響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物及膠束、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Η202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物及膠束、制備方法和應(yīng)用，所述熒光單分子共軛聚合物膠束可用于鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，與癌癥相關(guān)的分子成像在癌癥的診斷和治療中起到越來(lái)越重要的作用。h202作為細(xì)胞傳導(dǎo)的第二信使參與各種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。任何因環(huán)境壓力或基因突變引起的h202的異常產(chǎn)生和積累，都會(huì)導(dǎo)致一些疾病的產(chǎn)生，包括癌癥、老化、心血管疾病、阿茨海默癥、帕金森氏癥等疾病。倘若能對(duì)細(xì)胞內(nèi)h202檢測(cè)與成像，將對(duì)疾病診斷、預(yù)防和病理研究具有十分重要的意義。
[0003]為實(shí)現(xiàn)對(duì)H202檢測(cè)與成像，大量文獻(xiàn)報(bào)道了基于“熒光開(kāi)-關(guān)”型的小分子Η 202探針 dc.Chem.Res.2011, 44, 793-804 \B1sens.B1elec tron.2014, 56, 58-63 \ J.Am.Chem.Soc.2011，133, 10960-10965 -J.Am.Chem.Soc.2011，133, 10629-10637等)，然而，這種小分子“熒光開(kāi)-關(guān)”型H202探針往往會(huì)因?yàn)樘结槺旧韲?yán)重的光漂白性、高的濃度依賴性和設(shè)備因素(照明穩(wěn)定性)而引起數(shù)據(jù)失真，最終影響探針的靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]近年來(lái)，共軛聚合物由于熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好和“分子導(dǎo)線”的信號(hào)放大等優(yōu)點(diǎn)，使其迅速成為熒光傳感器領(lǐng)域的研究前沿，尤其是基于FRET效應(yīng)的含有熒光“供體-受體”單元的共軛聚合物，在FRET的效應(yīng)下，可以構(gòu)筑成為靈敏度高、選擇性強(qiáng)的“熒光比率”探針。因此，為了突破上述的傳統(tǒng)小分子“熒光開(kāi)-關(guān)”型H202探針的局限性，本發(fā)明構(gòu)建了一種基于共軛聚合物的“熒光比率”型H202探針，用于活細(xì)胞內(nèi)H 202成像與檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明提供一種H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物及其膠束，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)小分子“熒光開(kāi)-關(guān)”型H202探針因探針本身嚴(yán)重的光漂白性、高的濃度依賴性和設(shè)備因素(照明穩(wěn)定性)而引起的數(shù)據(jù)失真，最終影響探針靈敏度等技術(shù)性問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明還提供上述H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物的制備方法。
[0007]本發(fā)明還提供上述H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物的制備中間體及膠束。
[0008]本發(fā)明還提供上述H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物膠束在H 202檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)H202成像、腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的鑒別方面的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明之目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物，其包括疏水的超支化共軛聚合物核與親水的聚合物臂，所述的疏水的超支化共軛聚合物核與親水的聚合物臂之間通過(guò)H202響應(yīng)的硼酸酷鍵連接。
[0010]優(yōu)選地，所述疏水的超支化共軛聚合物核主要由FRET供體單體(如藍(lán)色熒光)、FRET受體單體(如綠色熒光)和支化單體制備得到。
[0011]優(yōu)選地，所述FRET供體單體為基于芴的含溴和/或硼酸基團(tuán)的雙官能團(tuán)的單體，所述FRET受體單體為基于2，1，3-苯并噻二唑的含溴和/或硼酸基團(tuán)的雙官能團(tuán)單體，所述支化單體為含三個(gè)或以上溴和/或硼酸基團(tuán)官能團(tuán)的單體。
[0012]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述FRET供體單體選自下列單體的一種或幾種:9，9- 二正己基_2，7- 二棚酸荷、9，9- 二正己基_2，7- 二漠荷、9，9- 二正辛基-2，7~ 二硼酸芴、正己基)-3,6-二硼酸咔唑、正辛基)-3,6-二硼酸咔唑、9，9-二正己基-2-溴-7-硼酸芴、9，9- 二正辛基-2-溴-7-硼酸芴、正己基)-3_溴_6_硼酸咔唑，或十(正辛基)-3-溴-6-硼酸咔唑等等，任何相關(guān)類似的單體都應(yīng)落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0013]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述FRET受體單體選自下列單體的一種或兩種:4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑或4-溴-7-硼酸-2，1，3-苯并噻二唑等等，任何相關(guān)類似的單體都應(yīng)落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0014]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述支化單體選自下列單體的一種或兩種:1，3，5_三溴苯或1-硼酸_3，5- 二溴苯等等，任何相關(guān)類似的單體都應(yīng)落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0015]優(yōu)選地，所述親水的聚合物臂包括親水的聚乙二醇。
[0016]所述H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物在水介質(zhì)中能夠自組裝形成單分子膠束，并且所述單分子膠束以進(jìn)一步組裝成熒光單分子共軛聚合物膠束，該熒光單分子共軛聚合物膠束在水介質(zhì)中能夠?qū)202特異性地響應(yīng)。
[0017]—種上述的H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物的制備方法，包括以下步驟:
(1)將FRET供體單體、FRET受體單體與支化單體在催化劑作用下進(jìn)行Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)，得到超支化共軛聚合物一；其中，盡量保證所有原料中的總溴和/或硼酸基團(tuán)官能團(tuán)等摩爾比；
優(yōu)選地，步驟(1)中所述FRET受體單體的摩爾投料比為:受體單體/ (供體單體+受體單體)=5% ;相對(duì)于2mmol的供體單體+受體單體，支化單體的投料量為0.1-0.5 mmol，優(yōu)選為 0.1 mmol η
[0018](2)繼續(xù)額外加入催化劑以及作為封端劑的含兩個(gè)硼酸基團(tuán)的供體單體，封端聚合物，得到端基為硼酸基團(tuán)的超支化共軛聚合物二；
優(yōu)選地，步驟(1)和(2)中的聚合反應(yīng)是Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)的油相是甲苯，水相是Na2C03溶液，催化劑為Pd (PPh 3) 4。
[0019]步驟(2)中額外加入的封端劑選自下列單體的一種或幾種:9，9_ 二正己基-2，7- 二硼酸芴、9，9- 二正辛基-2，7- 二硼酸芴或正己基)-3，6- 二硼酸咔唑；
(3)采用三元醇對(duì)超支化聚合物端基的硼酸進(jìn)行酯化，得到含硼酸酯鍵并有大量端羥基的超支化共軛聚合物三；三元醇對(duì)硼酸進(jìn)行酯化的反應(yīng)，采用官能團(tuán)等摩爾比反應(yīng)；
優(yōu)選地，三元醇可選自下列單體的一種或幾種:丙三醇、1，2，4- 丁三醇、1，2，5-戊三醇、1，2，6-己三醇、1，2，7-庚三醇和1，2，8-辛三醇等等，任何相關(guān)類似的三元醇都應(yīng)落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0020]優(yōu)選地，步驟(1)、(2)和(3)中的反應(yīng)溫度均為111_125°C，步驟(1)、(2)和(3)中的反應(yīng)時(shí)間分別為1至5天、1至3天和4小時(shí)至2天。[0021 ] 步驟(1)、( 2 )和(3 )中的反應(yīng)溶劑均為甲苯；步驟(2 )和(3 )的反應(yīng)產(chǎn)物使用有機(jī)溶劑進(jìn)行后處理，之后干燥；其中，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃、無(wú)水甲醇、正己烷和丙酮的一種或幾種；所述干燥過(guò)程使用的除水干燥劑為無(wú)水硫酸鎂。
[0022](4)將所述含大量端羥基的超支化共軛聚合物三在強(qiáng)堿存在下與聚乙二醇單甲醚對(duì)甲苯磺酸酯(PEG-OTs)反應(yīng)，得到含硼酸酯鍵的星狀共軛聚合物，即所述H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物。
[0023]優(yōu)選地，步驟(4)中所用的強(qiáng)堿為氫化鈉。步驟(4)中的反應(yīng)溫度為68至95°C，反應(yīng)時(shí)間為1至3天，反應(yīng)溶劑為四氫呋喃，PEG-OTs為分子量大于1000的聚乙二醇單甲醚對(duì)甲苯磺酸酯。反應(yīng)產(chǎn)物使用有機(jī)溶劑進(jìn)行后處理，有機(jī)溶劑選自正己烷、無(wú)水甲醇和乙醇的一種或幾種。
[0024]優(yōu)選地，將所述制備得到的含硼酸酯鍵的星狀共軛聚合物通過(guò)如下方法制備熒光單分子共軛聚合物膠束水溶液:將含硼酸酯鍵的星狀共軛聚合物溶解在有機(jī)溶劑中，在室溫下將其滴入超純水中并不斷攪拌進(jìn)行膠束組裝，除去有機(jī)溶劑，得到熒光單分子共軛聚合物膠束水溶液。優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃和-二甲基甲酰胺。優(yōu)選地，所述組裝的時(shí)間是0.5至12小時(shí)，組裝溫度是15至30°C。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述除去有機(jī)溶劑透析過(guò)程使用的透析袋的截留分子量為3500，透析水為超純水。
[0025]本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種上述的步驟(2)制備得到的超支化共軛聚合物二。
[0026]本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種上述的步驟(3)制備得到的超支化共軛聚合物三。
[0027]本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種上述制備得到的熒光單分子共軛聚合物膠束水溶液。
[0028]本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)上述的H202響應(yīng)的熒光單分子共軛聚合物及其膠束在H 202檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)H202成像、腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的鑒別方面的應(yīng)用。
[0029]特別地，所述的熒光單分子共軛聚合物膠束在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的鑒別方面的應(yīng)用為，所述的熒光單分子共軛聚合物膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的H202具有不同顏色的熒光成像。在一實(shí)施例中，所述的熒光單分子共軛聚合物的組裝膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示綠色熒光成像，而對(duì)正常細(xì)胞顯示藍(lán)色熒光成像。
[0030]所述的熒光單分子共軛聚合物膠束進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度H202環(huán)境下，熒光單分子共軛聚合物的親水的聚合物臂斷裂，疏水的超支化共軛聚合物核因失去聚合物臂的保護(hù)而聚集，引起超支化分子間與分子內(nèi)FRET顯著增強(qiáng)，并伴隨熒光從藍(lán)色到綠色的改變，以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞綠色熒光成像。
[0031]所述的熒光單分子共軛聚合物膠束利用腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞內(nèi)H202含量高的差異，特異性地僅對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)H202響應(yīng)并啟動(dòng)FRET效應(yīng)，呈現(xiàn)受體的綠色熒光；而對(duì)正常細(xì)胞內(nèi)低的H202含量沒(méi)有響應(yīng)，不能開(kāi)啟FRET效應(yīng)，只能呈現(xiàn)供體的藍(lán)色熒光。鑒于共軛聚合物膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)H202具有顏色不同的熒光成像，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)鑒別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的目的。
[0032]所述的腫瘤細(xì)胞可為宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中的一種。
[0033]本發(fā)明的H202響應(yīng)的“熒光比率”型單分子共軛聚合物膠束作為探針，具有以下優(yōu)勢(shì):
1、由于本發(fā)明“熒光比率”型H202探針優(yōu)異的光穩(wěn)定性，對(duì)探針濃度、環(huán)境及設(shè)備因素的無(wú)依賴性，可以有效地避免傳統(tǒng)小分子“熒光開(kāi)-關(guān)”型h202探針因探針本身嚴(yán)重的光漂白性、濃度依賴性和設(shè)備因素(照明穩(wěn)定性)而引起的數(shù)據(jù)失真和靈敏度低