一種海洋細菌耐藥基因檢測芯片及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種海洋細菌耐藥基因檢測芯片及其應 用。
【背景技術】
[0002] 中國是世界上最大的海產(chǎn)品生產(chǎn)和消費國，每年的養(yǎng)殖海產(chǎn)產(chǎn)量達155萬噸，占 全球養(yǎng)殖產(chǎn)量的80%。但隨著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，海水養(yǎng)殖動物經(jīng)常遭受到一些傳染病 的危害，其中細菌是引起養(yǎng)殖動物病害發(fā)生的主要因素之一。從抗生素應用開始，人們傾向 于利用抗生素類藥物預防或治療細菌性傳染病，但有研究證明由于大部分的抗生素很難為 動物吸收利用，大約有30-75%的抗生素以母體化合物形式隨糞尿排出體外。因此直接加到 水體用于治療或預防病害的、未被水產(chǎn)養(yǎng)殖生物吸收的，和隨糞便排泄的抗生素可能聚積 于水體及底泥沉積物中造成污染。另外，近海養(yǎng)殖環(huán)境靠近陸地，工業(yè)、城市生活廢水中的 殘留抗生素也直接流入養(yǎng)殖水體或經(jīng)地下水間接污染養(yǎng)殖水域。在陸源污染和近海水產(chǎn)養(yǎng) 殖大量施用抗生素的雙重壓力下，近海水環(huán)境容載了目前人類發(fā)現(xiàn)的所有抗生素。由于抗 生素的廣泛和不合理使用，近海海洋環(huán)境中的耐藥菌變得司空見慣，多重耐藥菌也不斷被 發(fā)現(xiàn)。這些抗生素耐藥菌通常攜帶有一種或多種抗生素耐藥基因，耐藥基因也可以從非致 病性細菌轉移到病原菌中或隨著食物鏈的傳遞轉移到人或其他動物體內(nèi)。作為一個生態(tài)和 環(huán)境問題，這些海水養(yǎng)殖環(huán)境中的耐藥菌及其攜帶的耐藥基因構成的抗生素耐藥基因庫， 不僅會直接對海水養(yǎng)殖動物和人類生命健康造成危害，而且對海洋生態(tài)環(huán)境平衡也存在威 脅。環(huán)境中耐藥菌作為潛在的耐藥基因庫也在近年來被人們加以重視和研究。
[0003] 在目前發(fā)現(xiàn)的抗生素中，四環(huán)素類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氟苯尼考類 抗生素藥物均被水產(chǎn)為養(yǎng)殖允許使用且使用量較多的抗生素藥物，海水環(huán)境中也存在相當 數(shù)量的針對這5類抗生素藥物的耐藥菌。這些耐藥菌通常攜帶有一種或多種具有相同或 不同耐藥機制的耐藥基因，例如介導藥物革G位點改變機制基因dfrAl、dfrA12、sull、sul2， 介導抗生素外排機制基因cmlel、cmle3、tetA、tetB、tetC、tetG，介導藥物革E位點保護機制 基因tetM、tetS、qnrA、qnrS，介導藥物活性位點失活的耐藥基因catal、cata2、bla-TEM、 bla-SHV、bla-V頂?shù)?。目前，研究者已開始針對這些問題開展了一系列的研究以監(jiān)測環(huán)境中 耐藥菌和耐藥基因、揭示可以介導耐藥基因轉移的可移動片段的分子結構及功能機制。但 是這其中的大部分研究只關注感染人類的耐藥性病原菌及其耐藥基因，對于養(yǎng)殖業(yè)中抗生 素耐藥菌及耐藥基因的研究大多側重于畜禽類及淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中針對于一種或多種 抗生素藥物的耐藥基因的定性和定量檢出，而針對于海水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥菌及耐藥基 因的研究較少。由于海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中細菌種群結構以及養(yǎng)殖過程中藥物使用習慣有別 于畜禽類及淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖，相關研究并不能反映海水養(yǎng)殖環(huán)境耐藥基因分布狀況。目前對 海水養(yǎng)殖區(qū)抗性菌及耐藥基因的研究方面，Jun等在韓國海水養(yǎng)殖區(qū)檢測到多種tet基因， Dalsgaard等在泰國海水養(yǎng)殖區(qū)檢測到氨基糖苷、β-內(nèi)酰胺磺胺類及四環(huán)素類耐藥基因。 但在中國北方部分海域養(yǎng)殖區(qū)僅有檢測到cat I，II，III，IV基因和tetA，B，D，E，Μ基因的 報道，如山東膠州灣區(qū)域分離菌中定性檢測到tet、cat、floR基因，而其他海水養(yǎng)殖區(qū)采樣 點并無其他研究。此外相關研究中細菌耐藥性檢測主要使用藥敏試驗，其優(yōu)點在于方便、簡 捷、易判定，但只能對少量樣品進行一對一檢測分析。由于環(huán)境中可分離培養(yǎng)細菌僅占環(huán)境 細菌的1-5%左右，藥敏實驗無法反映出細菌耐藥的來源和傳播機制。對于環(huán)境中抗生素耐 藥基因檢測的方法還有質(zhì)粒圖譜、PCR-單鏈構象多態(tài)性、質(zhì)粒指紋圖譜、PCR及PCR-限制性 片段長度多態(tài)性、核酸探針檢測、DNA序列測定等，這些研究方法，彌補了藥敏試驗的不足， 但這些技術往往只限制于單一耐藥基因的的檢測，要對細菌眾多的耐藥基因進行檢測需要 做大量的工作，甚至難以實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種海洋細菌耐藥基因檢測芯片，可對海水環(huán)境細菌中針對5 大類抗生素的32種耐藥基因進行高通量快速檢測，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0005] 本發(fā)明所提供的檢測芯片，其特征在于，是在芯片載體上固定有用于檢測海洋細 菌耐藥基因的探針；所述的耐藥基因包含有四環(huán)素類耐藥基因、磺胺類耐藥基因、氨基糖苷 類耐藥基因、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因、氯霉素類耐藥基因；
[0006] 其中用于檢測氨基糖苷類耐藥基因的探針，其核苷酸序列為SEQIDΝ0:1-6中的 任一種或幾種；
[0007] 用于檢測四環(huán)素類耐藥基因的探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:7-14中的任一種 或幾種；
[0008] 用于檢測磺胺類耐藥基因的探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:15-18中的任一種 或幾種；
[0009] 用于檢測β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:19-25中的 任一種或幾種；
[0010] 用于檢測氯霉素類耐藥基因的探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:26-32中的任一 種或幾種；
[0011] 上述探針的Y末端進行了氨基修飾；
[0012] 作為優(yōu)選，上述的芯片上還固定有空白和陽性對照，其中陽性對照為5'端進行 cy3 標記的TTGGATTAGGTATAACAAAAGGACCAGCGGATTCTCCACCTATATCTATA，
[0013] 上述的芯片載體為醛基芯片載體。
[0014] 本發(fā)明還提供用于擴增核苷酸片段的引物對，引物對擴增的產(chǎn)物用上述芯片進行 檢測；其中引物對的信息如下：
[0015] 表1:引物名稱、引物序列、擴增片段大小、褪火溫度的信息
[0016]


[0019] 本發(fā)明的芯片用于檢測攜帶有抗生素耐藥基因的海水細菌；其方法包括如下的步 驟：
[0020] 1)利用引物對待測樣本DNA中的耐藥基因進行PCR擴增；
[0021] 2)將步驟1)的產(chǎn)物進行熒光標記反應；
[0022] 3)將步驟2)的產(chǎn)物與海洋細菌耐藥基因檢測芯片進行雜交反應，確定樣本所含 的耐藥基因。
[0023] 本發(fā)明的海洋細菌耐藥基因檢測芯片是在調(diào)查了解海水養(yǎng)殖區(qū)抗生素耐藥菌耐 藥類型和耐藥基因分布及豐度信息的基礎上設計的，涵蓋了海水養(yǎng)殖區(qū)常見針對大類抗生 素的32種耐藥基因，且檢測速度快，靈敏度和特異性高，該發(fā)明對海水養(yǎng)殖環(huán)境細菌包括 病原菌耐藥譜和耐藥基因攜帶情況的快速檢測具有顯著的實用價值，也為了解和防治海洋 環(huán)境中耐藥細菌提供科學理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :芯片微陣列a上探針與檢測水樣標記樣本雜交結果掃描圖；
[0025]圖2:芯片微陣列b上探針與檢測水樣標記樣本雜交結果掃描圖；
[0026]圖3 :芯片微陣列a上探針與水樣標記樣本雜交結果掃描圖；
[0027]圖4:芯片微陣列b上探針與水樣標記樣本雜交結果掃描圖。
【具體實施方式】
[0028] 申請人篩選得到常見的耐藥及相關基因66個，針對于每個耐藥基因的核酸序列 保守區(qū)設計特異性引物2-3對。用PCR方法對從近海養(yǎng)殖區(qū)采集的35個水樣進行常見66 種耐藥基因的擴增檢測。PCR產(chǎn)物通過1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后的PCR產(chǎn)物制備 單克隆轉化菌后送生物公司（生工生物工程（上海）股份有限公司）測序。測序結果表明 有32種耐藥基因可從環(huán)境水樣中獲得擴增，另外34種耐藥基因未發(fā)現(xiàn)存在于環(huán)境海水樣 中。32種獲得正確基因片段的耐藥基因其基因名稱、引物名稱、上下游引物序列、擴增片段 大小、褪火溫度如表1所示：
[0029] 以下通過【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0030] 實施例1.探針的設計和篩選
[0031] 四環(huán)素類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氟苯尼考類抗生素藥物均為被水產(chǎn) 養(yǎng)殖允許使用且使用量較多的抗生素藥物，針對這5類抗生素藥物的耐藥菌通常攜帶有一 種或多種具有相同或不同耐藥機制的耐藥基因。針對于常見的耐藥及相關基因的核酸序列 保守區(qū)設計特異性引物2-3對。用PCR方法對從近海養(yǎng)殖區(qū)采集的35個水樣進行常見66 種耐藥基因的擴增檢測。PCR產(chǎn)物通過1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后的PCR產(chǎn)物制備 單克隆轉化菌后送生物公司（生工生物工程（上海）股份有限公司）測序。測序結果表明 有32種耐藥基因可從環(huán)境水樣中獲得擴增，另外34種耐藥基因未發(fā)現(xiàn)存在于環(huán)境海水樣 中。
[0032] 1)探針設計：針對32種獲得正確基因片段的耐藥基因，使用AllelelD7. 0軟件 設計探針序列，探針要求設計在高可變區(qū)、長度在30-50mer左右、解鏈溫度（Tm)在60°C左 右、GC含量為40% -60%、在5'端使用氨基修飾。使用NCBI在線BLAST工具檢測所設計 探針的特異性，以避免非特異性雜交。引物和探針均交由上海生工生物工程股份有限公司 合成。
[0033] 2)探針點制：商業(yè)合成的寡核苷酸探針稀釋至適當濃度：用1XTE緩沖液將合成 的探針稀釋至終濃度為l〇〇ng/ μL，將用1X TE緩沖液稀釋的終濃度為100ng/μL的探針與 點樣液等體積混合，使其終濃度達到50ng/μL，點制于醛基芯片載體上。點樣環(huán)境條件為 室溫20°C，濕度60%-70%。在點制之后需要在37°C濕盒內(nèi)水合雜交12-18小時。水合后 使用雙蒸水清洗3次，每次2分鐘，洗脫去未連接的、連接不緊密的探針。使用0. 2% NaBH4 封閉：使芯片完全浸沒，靜置5分鐘后，150rpm震蕩5分鐘，再靜置5分鐘；最后用雙蒸水清 洗3次，每次2分鐘。離心去除芯片表面水跡，離心參數(shù)：2000rpm，2分鐘。
[0034] 3)探針的篩選：取每個探針對應的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將產(chǎn)物純化后 進行熒光標記。將雜交液與熒光標記產(chǎn)物按照1:1的比例混合，加入10μΜ陽性質(zhì)控1μL， 95°C變性3min，置于冰上冷激3min。在篩選芯片的點樣區(qū)加入雜交混合液，置于60°C濕盒 中雜交 2h。使用洗液I(1XSSC、0. 2%SDS)、II(0· 2XSSC)、