芝味甚苦，根源是靈芝酸A、赤芝酸A。赤芝酸有纟、8、(：、04、？等。
[0024] 所謂標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A的行業(yè)配制方法：精密稱定靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度制成質(zhì)量濃度為〇. 5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液母液，分別量取1 mL靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)溶液母液于5、10、25、50和100 mL容量瓶中，加入甲醇混合并定容至刻度， 配制成質(zhì)量濃度為〇. 〇l、〇. 02、0. 05、0. 1、0. 5 mg/mL的靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0025] 標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸C、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸C2、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸E、標(biāo)準(zhǔn)品赤芝酸A、百里酸標(biāo)準(zhǔn) 溶液、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液同上述"標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A"配制方法。
[0026] 實施方式一 (1)將靈芝菌株接種至PDA斜面25°C活化培養(yǎng)7天作為瓊脂培養(yǎng)基菌種；取5粒黃豆 粒大小的瓊脂培養(yǎng)基菌種加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)5 天作為種子；取8mL種子加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)7天 作為發(fā)酵液； PDA斜面，為PDA培養(yǎng)基制成的一種常用的培養(yǎng)基斜面，宜培養(yǎng)酵母菌、霉菌、蘑菇等真 菌。
[0027] (2)取發(fā)酵液40mL裝于50mL離心管進(jìn)行4500r/min離心10min，除去上清，將沉 淀的菌絲用去離子水洗去培養(yǎng)基，將菌絲進(jìn)行離心收集，重復(fù)一次菌絲用去離子水洗及離 心收集的過程；將收集好的菌絲放置在恒重的稱量紙上，用60°C烘至恒重； (3)將烘干后的菌絲于研缽中研為粉末，將粉末進(jìn)行靈芝酸的提取制成菌絲靈芝酸提 取液；取靈芝子實體切片用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將粉碎后的靈芝子實體切片制成靈芝子 實體靈芝酸提取液； 菌絲靈芝酸提取液或靈芝子實體靈芝酸提取液的制作步驟如下： 稱取IOOmg菌絲或子實體粉末于3mL95%乙醇，室溫浸提3天，期間經(jīng)常振蕩，過濾收集 浸提液，濾渣再一次于3mL95%乙醇室溫浸提4天，期間經(jīng)常振蕩，過濾收集浸提液，將浸提 液合并。浸提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50°C旋蒸，移入5 mL去離子水充分洗滌收集，加入IOmL氯 仿充分混和抽提三萜成分；收集氯仿層，加入10mL5%NaHC03進(jìn)一步抽提三萜；收集NaHC03 層用2mol/L鹽酸調(diào)pH至3. 0以下，加入IOmL氯仿抽提靈芝酸；收集氯仿層40°C旋蒸去氯 仿，最后加入IOmL無水乙醇制成菌絲靈芝酸提取液或靈芝子實體靈芝酸提取液。
[0028] (4)將菌絲靈芝酸提取液稀釋1倍，和標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸C、標(biāo)準(zhǔn)品靈 芝酸C2、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸E、標(biāo)準(zhǔn)品赤芝酸A、百里酚標(biāo)準(zhǔn)溶液以及靈芝子實體靈芝酸提取液 分別進(jìn)行紫外可見光譜掃描，得到紫外可見光譜曲線圖； 請參考圖1，如圖1所示，A表示標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A ;C表示標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸C ;C2表示標(biāo)準(zhǔn) 品靈芝酸C2 ;E表示標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸E ;LA表示標(biāo)準(zhǔn)品赤芝酸A ;Th表示百里酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；MY 表示菌絲靈芝酸提取液；FB表示靈芝子實體靈芝酸提取液。靈芝酸A、靈芝酸C、靈芝酸C2、 靈芝酸E以及赤芝酸A紫外可見光譜峰形、峰強(qiáng)相似，形成1個波峰，254nm附近有最大吸 收波長；不同與前者，百里酚作為不同于靈芝酸的一類化學(xué)物質(zhì)，其形成2個尖峰，212nm和 276nm具有最大吸收波長，兩峰之間246nm為波谷，該波長常作為靈芝酸紫外吸收法檢測波 長。
[0029] 靈芝子實體靈芝酸提取液紫外可見光譜形成一寬峰，與對照品靈芝酸峰形較為相 似，顯示其主要成分為靈芝酸；不同于前者，靈芝發(fā)酵菌絲靈芝酸提取液紫外可見光譜與 不同靈芝酸以及子實體靈芝酸提取液紫外可見光譜具有明顯差異，其在靈芝酸弱吸收區(qū) (200~254 nm)有強(qiáng)烈吸收，可見該提取液中含有較高含量的非靈芝酸類成分。靈芝酸紫外 吸收法常以246nm作為檢測波長，此比較不同靈芝酸對照品該波長處的吸光度值。顯示靈 芝酸A、C、C2、E、赤芝酸A及百里酚吸光度值分別為0. 26、0. 44、0. 36、0. 31、0. 49和0. 15， 以百里酚最小，赤芝酸A最大，基于此，樣品靈芝酸紫外吸收法分析以靈芝酸A和百里酚作 為對照品，246nm為檢測波長。
[0030] (5)根據(jù)紫外可見光譜曲線圖，取標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A和百里酚標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照品，用 紫外吸收法分別計算菌絲靈芝酸提取液和靈芝子實體靈芝酸提取液中靈芝酸的含量。
[0031] 表1為不同樣品吸光度值以及根據(jù)靈芝酸A和百里酚標(biāo)準(zhǔn)曲線所計算靈芝酸含量 值，經(jīng)比較可知百里酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算值比靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線計算值高85. 7%。

[0032] 表1樣品靈芝酸紫外吸收法分析結(jié)果 在本實施方式中，在所述步驟（1)之前還包括： 將葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2P04 lg、MgS04 0.5g以及維生素 Bl 0.01 g加入1000 mL 去離子水中，用121°C滅菌20min制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0033] 在本實施方式中，步驟（2)中所述恒溫?fù)u瓶所用的搖瓶均為250mL搖瓶。
[0034] 在本實施方式中，步驟（4)中所述紫外可見光譜掃描的光程為Icm石英比色皿，紫 外可見光譜掃描的掃描范圍為200~700nm，紫外可見光譜掃描的采樣間隔2nm。
[0035] 在本實施方式中，以標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A和百里酚標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照品，紫外吸收 法顯不靈芝發(fā)酵菌絲靈芝酸含量分別為0. 7mg/100mg和I. 3mg/100mg，子實體分別為 2. lmg/100mg和4. 0mg/100mg。以百里酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為紫外吸收法對照品，靈芝酸含量分析值 顯著高于以靈芝酸A作為對照品的分析值。
[0036] 實施方式二 (1)將靈芝菌株接種至PDA斜面25°C活化培養(yǎng)7天作為瓊脂培養(yǎng)基菌種；取5粒黃豆 粒大小的瓊脂培養(yǎng)基菌種加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)5 天作為種子；取8mL種子加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)7天 作為發(fā)酵液； PDA斜面，為PDA培養(yǎng)基制成的一種常用的培養(yǎng)基斜面，宜培養(yǎng)酵母菌、霉菌、蘑菇等真 菌。
[0037] (2)取發(fā)酵液40mL裝于50mL離心管進(jìn)行4500r/min離心10min，除去上清，將沉 淀的菌絲用去離子水洗去培養(yǎng)基，將菌絲進(jìn)行離心收集，重復(fù)一次菌絲用去離子水洗及離 心收集的過程；將收集好的菌絲放置在恒重的稱量紙上，用60°C烘至恒重； (3)將烘干后的菌絲于研缽中研為粉末，將粉末進(jìn)行靈芝酸的提取制成菌絲靈芝酸提 取液；取靈芝子實體切片用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將粉碎后的靈芝子實體切片制成靈芝子 實體靈芝酸提取液； 菌絲靈芝酸提取液或靈芝子實體靈芝酸提取液的制作步驟如下： 稱取IOOmg菌絲或子實體粉末于3mL95%乙醇，室溫浸提3天，期間經(jīng)常振蕩，過濾收集 浸提液，濾渣再一次于3mL95%乙醇室溫浸提4天，期間經(jīng)常振蕩，過濾收集浸提液，將浸提 液合并。浸提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50°C旋蒸，移入5 mL去離子水充分洗滌收集，加入IOmL氯 仿充分混和抽提三萜成分；收集氯仿層，加入10mL5%NaHC03進(jìn)一步抽提三萜；收集NaHC03 層用2mol/L鹽酸調(diào)pH至3. 0以下，加入IOmL氯仿抽提靈芝酸；收集氯仿層40°C旋蒸去氯 仿，最后加入IOmL無水乙醇制成菌絲靈芝酸提取液或靈芝子實體靈芝酸提取液。
[0038] (4)將靈芝酸提取液和標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及 稀釋1倍的靈芝子實體靈芝酸提取液分別進(jìn)行紫外可見光譜掃描，得到紫外可見光譜曲線 圖； 請參考圖1，如圖2所示，UA :表示熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；OA表示齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;A表 示標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A ;MY表示菌絲靈芝酸提取液；F