r，3 :誘導(dǎo)后3hr。
[0050] 圖3為SP層析介質(zhì)捕獲重組蛋白A聚體的洗脫色譜圖。
[0051] 圖4為本發(fā)明的重組蛋白A聚體和重組野生型蛋白A (rPA)的耐堿性測試結(jié)果。其 中，圖（a)是本發(fā)明的重組蛋白A聚體在堿性條件下37°C孵育不同時間后的SDS-PAGE電泳 圖，其中各泳道樣品的孵育時間分別為：1 :〇hr，2 :4hr，3 :8hr，4 :16hr，5 :24hr ;圖（b)是重 組野生型蛋白A在堿性條件下37°C孵育不同時間后的SDS-PAGE電泳圖，其中各泳道樣品的 孵育時間分別為：1 :〇hr，2 :4hr，3 :8hr，4 :16hr。
【具體實施方式】
[0052] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)通過改造野生型金黃色葡萄球菌蛋 白A (SpA)的氨基酸序列，即將特定位置的氨基酸突變?yōu)樘囟ǖ陌被幔娠@著地提高其耐 堿性。此外,相較于野生型SpA，本發(fā)明的SpA重組蛋白（重組蛋白A聚體）在堿性條件下 穩(wěn)定性更好，在親和層析過程中其蛋白載量更高，從而優(yōu)化了蛋白純化過程。在此基礎(chǔ)上完 成了本發(fā)明。
[0053] 術(shù)語"具抗體結(jié)合能力的蛋白"可以是指該蛋白能夠結(jié)合于免疫球蛋白的Fc片 段。然而，其沒有排除結(jié)合Fc片段的蛋白也可以結(jié)合其他的區(qū)域，例如，免疫球蛋白的Fab 區(qū)域。
[0054] 在本發(fā)明中，突變通過交換位置的編號來定義，前面是野生型或非突變的氨基酸， 后面是突變的氨基酸。例如，在位置3處的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼岜硎緸?Asn3Asp"。
[0055] 術(shù)語"Z片段"是指將野生型SpA(E，D，A，B，C)B片段的第29位氨基酸（甘氨酸） 改為丙氨酸后得到的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0056] 重組蛋白A聚體
[0057] 本發(fā)明提供了一種重組蛋白A聚體，所述重組蛋白A聚體是兩個或多個金黃色葡 萄球菌蛋白A的Z片段的串聯(lián)形成的多聚體，并且各Z片段中的至少一個為具有以下氨基 酸突變的Z片段突變體：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述的Z片段中的每一個為具有以下氨基酸突變的Z片段突變 體：Asn 3Asp、Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白A聚體為2-20聚體，較佳地4-10聚體。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白A聚體為4聚體、6聚體、8聚體、10聚體。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述重組蛋白A聚體中相鄰的兩個Z片段直接相連，或通過連接 肽相連。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述重組蛋白A聚體由Z片段和連接肽構(gòu)成；所述連接肽存在 于Z片段之間，并且所述Z片段全部是具有以下氨基酸突變的Z片段突變體:Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白A聚體具有式（I)所示的結(jié)構(gòu)：
[0064] Pa-(Za_L) n-Za-Pb (I)
[0065] 式中，
[0066] Pa為無、Met、前導(dǎo)序列、分泌肽序列、用于純化的標(biāo)簽序列或其組合；
[0067] Za獨立地為金黃色葡萄球菌蛋白A的Z片段的氨基酸序列，并且至少一個Za為具 有以下氨基酸突變的Z片段突變體：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr ;
[0068] L獨立地為無、或連接肽序列；
[0069] η為彡1的正整數(shù)；
[0070] Pb為無、Cys、純化的標(biāo)簽序列或其組合。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，η為1-50的正整數(shù)，較佳地2-20的正整數(shù)。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所有的Za為具有以下氨基酸突變的Ζ片段突變體:Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述的Za的序列包含如SEQ ID No. :3所示的序列。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述的Za的序列具有如SEQ ID No. :3所示的序列。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述的L為長度3-50個（較佳地3-20個）氨基酸的連接肽序 列。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，所述的L由不影響或不顯著影響蛋白正確折疊和構(gòu)象的氨基酸 構(gòu)成，例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的L選自下組：QKDAVFP、ASTKGP。
[0078] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白A聚體具有式（II)所示結(jié)構(gòu)：
[0079] Met-Za-L-Za-L-Za-L-Za-Cys (II)
[0080] 其中，Za和L定義同上。
[0081] 在另一優(yōu)選例中，所述重組蛋白A聚體為具抗體結(jié)合能力的蛋白。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括IgG抗體（例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM 抗體、IgA抗體。
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述重組蛋白A聚體的C末端還含有氨基酸殘基Cys。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述重組蛋白A聚體具有如SEQ ID No. :5所示的氨基酸序列。
[0085] 本發(fā)明所述的重組蛋白A聚體，除了指具有上述具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A活 性的，具有氨基酸序列如SEQ ID N0. 5的蛋白之外，還包括具有與所述重組蛋白A相同或相 近功能的、SEQ ID N0. 5序列的變異形式。這些變異形式包括（但不限于）：若干個（通常 為1-20個，更佳地1-10個、或1-8個、或1-5個、或1-3個、或1-2個）氨基酸缺失、插入和 /或取代，以及在C末端添加或缺失一個或數(shù)個（通常為1-20個，更佳地1-10個、或1-5 個）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋 白質(zhì)的功能。又例如，在C末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。在 另一優(yōu)選例中，重組蛋白A聚體的C末端添加了一個氨基酸殘基Cys。
[0086] 蛋白的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、在高或 低的嚴緊度條件下能與具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以 及利用所述具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的抗血清獲得的蛋白或蛋白。
[0087] 如本文所用，除非另外說明，所述的"重組蛋白A"、"SpA重組蛋白〃，"重組蛋白A 聚體"可互換使用，均是指野生型SpA經(jīng)過氨基酸序列改造后的得到的本發(fā)明的重組蛋白。
[0088] 本發(fā)明的重組蛋白A聚體可以由化學(xué)合成，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主中 產(chǎn)生。宿主可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可表達重組蛋白的細胞（例如，細菌、酵母、 高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞）。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主是大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明所述的"Z片段突變體"為：將Z片段的第3、6、23位氨基 酸（天冬酰胺）分別改為天冬氨酸，亮氨酸和蘇氨酸，得到Z片段突變體（如SEQ ID N0. 3 所示）。
[0090] 如本文所用，術(shù)語："連接肽"（linker peptide)指位于兩個突變蛋白片段之間 的、起連接作用的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度通常為5-50個氨基 酸。在另一優(yōu)選例中，連接肽不影響或不顯著影響突變蛋白片段形成正確的折疊和空間構(gòu) 象。在另一優(yōu)選例中，連接肽序列大約是5-50個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，連接肽序列大 約是10-20個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，連接肽包含如SEQ ID N0. 4所示的序列。在另一 優(yōu)選例中，連接肽具有如SEQ ID N0. 4所示的序列。
[0091] 本發(fā)明還提供了編碼所述重組蛋白A聚體的核苷酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明包括了 可用于通過現(xiàn)有技術(shù)在重組的宿主中表達來生產(chǎn)突變體的蛋白DNA序列。（基于密碼子的 簡并性，本發(fā)明包括可以編碼所述重組蛋白A聚體的所有核苷