測序基因分型技術(shù)中測序酶切組合的確定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，設(shè)及一種測序基因分型技術(shù)中測序酶切組合 的確定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 遺傳分子標(biāo)記（在一個(gè)或多個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體間可測量的可遺傳多態(tài)性）牢牢 地占據(jù)著現(xiàn)代遺傳學(xué)的核屯、地位，也是群體遺傳學(xué)，生態(tài)學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的重要研 究方向。目前主流的遺傳標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展至第Ξ代，即單核巧酸多態(tài)性（SingleNucleotide Polymo巧hisms，SNP)分子標(biāo)記。運(yùn)種遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)是單個(gè)堿基的置換，并且一般只有兩 種堿基組成，是一種二態(tài)的標(biāo)記，與第一代的RFLP及第二代的STRW長度的差異作為遺傳 標(biāo)記的特點(diǎn)截然不同。
[0003] 目前主流的全基因組SNP分型技術(shù)主要有基因分型忍片和二代測序兩種方法。基 因分型忍片的特點(diǎn)是技術(shù)穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)率高，但忍片技術(shù)分型一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的成本很高， 對于群體遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，群體分型的成本代價(jià)太大，并且忍片技術(shù)由于技術(shù)所限，還存在 著SNP多態(tài)位點(diǎn)在不同群體中通用差，標(biāo)記密度低（目前農(nóng)業(yè)動(dòng)物領(lǐng)域主流的SNP忍片密 度約為60000個(gè)SNP/忍片）等缺陷，不能滿足精細(xì)功能基因定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析等問 題。下一代測序技術(shù)的發(fā)展使得基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究能夠更加深入，測序能獲得全 基因組水平的高密度標(biāo)記圖譜，但同時(shí)也存在著單位樣本成本過高的缺點(diǎn)。
[0004] 簡化基因組測序技術(shù)（reduced-representationsequencing)使得群體分析研究 所需的覆蓋全基因組的高通量分子標(biāo)記的鑒定與分型成為可能。但不同的簡化基因組測序 方法在建庫策略、單酶切/雙酶切的組合選擇、測序平臺(tái)的選擇等方面均有較大差別，運(yùn)些 都會(huì)顯著影響后續(xù)分型的效率和成本。舉例來說，RAD測序的方法，建庫策略復(fù)雜，過多的 步驟會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；不同的限制性內(nèi)切酶在不同的物種基因組上酶切頻率和分布均 有較大不同，對于特定物種，選用哪種酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)就成為決定實(shí)驗(yàn)獲取SNP數(shù)量和成本的 決定因素；2b-RAD技術(shù)使用IIB型限制性內(nèi)切酶，2b-RAD技術(shù)雖然可W得到全基因組水平 的酶切片段，但運(yùn)種酶切的片段大小只有25-3化P，根據(jù)全基因組變異的平均頻率，過短的 酶切片段很難富含SNP位點(diǎn)，會(huì)帶來大量的測序數(shù)據(jù)損失；此外，短序列在面對基因組重復(fù) 區(qū)域比對的時(shí)候，會(huì)帶來大量的比對錯(cuò)誤，也會(huì)強(qiáng)烈干擾到SNP的分型準(zhǔn)確性，進(jìn)而嚴(yán)重干 擾下游應(yīng)用。當(dāng)進(jìn)行SNP標(biāo)記位點(diǎn)分析時(shí)，單酶切不利于后續(xù)試驗(yàn)中酶切片段的篩選，而部 分雙酶切組合存在著酶切片段過多或過少的缺點(diǎn)，酶切片段過多會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本，酶切片 段過少將降低SNP挖掘的密度，進(jìn)而影響后續(xù)生物學(xué)分析，還有的酶切組合會(huì)由于基因組 的甲基化影響酶切效率。綜上諸多原因，對任何需要研究的物種，酶切組合優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)是必 不可少的。
[0005] 因此有必要開發(fā)一種新的具有各物種通用的SNP標(biāo)記位點(diǎn)分析過程中酶切組合 的確定方法，從而在進(jìn)行SNP標(biāo)記位點(diǎn)分析時(shí)快速簡便的獲得最適的酶切組合，W降低基 因分型的成本，為基因分型后的下游應(yīng)用提供便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于測序基因分型技術(shù)的SNP 標(biāo)記位點(diǎn)分析過程中酶切組合的確定方法。
[0007] 為達(dá)到W上目的，本發(fā)明提供了一種測序基因分型技術(shù)中測序酶切組合的確定方 法，包括W下步驟：
[0008] (1)對目的基因組進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)預(yù)測，統(tǒng)計(jì)不同酶切方式獲得的酶 切片段數(shù)目；
[0009] (2)根據(jù)步驟（1)中所預(yù)測的各種酶切方式的酶切片段設(shè)計(jì)每種酶切片段兩端的 接頭序列及PCR擴(kuò)增引物序列；
[0010] (3)分別針對不同酶切方式利用GBS技術(shù)構(gòu)建測序文庫；
[0011] (4)利用步驟（3)構(gòu)建的測序文庫進(jìn)行測序；
[0012] (5)根據(jù)測序結(jié)果獲得SNP標(biāo)記位點(diǎn)；
[001引 （6)根據(jù)不同酶切組合所獲得的SNP標(biāo)記位點(diǎn)個(gè)數(shù)、酶切片段大小確定針對目的 基因組的特定酶切組合；
[0014] 其中，在步驟（1)中，對目的基因組的酶切位點(diǎn)預(yù)測包括單酶切預(yù)測和雙酶切預(yù) 測。
[0015] 在本發(fā)明中，酶切位點(diǎn)預(yù)測可W通過計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行，例如，在本發(fā)明的一種實(shí)施 方式中，編寫perl腳本Site_predict.pi如下，需要輸入的文件為?；蚪M的染色體名稱、 序列W及被預(yù)測酶的酶切位點(diǎn)序列。運(yùn)行命令為：pe;rlSite_predict.pl。牛的基因組序 列從化sembl上下載，版本號(hào)為：UMD3. 1，INSDCAssemblyGCA_000003055. 3，Nov2009。
[0016]
[0017]
[0018] 在獲得單個(gè)限制性酶切結(jié)果之后，可W根據(jù)需要對兩兩組合的限制性酶的模擬結(jié) 果進(jìn)行處理，W獲得兩種酶同時(shí)作用情況下的模擬結(jié)果。WEcoRI和MspI為例，命令如 下：
[0019] less-Secorl.posIawk，0FS= "\t" {p;rint$l, $2, "1"}，Iless_S〉ecor
[0020] less-Smspl.posIawk，OFS= "\t" {p;rint$l, $2, "2"}，Iless-S〉msp
[0021] catecormspIsort-kl,l-k2, 2nIless-S〉double_length_input
[0022] 可選的，步驟（1)中所述的酶切方式包括如表1所示的7種單酶切方式和8種雙 酶組合方式；
[0023] 表 1
[0024]
[00巧]可選的，步驟（2)中每種酶切片段的接頭序列包括一個(gè)通用接頭和一個(gè)條形碼接 頭。
[0026] 可選的，所述通用接頭是由2條通用接頭序列（通用接頭序列1和2)退火形成的 雙鏈DNA，其中通用接頭序列1經(jīng)過5'憐酸化修飾，所述條形碼接頭是由兩條條形碼接頭序 列（條形碼接頭序列1和2)退火形成的雙鏈DNA，其中條形碼接頭序列2經(jīng)過5'憐酸化修 飾。
[0027] 其中所述條形碼接頭序列1和2中包括長度為6-9bp的任意短核巧酸條形碼序 列。
[002引可選的，步驟似所述的PCR擴(kuò)增引物序列如SEQIDNO: 1-2所示。
[0029] 可選的，步驟（3)中包括W下步驟：
[0030] (a)利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切獲得酶切產(chǎn)物；
[0031 ] 化）制備通用接頭和條形碼接頭；
[0032] (C)分別將通用接頭和條形碼接頭與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得連接產(chǎn)物；
[0033] (d)將連接產(chǎn)物等比例進(jìn)行混池，獲得混池后的連接產(chǎn)物；
[0034] (e)在混池后的連接產(chǎn)物中加入1. 2-1. 4倍體積的磁珠進(jìn)行第一純化獲得第一純 化產(chǎn)物；
[0035] (f)在所述第一純化產(chǎn)物中加入0. 8-0. 9倍體積的磁珠進(jìn)行第二純化獲得第二純 化產(chǎn)物；
[0036] (g)對第二純化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物；
[0037] 化）在PCR產(chǎn)物中加入1. 2-1. 4倍體積的磁珠進(jìn)行第Ξ純化獲得第Ξ純化產(chǎn)物；
[0038] (i)在第Ξ純化產(chǎn)物中加入0. 8-0. 9倍體積的磁珠進(jìn)行第四純化獲得簡化基因組 測序文庫。
[0039] 可選的，所述第一純化和第Ξ純化的步驟相同，具體包括：加入磁珠后，在旋轉(zhuǎn) 儀上室溫解育18-22min獲得解育后體系；解育結(jié)束后放置在磁力架上，棄去上清，加入 480-520μL的70 %乙醇，靜置30-40S后緩慢旋轉(zhuǎn)，使磁珠在管壁上移動(dòng)，待溶液澄清后，去 除上清液，再重復(fù)此步驟一次獲得沉淀；再在所獲得的沉淀中加入LowΤΕ，用移液器上下吸 打后振蕩，離屯、后靜置澄清獲得上清液；其中，相對于100μL所述沉淀，LowTE的添加量為 140-160μL。
[0040] 可選的，第二純化和第四純化的步驟相同，具體包括：加入磁珠后，在旋轉(zhuǎn)儀上室 溫解育13-16min;解育結(jié)束后放置在磁力架上，棄去上清，加入480-520μL的70%乙醇，靜 置30-40S后緩慢旋轉(zhuǎn)，使磁珠在管壁上移動(dòng)，待溶液澄清后，去除上清液，重復(fù)此步驟一次 獲得沉淀；再在所獲得的沉淀中加入LowΤΕ，用移液器上下吸打后振蕩，離屯、后靜置澄清獲 得上清液；其中，相對于100μL所述沉淀，LowTE的添加量為30-50μL。
[0041] 可選的，步驟（C)中所述的通用接頭的退火體系為：100μΜ通用接頭序列15μL; 100μΜ通用接頭序列25μL，5XAnnealingBuffer10μL，無核酸酶水30μL;退火程序 為：加熱至95°C，并WrC/min的速度降溫至25°C，25°C保溫30min后于4°C保存。
[0042] 條形碼接頭的退火體系為：100μΜ條形碼接頭序列15μΙ;100μΜ條形碼接頭 序列25μL，5