長(zhǎng)，提高菊花觀賞性。
[0028] 上述的應(yīng)用，其在于所述CmTCP20基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：W切花大菊 '神馬'花瓣的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，進(jìn)行PCR反應(yīng)，在 CmTCP20基因的上游和下游分別引入BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載 體，轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒由BamH I和Not I雙酶切得到 的CmTCP20片段與BamH I和Not I雙酶切的祀NTR?1A連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)Pvu I單 酶切線性化后與植物表達(dá)載體PMDC43質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，植物表達(dá) 載體pMDC43-CmTCP20構(gòu)建成功;所述的引物序列如下：
[00巧]上游引物CmTCP20-GATE-F: 5' -CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3' (SEQ ID NO.4)，
[0030]下游引物CmTCP20-GATE-R: 5' -TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3' (SEQ ID NO.5)。
[0031 ] -種通過(guò)轉(zhuǎn)CmTCP20基因調(diào)控菊花花瓣生長(zhǎng)的方法，包括W下步驟：
[0032] (1似切花大菊'神馬'為材料，提取花瓣的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;
[0033] (2)構(gòu)建CmTCP20基因植物表達(dá)載體：W步驟（1)獲得的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物 CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CmTCP20基因的上游和下游分別引入 BamH巧日Not I酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性 質(zhì)粒，將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒由BamH I和Not I雙酶切得到的CmTCP20片段與BamH I和Not I雙 酶切的pENTR?1A連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)Pvu I單酶切線性化后與植物表達(dá)載體 PMDC43質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，植物表達(dá)載體pMDC43-CmTCP20構(gòu)建成 功;所述的引物序列如下：
[0034] 上游引物CmTCP20-GATE-F: 5' -CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3' (SEQ ID NO.4)，
[0035] 下游引物CmTCP20-GATE-R: 5' -TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3' (SEQ ID NO.5)；
[0036] (3)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將步驟(2)獲得的CmTCP20基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入菊花，經(jīng) 過(guò)潮霉素抗性篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR、定量RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證內(nèi)源 基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA中并發(fā)生轉(zhuǎn)錄;獲得花瓣生長(zhǎng)具有差異的轉(zhuǎn)基因菊 花植株。
[0037] 所述的對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR、定量RT-PCR檢測(cè)的過(guò)程為：
[003 引（l)PCR 檢測(cè)
[0039] 取潮霉素抗性篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株嫩葉及未轉(zhuǎn)化植株嫩葉，提取基因組DNA， 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)為263bp，引物序列為：
[0040] 上游引物 PMDC43-GFP-F: CGTCGTCCTTGAAGAAGATGG [0041 ]下游引物PMDC43-GFP-R: TGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG
[0042] 分別W陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，WpMDC43-GFP-F和PMDC43-GFP-R 為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析；
[0043] (2)巧光定量RT-PCR檢測(cè)
[0044] 提取潮霉素抗性篩選得到得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株葉片及未轉(zhuǎn)化植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn) 錄成第一鏈cDNA，建立巧光定量RT-PCR擴(kuò)增體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各 個(gè)樣品的Ct值，W未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對(duì)表達(dá) 情況;特異引物擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)為198bp，引物序列為：
[0045] 上游引物CmTCP20-RT-F: GGGCCAGATGAGTTTTTCCT
[0046] 下游引物CmTCP20-RT-R: TTTGAAGACTGCGGTTGTTG
[0047] WEF化擴(kuò)增的基因片段為內(nèi)標(biāo)，片段長(zhǎng)度為15化P，引物序列：
[004 引 上游引物 E門 a-F: TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG，
[0049] 下游引物 E門 a-R: CCATTCAAGCGACAGACTCA。
[0050] 一種CmTCP20基因植物表達(dá)載體，該植物表達(dá)載體采用W下方法制備：
[0051 ] W切花大菊'神馬'花瓣的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物CmTCP20-GATE-F和CmTCP20- GATE-R，進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CmTCP20基因的上游和下游分別引入BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，將 PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒由 BamH I和Not I雙酶切得到的CmTCP20片段與BamH I和Not I雙酶切的祀NTR?1A連接，轉(zhuǎn)化， 提取的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)Pvu I單酶切線性化后與植物表達(dá)載體PMDC43質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn) 化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，植物表達(dá)載體pMDC43-CmTCP20構(gòu)建成功;所述的引物序列如下：
[0052] 上游引物CmTCP20-GATE-F: 5' -CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3' (SEQ ID NO.4)，
[0053] 下游引物CmTCP20-GATE-R: 5' -TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3' (SEQ ID NO.5)。
[0054] 上述的CmTCP20基因植物表達(dá)載體在調(diào)控菊花花瓣生長(zhǎng)中的基因工程應(yīng)用。
[0055] 上述的應(yīng)用，其在于采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將所述的CmTCP20基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入 菊花，促進(jìn)菊花花瓣的生長(zhǎng)，提高菊花觀賞性。
[0056] 本發(fā)明所述的技術(shù)方案利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將CmTCP20基因?qū)肭谢ň眨⒔?jīng) 過(guò)潮霉素篩選抗性植株;經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR、定 量RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證內(nèi)源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA中并發(fā)生轉(zhuǎn)錄。對(duì)轉(zhuǎn)基因植 株后代進(jìn)行表型觀察，最終獲得花瓣生長(zhǎng)具有差異的轉(zhuǎn)基因菊花植株。CmTCP20基因從'神 馬'中克隆得到，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。
[0057] 一種通過(guò)轉(zhuǎn)CmTCP20基因調(diào)控菊花花瓣生長(zhǎng)的方法，該方法具體包括W下詳細(xì)步 驟：
[0化引 （1)菊花CmTCP20基因的克隆
[0059] W切花大菊'神馬'花瓣為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)特異 引物，結(jié)合PCR擴(kuò)增目的基因的全長(zhǎng)序列，
[0060] 上游引物〇111^口20斗：5'-4了64(：了641^〇：44〔4〇：-3'(沈9 10備.2)，
[0061] 下游引物〇111^口20-尺：5'-(：了64〔〇：1'(：了644〇：1^6-3'(沈9 10備.3);
[00創(chuàng) W反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài) 細(xì)胞，獲得目的基因的序列為SEQ ID NO. 1。
[0063] (2)植物表達(dá)載體pMDC43-CmTCP20的構(gòu)建
[0064] 根據(jù)CmTCP20基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，W切花大菊'神馬'的cDNA為模板，用高保真 酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CmTCP20基因的上游和下游分別引入BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，上游引物 CmTCP20-GATE-F:5/-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3/ (沈Q ID N0.4)，
[00化]下游引物CmTCP20-GATE-R: 5' -TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3' (SEQ ID NO.5)；
[0066] PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，將提取的陽(yáng)性 質(zhì)粒由BamH巧日Not I雙酶切得到的CmTCP20片段與BamH巧日Not I雙酶切的pENTR?lA連 接，轉(zhuǎn)化，提取的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)Pvu I單酶切線性化后與植物表達(dá)載體PMDC43質(zhì)粒進(jìn)行LR重組 反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，植物表達(dá)載體pMDC43-CmTCP20構(gòu)建成功，所述的CmTCP20基因序 列為沈Q ID NO. 1。
[0067] (3)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將步驟(2)構(gòu)建的CmTCP20基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入菊花'神 馬'中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。
[0068] 制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將步驟(2)中構(gòu)建的CmTCP20基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài) 的農(nóng)桿菌中，挑選陽(yáng)性克隆，搖菌至0D = 0.5，離屯、后，棄上清，用MS(pH 5.8)培養(yǎng)液將沉淀 等體積懸浮，用于侵染;取組培瓶中菊花苗頂端葉盤(pán)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3d，然后浸入上述備好的轉(zhuǎn)入了 pMDC43-CmTCP20的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液中侵染8~ lOmin，用濾紙吸干葉盤(pán)表面的菌液后再將其接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入 篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4代，等分化出的抗性芽長(zhǎng)至2~3厘米時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初 步獲得抗性植株。所用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。
[0069] 菊花組織培養(yǎng)基WMS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH 5.8，100邱日、121°(：滅菌20分鐘；
[0070] 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+6-節(jié)氨基嚷嶺(6-BA)lmg/L+糞乙酸(NAA)0.5mg/l;
[0071] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+6-節(jié)氨基嚷嶺(6-BA)lmg/L+糞乙酸(NAA)0.5mg/l;
[0072] 篩選培養(yǎng)基:MS+潮霉素化yg)10mg/L+簇卞青霉素(Carb)500mg/L+6-節(jié)氨基嚷嶺 (6-BA)lmg/L+糞乙酸(NAA)0.1 mg/l;生根培養(yǎng)基:MS+潮霉素化yg)8mg/L。
[0073] 詳細(xì)操作過(guò)程為：
[0074] 從YEB(50yg/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50yg/mL利福平 的Y邸液體培養(yǎng)基中，200巧m，28 °C培養(yǎng)至0D值0.5，而后冰浴菌液30min，離屯、收集菌體，懸 浮于2mL預(yù)冷的1 OOmM化Cl2(20 %甘油)溶液中，200化/管分裝，待用。
[00巧]取10化pMDC43-CmTCP20載體質(zhì)粒，加入20化L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，液氮冷凍 5min，37 °C5min，加入800μΙ Y邸液體培養(yǎng)基，28°C200rpm預(yù)培養(yǎng)地，菌液涂板于YEB(50yg/ mL利福平巧化g/mL卡那霉素）固體培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測(cè)，選取陽(yáng)性克 隆搖菌，用于轉(zhuǎn)化菊花。
[0076] W切花菊'神馬'葉片為外植體，取組培瓶中菊花苗頂端葉盤(pán)(0.5cmx 0.5cm)作為 轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d，然后浸入備好的農(nóng)桿菌菌液中感染8~lOmin，用濾 紙吸干菌液后再接種到共培養(yǎng)基上黑暗中共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4代， 等分化出的抗性芽長(zhǎng)至2~3厘米時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株。
[0077] 將轉(zhuǎn)CmTCP20基因初步獲得的抗性植株進(jìn)行PCR鑒定、巧光定量RT-PCR分子檢測(cè)， 篩選陽(yáng)性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系。對(duì)通過(guò)PCR、巧光定量RT-PC