一種鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物及方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 普通菜豆，又稱有四季豆、蕓豆等，學(xué)名Phaseolus vulgaris L.，英文名為common bean。普通菜豆染色體2n = 22,屬于豆科（Leguminosae)，蝶形花亞科（Papilionoideae)， 菜豆族（Phaseoleae)，菜豆屬（Phaseolus)，菜豆種（Phaseolus vulgaris L.)(鄭卓杰， 1995)。普通菜豆是7000-8000年前從位于高原地帶的中美洲和安第斯山的野生類型進(jìn) 化而來(lái)（Gepts和Debouck，1991)，它的訓(xùn)化分別從安第斯和中美洲兩個(gè)起源中心開(kāi)始，因 此也就形成了現(xiàn)在的兩大基因庫(kù)即安第斯基因庫(kù)（Andean gene pool)和中美洲基因庫(kù) (Middle American gene pool)。這兩大基因庫(kù)的材料在植株高度、籽粒大小、單株產(chǎn)量、抗 逆性方面存在顯著差異。由于起源不同，兩大基因庫(kù)材料之間進(jìn)化形成了各自顯著的特征， 中美洲基因庫(kù)由其特征是種子為中小型（百粒重為25~40g)，表皮有花斑、粉色、白色和黑 色，部分莢用菜豆（snap bean)來(lái)源于該基因庫(kù)；安第斯基因庫(kù)其特征是種子比較大（百粒 重大于40g)，以腎形為主，大部分莢用菜豆來(lái)源于該基因庫(kù)（Broughton等，2003 !McClean 等，2004 ;Vanderborght，1982)。作物雜交育種是選育新品種的主要手段，兩個(gè)親本的遺傳 互補(bǔ)性越強(qiáng)，獲得的優(yōu)良雜交品種的幾率越高。因此，開(kāi)始進(jìn)行普通菜豆雜交育種前首先需 要弄清楚親本的遺傳背景和起源。普通菜豆是人類主要的食用豆類作物，占全球食用豆類 總產(chǎn)量的50%，是人類植物蛋白的主要來(lái)源之一。選擇遺傳背景差異大的親本進(jìn)行雜交，選 育新育種是改良現(xiàn)有普通菜豆品種的有效手段。因此，區(qū)分不同普通菜豆材料的遺傳背景 和起源是選育優(yōu)良親本的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
[0003] 區(qū)分不同種質(zhì)資源遺傳背景的方法主要有兩個(gè)，一是根據(jù)形態(tài)標(biāo)記，如株高、葉 形、籽粒大小、籽粒顏色等。形態(tài)標(biāo)記具有易于觀察，技術(shù)難度小的優(yōu)點(diǎn)，但是該標(biāo)記受外界 環(huán)境如氣溫、日照長(zhǎng)短、土壤、播種期等影響大，異變易，穩(wěn)定性差，判斷基因型錯(cuò)誤率高，需 要有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)才能有較準(zhǔn)確的結(jié)果。二是DNA分子標(biāo)記，是一種基于基因組差異的 標(biāo)記類型，其多態(tài)性類型與作物的遺傳背景密切相關(guān)，具有相同遺傳背景的材料具有相同 的標(biāo)記類型，因此應(yīng)用分子標(biāo)記可以很好的鑒定作物的遺傳背景，是作物育種很好的輔助 選擇工具。常用的分子標(biāo)記包括SSR、RFLP、AFLP、RAH)和SNP等標(biāo)記類型。其中SSR、RFLP、 AFLP和RAH)標(biāo)記的多態(tài)性不如SNP標(biāo)記。另外，RFLP、AFLP和RAH)標(biāo)記在應(yīng)用中需要大 量的酶切實(shí)驗(yàn)和PCR反應(yīng)，存在技術(shù)難度高、工作程序復(fù)雜，工作量大的問(wèn)題。SSR標(biāo)記在應(yīng) 用中需要很多個(gè)SSR標(biāo)記同時(shí)使用才能判斷一個(gè)材料的基因型，需要做大量的PCR反應(yīng)，存 在工作量大的問(wèn)題。SNP標(biāo)記雖然多態(tài)性高，但遺傳穩(wěn)定性差，且應(yīng)用過(guò)程中需要進(jìn)行大量 的測(cè)序反應(yīng)，成本高，一般的研究者很少使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物及方法，旨在解決在應(yīng) 用其他標(biāo)記61?、1^1^、4?1^、狀1^和5即）對(duì)普通菜豆起源進(jìn)行鑒定中存在的技術(shù)難度高、 工作程序復(fù)雜、成本高和穩(wěn)定性差的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物，所述鑒定普通菜豆種 質(zhì)起源的引物命名為Pv97包括：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ;
[0006] 引物序列 SEQ ID NO :1 :Pv-F :5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC 3' ；
[0007] 引物序列 SEQ ID NO :2Pv-R :5' TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC 3'。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的方法，所述鑒定普通菜 豆種質(zhì)起源的方法包括：
[0009] 模板基因組DNA提取與稀釋；
[0010] 引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的合成與稀釋，純化方式選用PAGE，將引物用 無(wú)菌的雙蒸水PH8. 0溶解并稀釋至5 μ M ;
[0011] PCR儀的選擇與擴(kuò)增；
[0012] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；
[0013] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，將電泳后的凝膠放在凝膠成像儀的紫外燈下觀察，PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物會(huì)出現(xiàn)800bp或900bp的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物為800bp對(duì)應(yīng)的種質(zhì)屬于安第斯基因庫(kù)，擴(kuò)增產(chǎn) 物為900bp對(duì)應(yīng)的種質(zhì)屬于中美洲基因庫(kù)。
[0014] 進(jìn)一步，所述模板基因組DNA提取與稀釋具體包括：
[0015] 將無(wú)病蟲(chóng)害的欲被檢測(cè)普通菜豆種子用無(wú)菌水浸沒(méi)吸脹12小時(shí)；
[0016] 取吸脹的種子剝?nèi)シN皮和子葉，取三片小的三出復(fù)葉于2mL尚心管內(nèi)，加入50 μ 1 提取緩沖液研磨至糊狀，緩沖液包含IOOmM Tris-Hcl pH = 8. 0, IM KCl，IOmM EDTA ;
[0017] 95 °C -100 °C 煮沸 10 分鐘；
[0018] 冰上冷卻2分鐘；
[0019] 用100 μ 1去離子水稀釋后1000 Orpm離心3-5分鐘；
[0020] 取上清液做模板。
[0021] 進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)體系：總體積20 μ 1，包括10XPCR buffer 2. 5 μ 1， MgCl2 (25mM) I. 4 μ I，dNTP mix (IOmM each) 0· 4 μ I，Pv-F (5 μ Μ) 1 μ I，Pv-R (5 μ Μ) 1 μ I，DNA template(40ng/mL) 2 μ 1，Taq DNA Polymerase(5U/μ 1)0. 2 μ 1，ddH20 11.5 μ1〇
[0022] 進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3min后，94°C變性30s，55.5°C退火50s， 72°C延伸I. 5min，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。
[0023] 進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳具體方法如下：
[0024] 配置lXTBE緩沖液：54gTris，27·5g硼酸，4·6gEDTANa2溶于去離子水中，定容至 5L ；
[0025] 制備瓊脂糖凝膠：用IXTBE緩沖液配0. 8%瓊脂糖凝膠，將熔化瓊脂糖凝膠溶液 倒入電泳支架上，放上梳子，梳子須離開(kāi)電泳支架底部1mm，待凝膠凝聚后，拔去梳子，將支 架放入裝有I X TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應(yīng)淹沒(méi)過(guò)膠；
[0026] 加樣：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品5 μ L，滴加1 μ L上樣緩沖液（混勻，緩沖液含IOmM Tris-Cl pH 7. 6?0. 03% bromophenol blue?0. 03% xylene cyanol?60% glycerol?60mM H)TA;用微量移液器加入樣品槽中，并將3 yL 500bp DNA Ladder加入相鄰的點(diǎn)樣孔；
[0027] 電泳：凝膠點(diǎn)樣端朝負(fù)極，通電，維持電壓為lOv/cm至溴酚藍(lán)移到距邊Icm處，取 出凝膠。
[0028] 進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取5ylPCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，滴加1 μ 1上樣緩沖液，混勻，用微量移液器加入樣品槽中，點(diǎn)樣端朝負(fù)極，通電，電 壓為ΙΟν/cm，待溴酚藍(lán)移到距凝膠邊Icm處，取出凝膠，紫外燈下檢測(cè)。
[0029] 本發(fā)明提供的鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物及方法，具有操作簡(jiǎn)單（只需要一次 PCR反應(yīng)即可完成）、成本低（不需要大量的測(cè)序和酶切反應(yīng)）、標(biāo)記穩(wěn)定項(xiàng)強(qiáng)、正確率高的 特點(diǎn)，可以很方便的鑒定出該材料的基因庫(kù)類型。分別用本發(fā)明的標(biāo)記和30對(duì)SSR標(biāo)記對(duì) 221份普通菜豆材料（78份屬于安第斯基因庫(kù)，143份屬于中美洲基因庫(kù)）進(jìn)行分類；結(jié)果 顯示，該標(biāo)記的分類結(jié)果正確率為97. 2%，SSR的分類結(jié)果的正確率為91. 8%。本發(fā)明的 引物對(duì)組成的分子標(biāo)記屬于單基因插入缺失（InDel)標(biāo)記，具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，不易變異 的特點(diǎn)，且在使用中容易觀察，不同起源的材料具有明顯的標(biāo)記類型。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0032] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0033] 本發(fā)明的鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的引物包括：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
[0034] 引物序列 SEQ ID NO :1 :Pv-F :5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC 3' ；
[0035] 引物序列 SEQ ID NO :2Pv-R :5' TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC 3'。
[0036] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的鑒定普通菜豆種質(zhì)起源的方法包括以下步驟：
[0037] SlOl :模板基因組DNA提取與稀釋：（1)將無(wú)病蟲(chóng)害的欲被檢測(cè)普通菜豆種子用無(wú) 菌水浸沒(méi)吸脹12小時(shí)；（2)取吸脹的種子剝?nèi)シN皮和子葉，取三片小的三出復(fù)葉（約Ig) 于2mL離心管內(nèi)，加入50 μ 1提取緩沖液（包含IOOmM Tris-Hcl pH = 8. 0, IM KCl，IOmM EDTA)研磨至糊狀；（3) 95°C -100°C煮沸10分鐘；(4)快速冰上冷卻2分鐘；（5)用100 μ 1 去離子水稀釋后1000 Orpm離心3-5分鐘；(6)取上清液做模板；
[0038] S102 :引物（SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)的合成與稀釋：由核酸合成公司完成， 純化方式選用PAGE，并按照引物合成清單說(shuō)明將引物用無(wú)菌的雙蒸水（pH8.0)溶解并稀釋 至 5 μ M ;
[0039] S103 :PCR儀的選擇與擴(kuò)增程序設(shè)定：PCR儀選用PTC-100或PTC-225(MJ公司），按 照PCR儀使用說(shuō)明設(shè)定PCR反應(yīng)程序（94