能快速降解17β-雌二醇的復(fù)合菌及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能快速降解17β-雌二醇的復(fù)合菌，應(yīng)用該復(fù)合菌劑快速降解畜禽養(yǎng)殖廢棄物中的類固醇雌激素一 17β-雌二醇，以減少環(huán)境污染并實(shí)現(xiàn)畜禽糞便的資源化利用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代化養(yǎng)殖大量使用的促生長類藥物，加之動物自身分泌的激素，使得畜禽糞便中類固醇雌激素含量非常高，如平均每頭奶牛通過糞便排除的17β—雌二醇當(dāng)量達(dá)到了 165微克/天，通過尿液形式排除的則高達(dá)498微克/天，使得畜禽養(yǎng)殖源的類固醇雌激素排放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了污水處理廠排水，成為環(huán)境中類固醇雌激素的主要污染源。類固醇雌激素的中毒機(jī)制主要包括模擬、干擾或?qū)箼C(jī)體內(nèi)生荷爾蒙原有的正常合成、運(yùn)輸和釋放，使其無法維持自身的平衡和調(diào)節(jié)，引起動物界的雌性化現(xiàn)象。類固醇雌激素在水環(huán)境中以很低的濃度即可產(chǎn)生嚴(yán)重危害，17β —雌二醇在河水中的含量僅為lng/L時就會造成雄魚的雌性化。歐盟規(guī)定的12種內(nèi)分泌干擾物中就包括類固醇雌激速和雌酮，并且17β—雌二醇被明確認(rèn)為是致癌物質(zhì)。由于疏水性強(qiáng)和生物可利用行低，特定條件下類固醇雌激素在環(huán)境中的滯留期會延長，污染范圍會擴(kuò)大，環(huán)境風(fēng)險也因此而增加。因此有必要針對畜禽養(yǎng)殖源排放的類固醇雌激素污染物進(jìn)行有效的源頭治理，在畜禽糞便資源化利用前降解去除類固醇雌激素污染物。
[0003]畜禽養(yǎng)殖源的類固醇雌激素的治理方法主要包括化學(xué)法和生物法。化學(xué)法主要是利用光催化，其缺點(diǎn)是處理成本高，主要適用于養(yǎng)殖廢水中雌激素的去除，對固態(tài)的養(yǎng)殖廢棄物中類固醇雌激素的去除能力非常有限;臭氧可氧化類固醇雌激素而使其降解，但成本非常高，不適宜于小型養(yǎng)殖場，并且如果氧化程度不徹底可產(chǎn)生仍然有雌激素活性的中間代謝產(chǎn)物，因此不宜大規(guī)模推廣。生物法主要是利用微生物的新陳代謝作用來降解環(huán)境中的類固醇雌激素，由于生物法具有成本低，無二次污染，適用面廣等特點(diǎn)，在畜禽養(yǎng)殖排放源類固醇雌激素的生物治理方面具有明顯的優(yōu)勢，越來越引起人們的重視。
[0004]國內(nèi)外主要是從留體雌激素生產(chǎn)企業(yè)的廢水和活性污泥中分離獲得高效的類固醇激素降解菌，從污水處理的角度進(jìn)行的研究。而畜禽養(yǎng)殖是水環(huán)境及污水中類固醇激素的主要來源，因此對畜禽養(yǎng)殖過程進(jìn)行類固醇激素污染的源頭控制，可有效去除水體中的類固醇激素，對傳統(tǒng)的污水處理系統(tǒng)不需要提出更高的要求，否則末端治理時需要對傳統(tǒng)的污水處理技術(shù)和單元進(jìn)行改善和升級才能達(dá)到對類固醇激素的有效去除。目前國內(nèi)外主要是從單一菌株的角度出發(fā)，研究其降解機(jī)理以及對污水中類固醇激素的去除，并沒有完整地開展畜禽養(yǎng)殖過程中類固醇激素的降解研究和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決自然環(huán)境下17β_雌二醇降解速率低和單一降解菌環(huán)境適應(yīng)能力低的問題，提供一種能快速降解17β_雌二醇的復(fù)合菌。具體而言，本發(fā)明是從環(huán)境中分離出高適應(yīng)能力和強(qiáng)降解效果的土著復(fù)合菌株，即利用復(fù)合菌株之間的協(xié)同共生作用和數(shù)量結(jié)構(gòu)的自我調(diào)節(jié)作用來擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，增強(qiáng)其降解類固醇雌激素的能力。該復(fù)合菌可快速降解處理畜禽養(yǎng)殖廢棄物和土壤中的17β-雌二醇，有效降低畜禽養(yǎng)殖中由17β-雌二醇污染帶來的生態(tài)和人體健康風(fēng)險。
[0006]本發(fā)明能快速降解17β_雌二醇的復(fù)合菌，是由保藏號為CGMCCN0.10814的乙酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus LM1和保藏號為CGMCC N0.10815的假單胞菌Pseudomonas sp.LYl組成。
[0007]通過大量試驗(yàn)證實(shí)，所述的乙酸鈣不動桿菌LM1和假單胞菌LY1以1:1的細(xì)胞數(shù)量比混合，對處理畜禽養(yǎng)殖廢棄物和土壤中的17β-雌二醇，降解效率最佳。
[0008]本發(fā)明能快速降解17β_雌二醇的復(fù)合菌由以下方式獲得:
[0009]1、菌種馴化培養(yǎng)與篩選
[00?0]分別從養(yǎng)豬場、養(yǎng)雞場、養(yǎng)牛場米集堆放的畜禽奠便和廢物處理設(shè)施中米集樣品，按照質(zhì)量比1:1的比例混合，取混合樣品50g加入到500ml無菌水中，150rpm下振蕩提取菌體細(xì)胞，將提取液按5 %的比例接入到以20mg/Ll7β—雌二醇(17β —雌二醇)為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)5天，取培養(yǎng)物再接種至含有17β—雌二醇的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變渾濁后再接種馴化培養(yǎng)，將最后一次的培養(yǎng)物梯度稀釋后涂布于固體的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單個菌落，劃線純化后分別將單一和復(fù)合菌以及睪丸酮叢毛單胞菌ATCC11996的菌懸液加入到17β—雌二醇為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)17β—雌二醇的降解率最終篩選出可高效協(xié)同降解17β—雌二醇的兩株菌，分別命名為LY1 和 LM10
[0011]2、菌種的鑒定與保藏
[0012]用形態(tài)觀察、革蘭氏染色和16SrRNA基因序列分析方法，對能夠快速協(xié)同降解17β—雌二醇的2種菌株進(jìn)行鑒定，并于2015年5月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，其中乙酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus LM1 的保藏號CGMCC N0.10814，假單胞菌Pseudomonassp.LYl的保藏號為CGMCC N0.10815。
[0013]所述菌株LM1，通過菌落特征色、革蘭氏染和生理生化檢測試驗(yàn)，表明具有以下特征及生物特性:在LB瓊脂上經(jīng)30°C培養(yǎng)24小時，呈乳白色不透明的圓形菌落，直徑1.5mm左右，中央隆起，表面及邊緣均光滑，粘而附于培養(yǎng)基上。革蘭氏染色鏡檢為陰性菌，細(xì)胞成桿狀，可形成不同長度的鏈狀，靜止期成球形，常成對。無芽孢。生化特性結(jié)果顯示，分離菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-纖維二糖、其它糖醇類不能利用；不利用苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸以及精氨酸;能在檸檬酸鹽(鈉)、丙二酸鹽中生長。氧化酶陰性，觸酶陽性，不產(chǎn)硫化氫，可利用琥珀酸鹽產(chǎn)堿，對卡那霉素?zé)o抗性，葡萄糖產(chǎn)酸。
[0014]所述菌株LY1菌株，通過菌落特征色、革蘭氏染和生理生化檢測試驗(yàn)，表明具有以下特征及生物特性:在LB瓊脂上經(jīng)30°C培養(yǎng)24小時，菌落中間微凸出，透明，表面濕潤光滑。革蘭氏陰性，短桿狀，0.5?Ι.ΟμπιΧ 1.5?5.Ομπι，不產(chǎn)芽孢，好氧。生化特性結(jié)果顯示，利用D-葡萄糖，不能利用D-纖維二糖，可利用檸檬酸鹽(鈉)丙二酸鹽和檸檬酸鹽，乳酸鹽產(chǎn)堿，琥珀酸鹽產(chǎn)堿，對卡那霉素?zé)o抗性。
[0015]16S rRNA基因序列分析和同源性比較表明菌株LM1與乙酸鈣不動桿菌的同源性最高，菌株LY1與假單胞屬的菌株同源性最高。綜合上述結(jié)果，菌株LM1和LY1分別被鑒定為乙酸鈣不動桿菌和假單胞菌。
[0016]3、復(fù)合菌的制備
[0017]首先將菌株LY1和LM1的菌體細(xì)胞分別劃線于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上在25°C下培養(yǎng)24h，然后向長滿菌體細(xì)胞的平板中加入無菌水，用玻璃棒使菌體細(xì)胞脫離培養(yǎng)基進(jìn)入無菌水中，將含菌體細(xì)胞的懸濁液漩渦振蕩均勻后，再利用無菌水將菌懸液的OD600調(diào)節(jié)為0.10-0.20(細(xì)胞數(shù)量為106-107CFU/ml)，將兩株菌的菌懸液以1:1的細(xì)胞數(shù)量比混合，即得復(fù)合菌。
[0018]復(fù)合菌劑降解17β_雌二醇的環(huán)境因子響應(yīng)特征測試:
[0019](1)碳氮比對復(fù)合菌降解17β—雌二醇的影響
[0020]分別取0.5mL 17β—雌二醇儲備液加入到12個盛有100mL無氮無機(jī)鹽培養(yǎng)基(去掉原無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的硫酸銨)的250mL三角瓶中，向4個三角瓶中分別加入不同