一種從三棱中提取苯丙素類化合物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從三棱中提取苯丙素類化合物的方 法，以及該化合物制備抗肝癌、抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯丙素類化合物是一種從中藥三棱中獲得的小分子化合物，為黃色或略帶棕色的 晶體，由一個苯環(huán)和脂肪鏈構(gòu)成其基本骨架，其4
部分可由葡萄糖或果糖取代，結(jié) 構(gòu)式如下所示：
[0003]
[0004]現(xiàn)今對苯丙素類化合物的分離提取受傳統(tǒng)中藥非機械化的操作方式所限制，僅限 于傳統(tǒng)的大孔樹脂或者有機合成，步驟繁瑣，耗時，耗力，得到的化合物量少且批次間差異 大，難以進行臨床研究。
[0005]另外對于該小分子而言，它的應(yīng)用也很少有人研究，因此其潛在作用有待開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，提供一種從中藥三棱中提 取苯丙素類化合物的方法，該方法采用高效液相色譜進行分離純化，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性 高，制備量大，操作簡單省時。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0008] 一種從三棱中提取苯丙素類化合物的方法，該方法包括以下步驟：
[0009] (1)超低溫粉碎:取干燥的三棱為原料，進行超微粉碎5~20min，得到超微粉；
[001 0] (2)乙酸乙酯提取:在超微粉中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯的加入體積(L)為超微粉 質(zhì)量(Kg)的8~10倍，70~75°C加熱1~3小時進行提取，離心取沉淀重復(fù)1~3次，合并提取 的上清并濃縮干燥，為粗提組分；
[0011] (3)色譜分離：
[0012] (a) -維分離:取粗提組分用40 %乙醇-正己烷溶液（乙醇與正己烷按體積比4:6配 比而成，下同理)20~60°C超聲溶解至濃度為60~100mg/ml，過膜后通過高壓制備液相色譜 進行分離，采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用A流動相為正己烷、B流動相為乙醇 的二元流動相體系，進樣量為100~150mL/針，流動相流速為550~600mL/min，洗脫方式為B 相濃度由〇%至30%(S卩0%乙醇-正己烷溶液至30%乙醇-正己烷溶液)梯度洗脫50-60min， 檢測波長為210~280nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集10-17.5min洗脫液作為目的組分，經(jīng)濃縮 后真空冷凍干燥，得到苯丙素類化合物粗品；
[0013] (b)二維分離:取苯丙素類化合物粗品用40%乙醇-正己烷溶液20~60°C超聲溶解 至濃度為60~100mg/ml，過膜后通過高壓制備液相色譜進行分離，采用的色譜柱為Silica 正相硅膠色譜柱，采用A流動相為正己烷、B流動相為乙醇的二元流動相體系，進樣量為1~ 4mL/針，流動相流速為12~16mL/min，洗脫方式為B相濃度5 % (S卩5 %乙醇-正己烷溶液)等 度洗脫25-30min，檢測波長為210~280nm，根據(jù)紫外吸收光譜分別收集22-23.5min洗脫液 作為目的組分，經(jīng)濃縮后真空冷凍干燥，得到本發(fā)明目的苯丙素類化合物。
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟(1)中超微粉碎時間為12min。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中乙酸乙酯提取的提取溫度為72°C。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中超微粉與乙酸乙酯的料液比為1:8。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟（3)(a)中粗提組分溶解于40 %乙醇-正己烷溶液的濃度為 80mg/ml〇
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟(3) (a)-維分離中色譜柱的直徑為150mm，柱長為250mm，其中 娃球粒徑為1 〇ym，孔徑為1Onm。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟(3) (b)二維分離中苯丙素類化合物粗品溶解于40%乙醇-正 己燒溶液的濃度為80mg/ml。
[0020] 作為優(yōu)選，所述步驟(3)(b)二維分離中色譜柱的直徑為20mm，柱長為250mm，其中 娃球粒徑為1Oym，孔徑為100A
[0021] 本發(fā)明進一步提供上述提取得到的苯丙素類化合物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。 該苯丙素類化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形 劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、 懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0022] 本發(fā)明還進一步提供上述提取得到的苯丙素類化合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng) 用。該苯丙素類化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或 賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液 劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0023]本發(fā)明原料三棱為黑三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，其化學(xué)成分復(fù)雜，目的化合 物苯丙素類化合物極性較小，所以本發(fā)明先選用乙酸乙酯進行有效組分的粗提。根據(jù)相似 相溶原理，該溶劑可以盡可能多地溶解目的組分以及與相近的小分子雜質(zhì)，且乙酸乙酯為 脂溶性溶劑，與其相似相溶的目的組分也應(yīng)該具備進入生物活性細胞所必需的脂溶性特 性，從而具有更高的進入細胞參與細胞內(nèi)作用的可能性。
[0024]其次在色譜分離的選擇上選用離線二維液相色譜技術(shù)進行有效組分的提取，其優(yōu) 勢在于二維液相色譜不僅具有更高的峰容量，而且二維具有不同的選擇性。經(jīng)過一維簡化 的組分可以在二維上根據(jù)不同的選擇性實現(xiàn)互補分離，結(jié)構(gòu)相似的化合物可能在二維上可 達到有效分離，從而提高制備的效率和化合物純度。
[0025]本發(fā)明利用液相色譜制備的方法成功從中藥三棱中提取分離得到純度達到99% 的天然小分子苯丙素類化合物，該方法工藝簡單，時間周期短，試劑耗費量小，制備量大，穩(wěn) 定可控，重復(fù)性好，實用性高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0026]現(xiàn)在藥理研究表明，三棱具有多種藥理作用并被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、婦科 如子宮肌瘤各類疾病的治療。因此從中分離出具有確切結(jié)構(gòu)并且易于進行化學(xué)合成的集抗 癌活性為一體的化合物必將為抗癌新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明得到的苯丙素類化合物性 質(zhì)穩(wěn)定，通過細胞在線實時監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)該化合物對肝癌 Hep-g2細胞和肺癌A549細胞具有抑制作用，即體外實驗抗腫瘤作用明顯，具有良好的抗癌 藥物開發(fā)潛力，為抗癌天然藥物的開發(fā)提供了有力的依據(jù)。
【附圖說明】
[0027]圖1所示的是本發(fā)明實施例1中一維高壓液相色譜分離圖；
[0028] 圖2所示的是本發(fā)明實施例1中二維高壓液相色譜分離圖；
[0029]圖3所示的是本發(fā)明得到的目的組分的HPLC驗純圖；
[0030]圖4所示的是本發(fā)明得到的目的組分的C13NMR核磁圖；
[0031 ]圖5所示的是本發(fā)明得到的目的組分的tfNMR核磁圖；
[0032]圖6所示的是本發(fā)明得到的目的組分的質(zhì)譜分析圖；
[0033]圖7所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物苯丙素類化合物對肺癌A549細胞的抑制作用；
[0034]圖8所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物苯丙素類化合物對肝癌Hep_G2細胞的抑制作用。
【具體實施方式】
[0035]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0036] 1、原料、材料：
[0037]三棱采摘自保定安國并經(jīng)過鑒定;A549細胞、Hep_G2細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液 病醫(yī)院提供。
[0038] 2、試劑：
[0039]乙醇夠自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;分析級正己烷購自天津康科德科技有限公 司；色譜級乙酸乙酯購自Honeywell公司；DMS0購自Sigma公司；F-12K培養(yǎng)基購自Life TechnologiesCorporation;MEM培養(yǎng)基貝勾自LifeTechnologiesCorporation。
[0040] 3、儀器設(shè)備：
[0041] 分析純水由密立博純水儀生產(chǎn);超微粉碎機購自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司； 臺式冷凍離心機購自Thermo公司；恒溫鼓風干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠;硅膠色譜柱購自博納艾吉爾有限公司；制備型高效液相色譜 儀購自江蘇漢邦科技有限公司；細胞實時監(jiān)測儀購自艾森生物(杭州)有限公司；細胞培養(yǎng) 箱購自立德泰勅(上海)科學(xué)儀器有限公司。
[0042] 實施例1:
[0043]本實施例從三棱中提取苯丙素類化合物的方法，包括以下步驟：
[0044]⑴取干燥的三棱為原料，放入超微粉碎機中進行超微粉碎，同時粉碎全過程用4°C的水作為超微破碎機內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時間為12min，得到超微粉。
[0045]⑵取上述三棱超微粉3Kg，經(jīng)過三次乙酸乙酯提取，第一次提?。?kg超微粉加入 24L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm離心30min，分別收集上清、沉淀。第 二次提取:第一次提取沉淀加入12L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm離 心30min，分別收集上清、沉淀。第三次提?。旱诙翁崛〕恋砑尤?L乙酸乙酯，72°C提取 70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm離心30min，收集上清，三次上清液合并并濃縮干燥，為粗提 組分。
[0046] ⑶將干燥至恒重的粗提組分用流動相(40%乙醇-正己烷溶液)配制成80mg/mL的 溶液，溶解后過〇. 45μπι的有機濾膜，得到三棱小分子提取物的樣品溶液。
[0047]⑷所述樣品溶液進行一維