一種亞棕裸蠓的特異基因及其分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及亞棕裸蠓的特異基因序列及其分子鑒定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠓類是雙翅目中的微小型昆蟲，俗稱小咬。目前，對(duì)蠓類的鑒定主要依靠經(jīng)驗(yàn)豐富 的分類學(xué)專家識(shí)別形態(tài)學(xué)特征來實(shí)現(xiàn)，一旦遇到近緣種和形態(tài)特征掌握不全的標(biāo)本鑒定就 很棘手;而且，對(duì)吸血蠓的形態(tài)鑒定需要通過制作玻片標(biāo)本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、 難度大，因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0003] 分子鑒定技術(shù)是以遺傳物質(zhì)DNA序列分析為依據(jù)來闡明物種間的差別，從分子水 平上快速而準(zhǔn)確地鑒別物種。它是分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)與傳統(tǒng)分類學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，作 為一種嶄新的分類學(xué)技術(shù)，極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷，已引起越來越多生物學(xué)家 們的重視。近年來，隨著以PCR基礎(chǔ)的DNA序列測(cè)定方法的建立和廣泛使用，核糖體DNA (rDNA)和線粒體DNA(mtDNA)等基因逐漸受到重視，并在吸血蠓的分子鑒定中得到廣泛應(yīng) 用。該技術(shù)與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全等問題，而且可實(shí) 現(xiàn)吸血蠓的快速鑒定。本發(fā)明提供的亞棕裸蠓特異基因序列有利于實(shí)現(xiàn)亞棕裸蠓的快速鑒 定，縮短鑒定時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種亞棕裸蠓的特異基因序列及其分子鑒定方法。通過分 子生物學(xué)方法獲取亞棕裸蠓(Atrichopogonsubfusculus)特異基因一18SrDNA基因序列， 通過基因序列相似性的比對(duì)，可準(zhǔn)確、快速地鑒定亞棕裸蠓。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法，通過改進(jìn)的PCR反應(yīng)條件，由合成的引物擴(kuò)增 亞棕裸蠓的18SrDNA基因，PCR產(chǎn)物序列送由專業(yè)生物公司測(cè)定。測(cè)序結(jié)果通過手工校對(duì)、 序列拼接，并在NCBI中進(jìn)行Blast相似性搜索，確保所得序列為目標(biāo)序列。本發(fā)明所述的 一種亞棕裸蠓特異基因，為18SrDNA基因，所述裸蠓的18SrDNA基因序列如SEQIDNo. 1 所示(不含引物）：
[0006] 所述的亞棕裸蠓18SrDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為： 正向引物 5'CCTGAGAAACGGCTACCACATC3' 反向引物 5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT3'。
[0007]本發(fā)明所述的亞棕裸蠓的分子鑒定方法，包括： 1) 從待測(cè)的昆蟲組織中分離提取DNA; 2) 以該DNA為模板，采用的引物為:正向引物5 'CCTGAGAAACGGCTACCACATC3 '，反向引物 5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出該昆蟲的18SrDNA基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的18SrDNA基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng) 溴乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。若能相應(yīng)地特異性擴(kuò)增出 大小約為784bp的條帶，送生物公司測(cè)序； 4) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，若目標(biāo)基因序列與SEQIDNo.1的相似性在98%以上，即可判斷所述 的待測(cè)組織為亞棕裸蠓。
[0008]亞棕裸蠓的種類鑒定依靠形態(tài)學(xué)鑒定所實(shí)現(xiàn)，并經(jīng)權(quán)威專家復(fù)核，從而保證了結(jié) 果的可靠性。
[0009] 所述引物根據(jù)文獻(xiàn)合成，正向引物5'CCTGAGAAACGGCTACCACATC3'，反向引物5' GTTTCAGCTTTGCAACCAT3'。
[0010] 本發(fā)明可用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為： 1)本發(fā)明采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子分類方法相結(jié)合，對(duì)所述裸蠓進(jìn)行鑒定，可確 保物種鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0012] 2)與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明建立的亞棕裸蠓分子鑒定方法可有效縮 短亞棕裸蠓的鑒定時(shí)間。
【附圖說明】
[0013]圖1為亞棕裸蠓18SrDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號(hào)說明如下：泳道1-2為 亞棕裸蠓雌蟲的18SrDNA基因，檢出大小約為784bp的條帶。Μ為DL2000的DNAmarker。 [00M]圖2為未知裸蠓雌蟲18SrDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號(hào)說明如下：泳道1 為未知裸蠓雌蟲的18SrDNA基因，檢出大小約為784bp的條帶。Μ為DL2000的DNAmarker。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1亞棕裸螺(Atrichopogonsubfusculus)18SrDNA基因序列的獲取 1、亞棕裸蠓標(biāo)本的獲取 亞棕裸蠓為野外采集獲得的標(biāo)本，經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。標(biāo)本制成玻片 后經(jīng)權(quán)威專家鑒定，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)本制作前，挑取亞棕裸蠓胸部末端和腹部前 幾節(jié)置于95%酒精中，供DNA提取。
[0016] 2、DNA模板制備 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法提取亞棕裸蠓DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法 與技術(shù)導(dǎo)論[M].北京:科學(xué)出版社，2010.pp278-286)，提取的DNA樣品保存于-20°C備用。
[0017] 3、引物合成 本實(shí)施例所用引物如下： 正向引物 5'CCTGAGAAACGGCTACCACATC3' 反向引物 5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT3'。
[0018] 4、PCR擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表1所示。
[0019]表1亞棕裸蠓18SrDNA基因PCR反應(yīng)體系（50uL體系）
本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表2所示。
[0020] 表2亞棕裸蠓18SrDNA基因PCR反應(yīng)程序
PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 取5yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35min)。溴乙錠染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測(cè)，電泳圖譜參見附圖1。
[0022] 6、基因序列測(cè)定 選取3-5個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由生物公司純化后測(cè)序(測(cè)序所用引物與PCR所 用引物相同），所得基因序列經(jīng)校正拼接后即為亞棕裸蠓的18SrDNA基因序列一SEQID Νο·1〇
[0023] 實(shí)施例2未知裸蠓的鑒定 1、標(biāo)本的采集與保存 采用揮網(wǎng)法或燈誘法進(jìn)行采集，采獲的標(biāo)本經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。
[0024] 2、DNA模板制備 在解剖鏡或體視顯微鏡下，從采集到的蠓類標(biāo)本中隨機(jī)挑出一只雌性裸蠓，采用小型 昆蟲微量DNA模板制備方法提取裸蠓DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法與技術(shù)導(dǎo)論[M]. 北京:科學(xué)出版社，2010.pp278-286)，提取的DNA樣品于-20°C保存?zhèn)溆?，每份?biāo)本一個(gè)編 號(hào)。
[0025] 3、目的基因序列的獲取 3.1引物合成 以獲得的未知裸蠓DNA為模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'CCTGAGAAACGGCTACCACATC3' 反向引物 5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT3'。
[0026] 3.2PCR擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表3所示。
[0027]表3未知裸蠓18SrDNA基因PCR反應(yīng)體系（50uL體系）
本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表4所示。
[0028] 表4未知裸蠓18SrDNA基因PCR反應(yīng)程序

PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與基因序列測(cè)定 取5yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35min)。溴化乙錠染色。凝 膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，電泳圖譜參見附圖2。由附圖2看出實(shí)施例2的未知裸蠓也能特異性擴(kuò)增出 大小約為784bp的產(chǎn)物，將大小約為784bp的產(chǎn)物送生物公司測(cè)序，結(jié)果顯示與基因序 列SEQIDNO. 1的相似性為99.9%，因而可判定該未知裸蠓為亞棕裸蠓。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種亞棕裸蠓特異基因，其特征在于，所述基因?yàn)?8S rDNA基因，為如下所述的基因 序列SEQ ID No.l:2. 權(quán)利要求1所述的裸蠓的18S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分別為： 正向引物 5'CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3' 反向引物 5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT 3'。3. -種亞棕裸蠓的分子鑒定方法，包括： 1)從待測(cè)的昆蟲組織中分離提取DNA; 2 )以該D N A為模板，對(duì)I 8 S r D N A基因采用的引物為：正向引物5 ' CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3'，反向引物5'GTTTCAGCTTTGCAACCAT 3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 擴(kuò)增出亞棕裸蠓18S rDNA基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的18S rDNA基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng) 溴乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出大小 約為784 bp的條帶，送生物公司測(cè)序； 4) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果相應(yīng)18S rDNA基因序列與SEQ ID No.l的相似性在98%以上，即 可判斷所述的待測(cè)組織為亞棕裸蠓。
【專利摘要】本發(fā)明公開<b>一種亞棕裸蠓的特異基因及其分子鑒定方法，</b>其特征在于采用分子生物學(xué)方法獲取該裸蠓的18S？rDNA基因序列，通過基因序列相似性的比對(duì)，對(duì)該裸蠓進(jìn)行種類鑒定。本發(fā)明提供的亞棕裸蠓分子鑒定方法，有利于實(shí)現(xiàn)亞棕裸蠓準(zhǔn)確、快速的鑒定。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105420399
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610012039
【發(fā)明人】楊美瓊, 黃恩炯, 王宇平, 高博, 張建慶, 王飛鵬
【申請(qǐng)人】福建國際旅行衛(wèi)生保健中心
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2016年1月8日