和總的上皮細胞的數(shù)目，在第〇、2、4、6、8和10天評估小鼠逐漸變薄的舌頭。應(yīng)當(dāng) 注意的是選擇使用的放射劑量(25Gy)使得觀察到舌頭上皮細胞逐漸變薄，但是沒有明顯的 粘膜炎發(fā)生。該結(jié)果證實缺少RIVPA(SEQ ID NO.5)的潛在增殖，并表明僅在有關(guān)途徑被明 顯的組織損傷或病原體入侵刺激時可觀察到RIVPA(SEQ ID NO.5)效果。
[0100] 胃腸道中的療效
[0101] 在DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎模型中確認預(yù)先或治療時給予的IV RIVPA(SEQ ID NO. 5)直 接保護GI粘膜表面的能力。在該模型中，在研究的第0至5天，作為飲用水中的3%DSS溶液給 予DSS至雄性巧7BL/6小鼠。在第7、14和21天通過視頻內(nèi)窺鏡檢查監(jiān)控結(jié)腸炎。從第0至18天 (Q3d dO-18)、從第3至 18天(Q3d d3-18)或從第6至 18天(Q3d d6-18)每S天給予RIVPA(SEQ 10^.5)(25111旨/1^1￥)。研究結(jié)果示于圖3中。第14天，所有1?1￥?4(569 10^.5)治療方案 證實了內(nèi)窺鏡結(jié)腸炎嚴(yán)重等級的統(tǒng)計學(xué)顯著降低。然而，第7天等級的降低僅在該時間（即， 93(1(10-18和93(1(13-18但沒有93(1(16-18)接受至少2劑量的1?1￥?4(569 10側(cè).5)的組中觀 察到。第21天，所有3個治療組看起來W類似方式響應(yīng)。第21天的結(jié)腸的組織病理學(xué)指示一 些RIVPA(SEQIDN0.5)治療的組統(tǒng)計學(xué)上顯著降低了水腫和壞死，而其他RIVPA(SEQID NO.5)治療的組具有沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著性的類似響應(yīng)。使用t測試進行統(tǒng)計分析，且星號 指示與對照的統(tǒng)計學(xué)顯著差值(P<. 05)。
[0102] 如上述，IDR還能夠降低化療誘發(fā)的粘膜炎模型中的胃腸粘膜炎的持續(xù)時間和/或 嚴(yán)重度（圖4,圖5,圖6)。
[0103] 受感染動物中的療效
[0104] RIVPA(SEQ ID NO. 5)在存在或不存在抗生素治療的情況下降低多種鼠科感染模 型中的細菌負荷并改善存活率，在25mg/kg IVW上的劑量水平具有一致的療效并且具有至 多5天的持續(xù)藥效效果。RIVPA(SEQ ID NO.5)療效在正常的和免疫損害的小鼠兩者中與抗 生素治療互補。已經(jīng)證實了RIVPA(SEQ ID NO.5)針對由革蘭氏陽性（金黃色葡萄球菌和 MRSA)和革蘭氏陰性(克雷伯氏桿菌屬、大腸桿菌和類鼻痘伯克氏菌)感染引起的疾病的療 效。
[01化]金黃色葡萄球菌
[0106] 在與萬古霉素治療組合和作為單獨的治療兩者中測試了RIVPA(SEQ ID NO.5)。
[0107] 當(dāng)與次佳的萬古霉素(研究#:D-7-E-ll)的抗生素劑量組合給予時，RIVPA(SEQ ID NO. 5)治療增加 MRSA腹膜感染模型中的存活率。在接種MRSA化C6685; 8.2 X IO7集群形成單 位[Cfu])之前的48或72h IV給予RIVPA(SEQ ID N0.5)(50mg/kg)或鹽水治療至雌性CF-I小 鼠（N= 10/組）。感染后1和化皮下（SC)給予萬古霉素治療（3mg/Kg)。僅每天監(jiān)控一次存活 率，持續(xù)5天。該研究的結(jié)果示于圖7中。
[0108] 當(dāng)自身給予時，RIVPA(SEQ ID NO. 5)也是有效的。在MRSA菌血癥模型中進行通過 1￥給予31￥?4(569 10肋.5)的多次研究。1?1￥?4(569 10肋.5)給予證實在免疫活性的 Ba化/c小鼠或缺少T細胞的nu/nu小鼠的該模型中的劑量響應(yīng)，其中，單次劑量50mg/kg相對 于鹽水對照導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)顯著提高的存活率。在第一次研究中，在時間0通過IV注射將MRSA (肥4300,7.31〇旨10?；?給予至雌性8曰化八小鼠的尾靜脈。感染前四個小時，將指示劑量水 平的單次劑量鹽水或RIVPA(SEQ ID NO.5) IV注射至尾靜脈。感染后立即一次性口腔給予 次佳的抗生素治療(利奈挫酬，6.25mg/kg)。感染后監(jiān)控存活率21天。該研究的結(jié)果示于圖9 中。在第二次研究中，在被MRSA(菌株USA300,7.Ologiocfu)感染之前的4h，通過尾靜脈將 RIVPA(SEQ ID顯.5)(1￥)或鹽水（1￥)給予至雌性1111/1111小鼠。如圖10所示，監(jiān)控存活率14 天。使用Kaplan Meier分析相對于鹽水對照評估每個治療組，通過50mg/kg劑量水平發(fā)現(xiàn)了 存活率的統(tǒng)計學(xué)顯著差值(即，P < 0.05)。
[0109] 總之，在多種金黃色葡萄球菌感染中使用獨立的IV RIVPA(SEQ ID NO.5)治療的 探究證實：
[0110] ? RIVPA(SEQ ID肋.5)的效果在1和5〇111邑/1^之間在小鼠中是劑量依賴性的， 25mg/Kg W上的劑量水平一致證實了療效(表2;圖9和圖10)。該劑量水平在傷害模型中可獲 得的更慢性疾病情況中也是有效的（圖1至圖6)。
[0111] 表2:通過單次IV RIVPA(SEQ ID NO.5)治療成功治療金黃色葡萄群菌感染的速率 與劑量水平的函數(shù)
[0112]
[0113] W成功治療證實相對于有關(guān)鹽水對照的存活率的至少20%增加