了上述耐熱性β-木糖巧酶之外，還優(yōu)選含有半纖維素酶和內(nèi)切葡聚糖酶中的至少 一種糖巧水解酶的混合物，更加優(yōu)選含有半纖維素酶和內(nèi)切葡聚糖酶運(yùn)兩種糖巧水解酶的 混合物。其中，優(yōu)選含有選自由木聚糖酶、β-木糖巧酶、纖維二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶 構(gòu)成的組中的至少一種糖巧水解酶的混合物，更加優(yōu)選含有木聚糖酶、β-木糖巧酶、纖維 二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶全部運(yùn)些糖巧水解酶的混合物。
[01巧]上述糖巧水解酶混合物中含有的其他糖巧水解酶優(yōu)選為至少在85°C具有糖巧水 解酶活性的耐熱性糖巧水解酶，更加優(yōu)選為在70~90°C具有糖巧水解酶活性的耐熱性糖 巧水解酶。通過使上述糖巧水解酶混合物含有的全部酶為耐熱性的（例如酶活性的最適溫 度或酶蛋白的熱變性溫度為7(TCW上），能夠在高溫條件下高效進(jìn)行基于上述糖巧水解酶 混合物的木質(zhì)纖維素分解反應(yīng)。目P，上述糖巧水解酶混合物僅含有耐熱性糖巧水解酶時(shí)，通 過將上述糖巧水解酶混合物用于木質(zhì)纖維素糖化處理，使得可W在糖化溫度為70~9(TC 的高溫環(huán)境下進(jìn)行木質(zhì)纖維素水解反應(yīng)（高溫糖化：高溫水解）。通過此高溫糖化，可W顯 著減少酶量和糖化時(shí)間，大幅降低糖化成本（水解成本）。 陽126][木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法]
[0127] 本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法為包括利用本發(fā)明的耐熱性β-木糖 巧酶將由木聚糖酶水解半纖維素生成的低聚糖、或者由纖維二糖水解酶水解纖維素生成的 低聚糖水解為單糖，從而得到木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0128] 另外，此處所述"半纖維素分解產(chǎn)物"具體可列舉出葡萄糖及木糖等單糖。
[0129] 本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法的另一方面為，通過利用本發(fā)明的耐熱 性β-木糖巧酶對(duì)包含具有β-木糖巧鍵的低聚糖的材料進(jìn)行水解，從而制造包含上述低 聚糖的分解產(chǎn)物的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0130]本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法的又一方面為，通過利用本發(fā)明的耐熱 性β-木糖巧酶對(duì)包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料進(jìn)行水解，從而制造包含上述低 聚糖的分解產(chǎn)物的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。 陽131]另外，上述包含具有β-木糖巧鍵的低聚糖的材料可通過例如對(duì)包含半纖維素的 木質(zhì)纖維素進(jìn)行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料可通 過例如對(duì)包含纖維素的木質(zhì)纖維素進(jìn)行纖維二糖水解酶的水解而得到。
[0132]具體而言，本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法為，包括通過使木質(zhì)纖維素 所構(gòu)成的材料、具體為包含半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料與本發(fā)明的耐熱 性β-木糖巧酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、利用本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐 熱性β-木糖巧酶、或者本發(fā)明的糖巧水解酶混合物接觸，生產(chǎn)半纖維素或纖維素分解產(chǎn) 物的方法。 陽133]作為本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法的另一方面，具體為包括通過使包 含具有β-木糖巧鍵的低聚糖的材料與本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、利 用本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶、或者本發(fā)明的糖 巧水解酶混合物接觸，生產(chǎn)上述低聚糖的分解產(chǎn)物的方法。
[0134] 作為本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法的又一方面，具體為包括通過使包 含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料與本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、利 用本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶、或者本發(fā)明的糖 巧水解酶混合物接觸，生產(chǎn)上述低聚糖的分解產(chǎn)物的方法。
[0135] 上述包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料可通過對(duì)包含半纖維素的木質(zhì)纖維 素進(jìn)行木聚糖酶的水解來進(jìn)行調(diào)整。上述包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料可通過對(duì) 包含纖維素的木質(zhì)纖維素進(jìn)行纖維二糖水解酶的水解來進(jìn)行調(diào)整。 陽136]作為上述含有半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料，只要含有半纖維素 或纖維素即可，沒有特別的限制。作為該材料，例如可列舉雜草或農(nóng)業(yè)廢棄物等纖維素類生 物質(zhì)、或者廢紙等。優(yōu)選使上述材料與本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶接觸前，先進(jìn)行破碎或 切碎等物理處理、利用酸或堿等的化學(xué)處理、或者浸潰或溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中的處理等。
[0137]目Ρ，本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法還可W進(jìn)一步包括，使上述含有半 纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料與本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶接觸前，先進(jìn) 行物理處理、化學(xué)處理、或者浸潰或溶解處理。
[0138] 利用本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶進(jìn)行半纖維素的水解反應(yīng)的反應(yīng)條件只要是 使上述耐熱性β-木糖巧酶表現(xiàn)出纖維寡糖水解活性的條件即可。例如優(yōu)選在60~90°C、 P冊.0~9. 0的條件下進(jìn)行反應(yīng)，更加優(yōu)選在70~90°C、p冊.0~9. 0的條件下進(jìn)行反應(yīng)， 進(jìn)一步優(yōu)選在70~90°C、P冊.0~8. 5的條件下進(jìn)行反應(yīng)。上述水解反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可 考慮供水解的上述材料的種類、預(yù)處理方法、或者用量等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。例如進(jìn)行10分 鐘~100小時(shí)，在分解纖維素類生物質(zhì)的情況下，能夠W1~100小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行上述 水解反應(yīng)。
[0139] 在木質(zhì)纖維素的水解反應(yīng)中，除了本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶之外，優(yōu)選還同 時(shí)或者分別使用至少一種其他糖巧水解酶。作為上述其他糖巧水解酶，可W使用與上述糖 巧水解酶混合物中含有的糖巧水解酶一樣的糖巧水解酶，優(yōu)選的是，至少在85°C、優(yōu)選至少 在70~90°C具有糖巧水解酶活性的耐熱性糖巧水解酶。此外，上述木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的 制造方法的一個(gè)方面為使用本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、或者利用本 發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶，另一方面為使用上述 糖巧水解酶混合物。 陽140]實(shí)施例 陽141] 下面示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于W下實(shí)施 例。
[0142][實(shí)施例1]來自于溫泉±壤的新耐熱性β-木糖巧酶的克隆
[0143] <1〉來自于溫泉±壤的DNA提取與全基因組序列（WholeGenomeSequence,WG巧
[0144] W在70~90°C表現(xiàn)出活性的新耐熱性β-木糖巧酶的基因探索為目的，從中性~ 弱堿性溫泉采集上壤DNA，進(jìn)行構(gòu)成運(yùn)些±壤的微生物群的基因組DNA的堿基序列解碼。
[0145] 作為中性~弱堿性溫泉±壤樣本，從在野外有噴出高溫溫泉的日本國內(nèi)的3處的 5個(gè)地點(diǎn)（宏基因組DNA樣本Ν2、AR19、AR15、0J1和Η1)采集含有±壤、泥、生物墊的溫泉 水。運(yùn)些溫泉±壤樣本在采集溫度58~78°C、ρΗ7. 2~8的范圍內(nèi)。 陽146]使用DNA提取試劑盒（IS0ILLargeforBeadsver. 2,NIPPONGE肥社制），從所 采集的溫泉上壤樣本各lOg中提取DM。利用羅氏診斷（RocheDia即ostics)社制GSFLX Titanium454和Illumina社制測序儀化Seq2000,對(duì)所提取的DNA進(jìn)行宏基因組DNA的鳥 槍法測序。在454測序儀中使用5yg所提取的DNA，在化Seq2000測序儀中，使用由基因 組DNA擴(kuò)增試劑盒（GenomiPhiV2DNA擴(kuò)增試劑盒，GE醫(yī)療社制）擴(kuò)增的產(chǎn)物，進(jìn)行宏基因 組DNA的序列解碼。在利用HiSeq2000進(jìn)行的測序中，使用Illumina社制cBot，將DNA文 庫和試劑注入流動(dòng)槽（flowcell),在流動(dòng)槽內(nèi)由DNA1分子自動(dòng)形成具有同一序列的基因 簇。使用HiSeq2000進(jìn)行l(wèi)(Ubp的配位末端測序，得到宏基因組序列數(shù)據(jù)。
[0147] 對(duì)溫泉±壤樣本AR19進(jìn)行宏基因組DNA的序列解碼，在454測序儀中，得到平均 解碼長度（readlength)為 39化P、總解碼數(shù)（totalreadnumber)為 2, 766, 332 個(gè)、總基 因組解碼量為1，106, 243, 28化P，在HiSeq2000測序儀中，得到配對(duì)末端的平均解碼長度 為92. 6化Pbp、總解碼數(shù)為894, 238, 096個(gè)、總基因組解碼量為83, 112, 168, 755bp，共計(jì) 84. 2抓P的全基因組序列（WG巧數(shù)據(jù)集。
[0148] <2〉溫泉宏基因組數(shù)據(jù)的拼接與統(tǒng)計(jì)量
[0149] 對(duì)于用454測序儀和HiS巧測序儀讀取的堿基序列，使用化Cbio社制化C GenomicsWoricbench(CLC高通量數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，5. 5. 1版）進(jìn)行質(zhì)量過濾和Denovo拼接。 在質(zhì)量過濾后，由454測序儀得到的解碼的總解碼長度變?yōu)?, 766, 328bp，由HiSeq2000測 序儀得到的堿基序列數(shù)據(jù)的總解碼長度變?yōu)?1，323, 692, 563bp。拼接后，具有5(K)bpW上 長度的重疊群的數(shù)量為967, 925個(gè)，總?cè)L變?yōu)?19, 787, 603bp，其中，最大重疊群長度為 287, 641bp。 陽150] <3〉β-木糖巧酶的開放閱讀框（0PF)預(yù)測
[0151]從Uniprot數(shù)據(jù)庫化ttp://www.uniprot.org/)下載EC號(hào)為 3. 2. 1. 4(纖維素 酶）、3. 2. 1.21(β-葡糖巧酶）、3. 2. 1.37(β-木糖巧酶）、3. 2. 1.91(纖維素 1，4-β-纖 維二糖糖巧酶）、3. 2. 1.8(內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶）的序列（訪問日期：2011/12/9), 構(gòu)建運(yùn)些糖巧水解酶基因的蛋白質(zhì)組本地?cái)?shù)據(jù)庫。使用注釋軟件Metagene(Noguchi等，《DNAResearch值NA研究）》，2008,15化)），由上述<2〉所得重疊群序列推斷基因區(qū)域 (=開放閱讀框）（Metagene選項(xiàng)：-m)。為了從推斷的ORF提取糖巧水解酶基因，使用了 BLASTP(blastallver. 2. 2. 18)，參照了上述本地?cái)?shù)據(jù)庫。BLASTP的選項(xiàng)條件設(shè)為"過濾查 詢序列=假"，"期望值巧)<le2°"[W下為默認(rèn)值：空位開放罰分=-1，空位擴(kuò)展罰分=-1， 空位比對(duì)的X下降值=0,闊值拓展命中=0,字段長度=默認(rèn)（Costtoopenagap= -1， Costtoextendedgap= -1，Xdropoffvalueforgappedalignment= 0，Threshold forextendinghits= 0,Wordsize=default)]，W命中ORF序列為糖巧水解酶基因進(jìn) 行收集。收集的堿基序列包含纖維素酶、內(nèi)切半纖維素酶、脫支酶等糖巧水解酶基因的堿基 序列。 陽152] <4〉基因的糖巧水解酶（GH)家族分類
[0153] 對(duì)于在上述<3〉中收集的堿基序列，W蛋白質(zhì)功能區(qū)域序列數(shù)據(jù)庫pfam HMMs(Pfam23. 0版和HMMERv2. 3 ;Finn等，《核酸研究數(shù)據(jù)庫》，2010年，第38卷，第 D211-222頁）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行功能分類。具體而言，使用了蛋白質(zhì)基序檢索程序HMMER(Durbin 等，"ThetheorybehindprofileHMMs.Biologicalsequenceanalysis:probabilistic modelsofproteinsandnucleicacids(概形HIM理論。生物序列分析理論：蛋白質(zhì)和 核酸的概率模型）"，1998年，劍橋大學(xué)出版社；hmmpfam(2. 3. 2版）中，E值截止值<le5;數(shù) 據(jù)庫=Pfam_fs(可用于查找所表示的結(jié)構(gòu)域在序列中的片段的模型。）），由與Pfam結(jié)構(gòu) 域數(shù)據(jù)庫的相似性確定糖巧水解酶（GH)家族。另外，將覆蓋GH催化結(jié)構(gòu)域的70%W上的 堿基序列計(jì)入屬于各家族的酶基因。
[0154] 通過Metagene，從84. 2抓P長的宏基因組AR19序列數(shù)據(jù)預(yù)測了602, 589個(gè)0RF， 全長0RF為251，146個(gè)。 陽1巧]通過BLASTP的相似性檢索，命中作為β-葡糖巧酶或β-木糖巧酶序列的406個(gè) 0RF。運(yùn)406個(gè)0RF中，通過pfamHMMs，16