空間轉錄組建庫測序方法及所用裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學、醫(yī)學、農學等領域，尤其是一種利用芯片探針獲取組織細胞空 間位置信息的空間轉錄組建庫測序技術。該技術可以根據細胞的位置，類別以及狀態(tài)信息 對細胞進行準確的、可重復的標記和分類，可以在保留細胞組織中的位置分布的從自然組 織微環(huán)境下的活細胞中分離出RNA，通過高通量測序和生物信息分析等流程，一次性定量獲 得不同空間位置組織細胞的完整的表達譜。
【背景技術】
[0002] 轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的集 合。轉錄組測序即對特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉錄出來的所有mRNA進行測序。通過 新一代高通量測序，轉錄組測序能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài) 下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領域。細胞 是生命活動的基本功能單位，而在生物體內沒有任何兩個細胞是完全相同的。傳統(tǒng)的轉錄 組研究，絕大多數情況下都是針對混合的大量細胞進行的，無法觀察到單個細胞之間細微 的差別，掩蓋了獨立個體樣本的行為以及生命現象中特異性和細胞差異性。而針對單個細 胞的研究，是細胞生命分析技術所追求的極限狀態(tài)，是對傳統(tǒng)技術發(fā)展的終極挑戰(zhàn)。目前我 們正在步入一個單細胞轉錄組學時代，該研究方向會對生物學和醫(yī)學產生深刻的影響。然 而單細胞基因組及轉錄組測序所需要的測序樣本量要比單細胞中本身所含有的基因組及 轉錄組分子高出好多個數量級，所以這對核酸擴增技術(amplification technology)也是 一大考驗。而且目前采用的單細胞測序技術中，絕大多數方法都需要特定的前處理過程，制 備"測序文庫"。面對如此微量的分子，任何降解、樣品損失、或者污染都會對測序質量帶來 非常嚴重的影響。而且多重擴增又容易帶來試驗誤差，比如基因組或轉錄組覆蓋不均一、操 作失誤率高、重復性差、背景噪聲以及定量不準確等問題均造成單細胞測序難以廣泛應用 和推廣。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種基于組織和芯片空間位置信息的、操作簡 便、成本相對較低、特異性強、分辨率高、便于檢測特定組織特定細胞基因轉錄表達信息的 空間轉錄組建庫測序技術。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種基于組織和芯片空間位置信息的空間轉 錄組測序技術裝置:包括蓋玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上設有錨定探 針；
[0005] 所述蓋玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，蓋玻片的面積大于(略大于即可)硅基 寡核苷酸芯片的面積;在蓋玻片和娃基寡核苷酸芯片之間用于放置厚度為10~50um(例如 為45~55μπι，β卩，厚度為50μπι左右）的組織冷凍切片，所述組織冷凍切片的面積小于蓋玻片 的面積;且組織冷凍切片的面積 <(即，略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片上所有探針覆蓋 的面積。
[0006] 作為本發(fā)明的基于組織和芯片空間位置信息的空間轉錄組測序技術裝置的改進： 所述硅基寡核苷酸芯片的錨定探針為5 ' -GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC ACC〇
[0007] 本發(fā)明還同時提供利用上述任意一種裝置進行的空間轉錄組測序技術方法，包括 以下步驟：
[0008] 1)、首先加入第一段引物(20nmol)，第一段引物的序列為5'-GTGACTGGAGTTCAGACG TGTGCTCTTCCGATCT，退火溫度為 75 度/70 度；
[0009] 然后再加入第二段引物（約2ug的總量），0·lμMPolyd(T)Primer5'PH0-GNNNNNNNCCT (13-18) VN，退火溫度從70 降到 15度；
[0010] 再加入T4連接酶(2ul)，用于連接第一段和第二段引物，維持溫度15度，反應(快速 反應)20min，反應完成后吸走多余液體；
[0011] 2)、將組織切片放置于蓋玻片表面(加有位置標記的蓋玻片表面），組織切片的厚 度為10~50um(原則以小于或約等于細胞厚度為準），大小不超過1.5 X 1.5cm;將樣品朝上 的蓋玻片放置于顯微鏡下觀察組織細胞的位置，并拍照用于后續(xù)定位；
[0012] 完成拍照后，在芯片表面加入裂解液（10ul)，從而使裂解液鋪滿探針芯片探針表 面;將蓋玻片覆蓋在芯片上，組織樣品向下直接與芯片探針接觸；
[0013] 蓋玻片大小與芯片探針部分的大小對應，用于對應定位組織的部位；
[0014] 對芯片進行如下孵育，75°C3min65°C_0· l°C/s_(37~45)°C取出；
[0015] 注意，75°C---3min打開Total RNA的二級結構，準備和引物結合;0. l°C/s退火使 引物與模版結合更加準確;根據結合區(qū)域長度設定一般為40°C，長度改變需調整，當〇1 igoT 數目在13-18個之間變化時，最終溫度范圍在37-40°C變化，OligoT增多時提高溫度(例如至 45°〇；
[0016] 取走蓋玻片以及覆蓋在芯片表面的組織樣品，并吸走所有液體，使用RNase free 水輕柔洗滌一次；
[0017] 3)、在上述步驟2)完成后，在芯片上完成第一鏈反轉錄，然后消化RNA;
[0018] BP，消化lul RNase A(10mg/ml)(分解游離的RNA);
[0019] 具體如下：降解剩余的RNA，然后95°C孵化10min，吸取所有液體，轉移到離心管。芯 片使用RNase free水洗滌2次，并烘干可以重復使用。在PCR管里進行的反應:加入0.5ul酶 RNase Η(6〇υ/μ1)(分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈），37°C反應5min;
[0020] 備注:先RNase A消化游離的單鏈RNA，同時95°C高溫使雜交RNA解鏈，并且熱打斷 RNA;然后RNase Η將退火結合回反轉錄第一鏈的小片段RNA降解；
[0021] 4)、在上述3)步驟結束后的消化體系里，進行第二鏈引物的結合；
[0022] 即，加入ΙμΜ Second Primer和ΙμΜ Second REV Primer從98°C---lmin---80°C- 0.2°C/s-25°C30min，采用梯度孵化的方式結合反應；
[0023] 5)、將上述步驟4)孵化后的反應液里，接著進行第二鏈條延伸反應；
[0024] 8。，分別加入9.5以1(1(1!12〇,44110\陬811打6『，2411〇111]\1(1階？和2411(1611〇￥(3'-5'exo-)，在預先設置成25°CPCR儀中延伸(PCR儀背景溫度設為<25°C，溫度太高會使第五步 結合的引物脫落）；
[0025] 6)、將上述步驟5)反應完后，對產物進行磁珠純化(先配制80 %無水乙醇，總體積 = 0.4*(n+l)ml，n =樣品數）；
[0026] 具體步驟可如下：
[0027] 1.加水補齊至 80μ1，加入 80μ1 BECKBeads(lx);
[0028] 2.充分混勻后(吸打至少10次），靜置5min;
[0029] 3.稍離心，至于磁珠板上；
[0030] 4.靜置5min或看到液體澄清，緩慢吸取155μ1上清，丟棄；
[0031 ] 5.加入200μ1現配的80%無水乙醇，靜置30s;
[0032] 6.緩慢吸打2次后，吸取198μ1上清，丟棄；
[0033] 7 ·加入200μ1現配的80%無水乙醇，靜置30s;
[0034] 8.緩慢吸打2次后，吸取198μ1上清，丟棄；
[0035] 9.換10μ1槍吸去剩余酒精，干燥；
[0036](注意:步驟4-9，管子都要放在磁力架上）
[0037] 10.在磁珠出現裂紋后，將上述8管磁珠用26μ1 ddH20混合在一起，充分吸打混勻 后(吸打至少10次）；
[0038](備注:磁珠干燥太久會影響DNA得率）；
[0039] 11.靜置2min，稍離心，置于磁力架上2min，吸取全部上清至新的管中；
[0040] 12.新管再置于磁力架上5min，緩慢吸取23μ1上清用于后續(xù)實驗；
[0041 ] 13.剩余上清吸2μ1，Qubit測值，記錄。
[0042] 7)、進行 PCR 擴增；
[0043] 具體如下：
[0044]反應體系：
[0046] 使用以下PCR擴增程序：
[0047] 98〇C 30s
[0048] 98〇C 10s
[0049] 65〇C 30s 12_23Cycle
[0050] 72〇C 30s (PCR產量與起始mRNA相關）
[0051 ] 72〇C 5min
[0052] 4°C 保存；
[0053] 8)、對PCR產物再進行磁珠純化(先配制80 %無水乙醇，總體積=0.4*(n+1 )ml，n = 樣品數）；
[0054] 具體輔助操作步驟如