進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：將實(shí)施 例1中所得的卟啉光敏劑配成濃度為10 μ M/1的水溶液，將海拉細(xì)胞（細(xì)胞密度為5 X 103 個(gè)/孔，150 μ 1/孔）種植在96孔板中24h，然后將卟啉光敏劑水溶液加入到種植好的細(xì)胞 中培養(yǎng)4小時(shí)。然后殺死細(xì)胞，選用商業(yè)細(xì)胞核染料一H 〇echst33258對(duì)上述培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì) 胞核進(jìn)行標(biāo)記，然后利用激光共聚焦進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖分別如圖4、圖5和圖6所示。
[0123] 將上述圖4、圖5和圖6進(jìn)行疊加，獲得圖7。
[0124] 由圖4、圖6以及與圖7對(duì)比可以得知，由本發(fā)明提供的制備方法得到的卟啉光敏 劑和商業(yè)細(xì)胞核染料的成像位置、形態(tài)和數(shù)量一致，以及將圖4與圖5對(duì)比可以得出，葉啉 光敏劑具有在細(xì)胞核上成像的功能。
[0125] 光動(dòng)力治療特性測(cè)試
[0126] -、將實(shí)施例1中所得的卟啉光敏劑與海拉細(xì)胞采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：將 實(shí)施例1中所得的卟啉光敏劑配成兩組濃度均為10 μ M/1的水溶液，再將兩組海拉細(xì)胞 (每組細(xì)胞密度均為5 X 103個(gè)/孔，150 μ 1/孔）分別種植在96孔板中并培養(yǎng)24h，兩組培 養(yǎng)細(xì)胞中均加入配制好的卟啉光敏劑水溶液培養(yǎng)4小時(shí)，然后用PBS緩沖液洗去未進(jìn)入細(xì) 胞的光敏劑。選擇其中一組培養(yǎng)好的細(xì)胞在365nm紫外光下照射10分鐘，然后兩組培養(yǎng)細(xì) 胞均繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0127] 通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)紫外光作用前和紫外光作用后的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，結(jié) 果分別如圖8和圖9所示。
[0128] 由圖8、圖9可以得出：由本發(fā)明提供的制備方法得到的卟啉光敏劑在紫外光的作 用下，能夠產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒的單線態(tài)氧，從而具備殺死癌細(xì)胞的功能，且具有較強(qiáng)的殺死細(xì) 胞的能力。
[0129] 二、分別完成下述兩組實(shí)驗(yàn)：
[0130] 1)將實(shí)施例71中所得光敏劑分別配成0. 01μΜ/1、0. 1μΜ/1、1μΜ/1、5μΜ/1、 10 μ M/1、20 μ M/1、50 μ M/1和100 μ M/1的水溶液，然后將八組海拉細(xì)胞（每組細(xì)胞密度均 為5X103個(gè)/孔，150 μ 1/孔）分別種植在96孔板中并培養(yǎng)24h，將上述不同濃度的光敏 劑水溶液分別加入到每組種植好的海拉細(xì)胞中培養(yǎng)4小時(shí)后，用PBS緩沖液洗去未進(jìn)入細(xì) 胞的光敏劑，然后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0131] 2)將實(shí)施例1中所得光敏劑再次分別配成0. 01μΜ/1、0. 1μΜ/1、1μΜ/1、5μΜ/1、 10 μ M/1、20 μ M/1、50 μ M/1和100 μ M/1的水溶液，然后將八組海拉細(xì)胞（每組細(xì)胞密度為 5X 103個(gè)/孔，150 μ 1/孔）分別種植在96孔板中24h，將上述不同濃度的光敏劑水溶液分 別加入到每組種植好的海拉細(xì)胞中，4小時(shí)后，將各組培養(yǎng)好的細(xì)胞在365nm紫外光下照射 10分鐘后，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0132] 最后通過采用磺基羅丹明B染色法（sulforhodamine B，SRB)對(duì)紫外光照射前后 的培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞存活率進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖10所示。
[0133] 其中，細(xì)胞存活率可用下列公式計(jì)算：
[0134] 細(xì)胞存活率％= (A540nm處被處理后的細(xì)胞/A540nm處控制細(xì)胞數(shù)）X100%，其 中A540nm為染色后細(xì)胞在540nm處的吸收值。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取平均值，IC 5。值以卟啉光敏 劑聚集體濃度（μΜ)表示。
[0135] 由圖10可以得出：由本發(fā)明提供的制備方法得到的卟啉光敏劑在沒有紫外光的 刺激時(shí)，對(duì)細(xì)胞是無毒害的，基本不影響細(xì)胞存活率，而經(jīng)過紫外光作用后，光敏劑產(chǎn)生對(duì) 細(xì)胞有害的單線態(tài)氧，使細(xì)胞存活率大幅下降，因此卟啉光敏劑在紫外光作用下，具備較強(qiáng) 的殺死細(xì)胞的能力。
[0136] 以上結(jié)合【具體實(shí)施方式】和范例性實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，不過這些說明并 不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下， 可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案及其實(shí)施方式進(jìn)行多種等價(jià)替換、修飾或改進(jìn)，這些均落入本發(fā)明 的范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有可視化光動(dòng)力治療特性的卟啉光敏劑的制備方法，該方法包括以下步驟： 1) 將水溶性卟啉和可溶性硝酸鹽加入到水中，混合均勻，其中，水溶性卟啉可由式I所 示：其中，R為極性基團(tuán)，優(yōu)選為磺酸基芳烴基、N-烷基吡啶基及其衍生物基團(tuán)如N-烷基苯 并吡啶基、氨基芳烴基、季銨基芳烴基或羧基芳烴基； 2) 將步驟1)中的體系的pH調(diào)至酸性； 3) 在室溫和避光條件下，將步驟2)中調(diào)節(jié)pH后的體系靜置，獲得包含有卟啉光敏劑的 反應(yīng)體系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，在步驟1)中， 當(dāng)R為磺酸基芳經(jīng)基時(shí)，R選自下述結(jié)構(gòu)式中的一種：其中，Χ 為 Cl、Me、OMe 或 F; 當(dāng)R為N-烷基吡啶基及其衍生物基團(tuán)時(shí)，R選自下述結(jié)構(gòu)式中的一種：當(dāng)R為氨基芳經(jīng)基時(shí)，R選自下述結(jié)構(gòu)式中的一種： '(?，. 當(dāng)R為季銨基芳經(jīng)基時(shí)，R選自下述結(jié)構(gòu)式中的一種：當(dāng)R為羧基芳經(jīng)基時(shí)，R選自下述結(jié)構(gòu)式中的一種：3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，在所述步驟1)中， 所述基團(tuán)R為磺酸基芳烴基或羧基芳烴基，優(yōu)選為磺酸基芳烴基， 所述基團(tuán)R更優(yōu)選為下述結(jié)構(gòu)式中的一種：所述基團(tuán)R最優(yōu)選為下述結(jié)構(gòu)式中的一種：4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在所述步驟1)中， 所述可溶性硝酸鹽為硝酸鈉、硝酸鉛、硝酸鋇、硝酸鋅、硝酸鎘、硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸 鈰、硝酸鉻、硝酸鉍、硝酸鎳、硝酸銀、硝酸鈀、硝酸鉬、硝酸銥和鑭系金屬硝酸鹽中的一種或 多種， 所述可溶性硝酸鹽優(yōu)選為硝酸鈉、硝酸鈣、硝酸鋅、硝酸鉻、硝酸鎘、硝酸鉍、硝酸鎳和 硝酸鉺中的一種或多種， 所述可溶性硝酸鹽更優(yōu)選為硝酸鈉、硝酸鉍、硝酸鉻和硝酸鉺中的一種或多種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在所述步驟2)中， 選用無機(jī)酸將步驟1)中的體系的pH調(diào)至0. 1~5,所述無機(jī)酸為鹽酸、硫酸、磷酸、硝 酸、碘酸、硼酸、碳酸、偏磷酸、焦磷酸、次磷酸、硅酸和氫溴酸中的一種或多種，尤其是鹽酸、 硫酸、硝酸、磷酸和碳酸中的一種或多種，優(yōu)選為鹽酸、硝酸和硫酸中的一種或多種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在所述步驟2)中， 將體系的pH值調(diào)節(jié)至1. 0~4,優(yōu)選為2~3。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在所述步驟1)中， 所述水溶性卟啉和可溶性硝酸鹽的摩爾比為水溶性卟啉：可溶性硝酸鹽=1 :(〇. 1~ 25)，優(yōu)選1 : (0· 5~10)，更優(yōu)選為1 : (1~8)，最優(yōu)選為1 : (1. 2~4)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在所述步驟3)中， 靜置時(shí)間至少為6小時(shí)，優(yōu)選至少為12小時(shí)，更優(yōu)選至少為18小時(shí)，最優(yōu)選至少為24 小時(shí)，和/或 將步驟3)中獲得的含有卟啉光敏劑的體系經(jīng)過離心得到沉淀，然后對(duì)沉淀依次用去 尚子水洗滌、凍干。9. 由權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法制得的卟啉光敏劑，為一種納米聚集體，其尺 寸為200~500nm。10. 由權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的制備方法得到的卟啉光敏劑在光動(dòng)力治療方面 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有可視化光動(dòng)力治療特性的卟啉光敏劑的制備方法，該方法通過將水溶性卟啉分子與可溶性硝酸鹽在酸性、避光以及室溫的條件下進(jìn)行反應(yīng)，得到包含有卟啉光敏劑的反應(yīng)體系，該體系經(jīng)過處理后，得到卟啉光敏劑，為一種納米聚集體，具有細(xì)胞成像和光動(dòng)力治療特性。此外，由本發(fā)明提供的制備方法工藝簡(jiǎn)單，無需復(fù)雜的合成步驟以及后處理步驟，易于操作，成本較為低廉，因此，易于生產(chǎn)上的推廣。
【IPC分類】A61K49/00, A61K41/00, C07D487/22, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105622620
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410602362
【發(fā)明人】黃建濱, 趙薔, 閻云
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2014年10月31日