一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的 試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Dubin-Johnson綜合征(DJS)是一種少見的以慢性持續(xù)性或間歇性黃疸為臨床特 點的常染色體隱性遺傳病，以結(jié)合膽紅素增高為主的先天性非溶血性黃疸。由Dubin和 Johnson于1954年首先報道，常見于青少年和幼年。復(fù)合耐藥相關(guān)蛋白2MRP2(編碼基因 ABCC2)，是ATP依賴的有機陰離子的重要轉(zhuǎn)運體，如二葡萄糖苷酸膽紅素、硫酸鹽、還原型谷 胱甘肽等的轉(zhuǎn)運，是非膽汁酸鹽依賴性膽汁流形成的重要因素。由于毛細膽管上位于10q24 的多特異性有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（cMOAT)的基因（ABCC2/MRP2超家族)缺陷，導(dǎo)致毛細膽管 對有機陰離子尤其是兩性化合物如二葡萄糖苷酸膽紅素轉(zhuǎn)運異常，肝細胞先天性膽紅素排 泌障礙，對非水溶性有機陰離子的排泄也有缺陷，但對膽鹽的排泌正常，導(dǎo)致DJS。
[0003] 本病較罕見，以多見于男性。Dubin-Johnson4000例肝臟活體組織檢查中有12例 (0.3%)，美國肝病登記8000例有23例(0.29%)，國內(nèi)也有本病的報導(dǎo)，發(fā)病率亦不高。本綜 合征的臨床表現(xiàn)大致有三種類型：第一種是臨床無任何自覺癥狀，常因其它疾病就診而被 發(fā)現(xiàn)，此類少見。第二種是長期黃疸反復(fù)發(fā)作，食欲不振、疲乏無力，肝區(qū)不適，惡心甚至嘔 吐，尿色加深，酷似病毒性肝炎。此類最常見。第三種是持續(xù)黃疸不退，尿色深黃，但胃腸癥 狀不明顯，可應(yīng)付日常工作。DJS常見于青少年，因為該疾病癥狀輕微，醫(yī)生或患者對該疾病 認識不足不予重視，導(dǎo)致患者長期誤診。
[0004] ABCC2基因位于染色體10q24,為45kb，包括32個外顯子，不同的種族存在不同的 MRP2/ABCC2基因突變類型。ABCC2基因在1066密碼子突變，使4個跨膜區(qū)和整個第2個三磷酸 腺苷結(jié)合位點缺失，從而喪失轉(zhuǎn)運非膽汁酸有機陰離子的功能。最新報道表明ABCC2基因第 17號外顯子錯義突變和第28外顯子無義突變共同引起雜合性突變，也可導(dǎo)致MRP2蛋白功能 喪失，使二葡萄糖苷酸膽紅素轉(zhuǎn)運異常，從而引起DJS。
[0005] 明確診斷可以避免反復(fù)就診和不必要的治療，以及避免其加重損害的因素。通過 對ABCC2基因的檢測，尤其是編碼MRP2段基因的檢測有助于診斷DJS，減少誤診的發(fā)生。 Sanger測序法是目前公認的，是大多數(shù)臨床分子診斷項目的金標準，特異性甚至能達到 100%，是分子診斷方面的經(jīng)典技術(shù)平臺。因此采用Sanger測序法對編碼MRP2的基因ABCC2 的序列進行突變檢測，具有穩(wěn)定性高，特異性好的優(yōu)點，能夠有效避免假陽性的產(chǎn)生。
[0006] 為了給Sanger測序提供可靠的模板，首先必須針對該項目的特點，建立一個穩(wěn)定 可靠的PCR體系。該項目PCR部分在技術(shù)環(huán)節(jié)存在以下兩個難點：1.該項目需要提取血液全 基因組DNA，由于臨床標本物流運輸中存在眾多不可控因素，因此臨床檢驗中往往得不到質(zhì) 量優(yōu)良的全血標本，因此獲得的DNA質(zhì)量也會存在較大的樣本間差異。2.由于需檢測的外顯 子數(shù)目較多，即PCR目的片段過多，導(dǎo)致PCR條件不統(tǒng)一。
[0007] 溶解溫度(Tm)是PCR中一個很重要的參數(shù)，是50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈 DNA分子時的溫度，對于設(shè)定PCR退火溫度是必須的，合適的退火溫度能夠有效的減少非特 異性結(jié)合，還能保證目的序列有效退火。所以在保證特異性的情況下，設(shè)計引物的Tm值盡量 接近，使PCR的退火溫度可以保持一致，從而達到PCR條件的統(tǒng)一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因 的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒可用于檢測ABCC2基因的突變位點，特異性好，靈敏度高。 [0009]本發(fā)明的一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒，所述試劑盒包括 PCR擴增反應(yīng)試劑以及用于樣本DNA中ABCC2基因擴增的PCR引物;其中，PCR引物如下：
[0038]所述PCR擴增反應(yīng)試劑包括GoTaq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反應(yīng)緩沖液。
[0039]本發(fā)明的一種檢測Dubin-Johnson綜合癥的ABCC2基因的試劑盒的檢測方法，包括 如下步驟：
[0040] (1)采集待測血液樣本，提取DNA;
[00411 (2)以該DNA為模板，采用用于樣本DNA中ABCC2基因擴增的PCR引物進行PCR擴增， 得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進行測序分析，確定是否存在堿基突變。
[0042]所述步驟（2)中的PCR反應(yīng)條件為：95°C5min;95°C30s、62°C30s、72°C40s，15個循 環(huán)；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25個循環(huán)；最后72°C10min。
[0043]所述步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為:PCR擴增反應(yīng)試劑10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，樣品DNA2yL。
[0044]有益效果
[0045]本發(fā)明可用于檢測ABCC2基因的突變位點，特異性好，靈敏度高；可用于臨床作為 Dubin-Johnson綜合癥早期發(fā)現(xiàn)、早期明確診斷的輔助性指標，降低誤診率和避免延誤治 療;家系成員進行篩查可明確發(fā)病風險，產(chǎn)前篩查并進行干預(yù)，可降低后代Dubin-Johnson 綜合癥的發(fā)病率，使用方法簡單，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0046] 圖1是ABCC2基因Exon3(A)和Exon7(B)野生型的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0047]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0048] 實施例1
[0049] 1.樣本抽提
[0050] (1)抽取200yL的全血，加入20yL蛋白酶K溶液，混勻。
[00511 (2)加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置10分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次，溶 液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0052] (3)加入200yL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去 除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0053] (4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。[0054] (5)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0055] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0056] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm(l3400Xg)離心30秒，倒掉廢 液。
[0057] (8)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸 附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0058] (9)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5mL離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50yL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心 管中。
[0059] 2.實驗過程
[0060] (1)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)=待測樣本數(shù)+陰性對照1個+陽性對照1個)取預(yù)混PCR反應(yīng) 體系每管20yL分裝于反應(yīng)管中。
[0061] (2)將上述處理好的待測樣本和陰性、陽性對照各取2yL分別加入反應(yīng)管中，混勻， 低速離心數(shù)秒，進行PCR擴增，具體反應(yīng)體系如下：
[0063]PCR反應(yīng)條件，見下表：
[0065] 3