一種具有增強(qiáng)免疫功能滸苔多糖的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種具有增強(qiáng)免疫功能稱苔多糖的制備 方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 陽00引稱苔腦teromonhaprolifera)是一種大型藥食兼用的藻類植物，屬綠藻口石魏 目石魏科，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，我國則主要分布于東南沿海地區(qū)。該藻生長和繁殖性能 非常強(qiáng)，其生長需要大量的空間，使得海洋中的其它需光藻類生物無法存活，造成大量藻體 死亡；稱苔類植物的死亡可使水體的富營養(yǎng)化，其降解過程能大量消耗氧氣，導(dǎo)致水體中溶 氧快速下降，魚類因缺氧而窒息死亡；水體富營養(yǎng)化還能造成其它藻類植物大量繁殖，影響 沿海的自然景觀。因此，稱苔大量增殖將對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞。稱苔多糖的獲得 和應(yīng)用有效地開發(fā)了稱苔的藥用價(jià)值和用途，治理了環(huán)境污染，降低了清理成本，提高了社 會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，稱苔營養(yǎng)豐富，含有多種活性功能成分，藥用價(jià)值高，開發(fā)潛力大。稱 苔多糖是其主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫功能生物學(xué)活性。由于稱苔多糖結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，而 且對(duì)于不同提取和純化分離工藝，所得多糖結(jié)構(gòu)與組分之間也存在很大差異，如何提取純 化獲得具有增強(qiáng)免疫功能的稱苔多糖的制備方法一直是個(gè)研究熱點(diǎn)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了一種具有增強(qiáng)免疫功能稱苔多糖的制備方法及應(yīng)用，該方法從稱苔 中提取的多糖應(yīng)用于免疫抑制小鼠可顯著改善環(huán)憐酷胺誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制增強(qiáng)免疫活 性。此制備方法簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、成本低廉、藥用價(jià)值大，對(duì)于促進(jìn)稱苔資源的綜合利用、天 然藥物和保健品的研究和開發(fā)W及海洋生態(tài)保護(hù)具有十分重要的意義。 陽〇化]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種具有增強(qiáng)免疫功能稱苔多糖的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行：
[0007] 1)稱苔粗多糖提取：稱取稱苔干品，加入20倍水，于90°C提取=次，每次化，紗布 過濾，取浸提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積1/6,再加入3倍體積95%乙醇，4°C過夜，得白色絮 狀沉淀，冷凍干燥，即為稱苔粗多糖；
[0008] 2)稱苔粗多糖脫蛋白：將稱苔粗多糖溶于蒸饋水，于60°C水浴中加熱溶解，冷卻 后調(diào)整溶液抑值到6. 5,加入木瓜蛋白酶，稱苔粗多糖終濃度為3%，50°C恒溫水浴2.化 后，將溶液于90°C，加熱5min，滅活木瓜蛋白酶，冷卻至室溫后，加入1/4V的Sevage試劑、 即氯仿：正下醇為4 :1的試劑，反復(fù)震蕩萃取30min后，300化/min離屯、15min，溶液分層，最 上層是多糖溶液，中間凝膠層即為變性的蛋白質(zhì)，最下層為有機(jī)溶劑，收集最上層溶液，反 復(fù)多次萃取，直到?jīng)]有凝膠層為止，減壓濃縮除掉上清液中有機(jī)試劑；
[0009] 3)高速離屯、法去除小分子雜質(zhì)：先用濃氨水調(diào)整多糖液抑至8.0,再向其中加入 10%的過氧化氨溶液同時(shí)快速攬拌，直至溶液變?yōu)榈S色，50°CW下保溫化脫色素，降至 室溫，將多糖溶液于GOOOr/min離屯、15min，去除小分子雜質(zhì)；
[0010] 4)氧化法脫去色素：將多糖溶液裝入阻滯分子量為3500化的透析袋里，用蒸饋水 透析，化后更換一次透析液，4°C過夜；次日用8000化的聚乙二醇濃縮糖液至1/3體積后， 反復(fù)用蒸饋水清洗透析袋表面，收集濃縮的多糖溶液，低溫干燥，得稱苔多糖的粗制品；
[0011] 5)Sephacryl-300凝膠層析柱純化多糖：將稱苔多糖的粗制品加熱溶解于蒸饋水 中，多糖濃度為50mg/mU打開Se地acr^-300層析柱打開水口，待液面幾乎于柱床平齊時(shí)， 關(guān)閉出水口，輕緩加入5mL多糖溶液，防止沖擊基質(zhì)，再次打開開關(guān)，待樣品剛好與柱床相 平時(shí)，關(guān)閉閥口，用少量蒸饋水沖洗基質(zhì)表面及層析柱管壁，打開閥口，待液面于柱床平齊 時(shí)，關(guān)閉閥口，緩慢加入蒸饋水，充滿整個(gè)層析柱后，安裝層析裝置，開始洗脫，其洗脫速度 為Imin/mU每管洗脫3min，共收集40管后，將含有多糖的洗脫液收集一起，減壓濃縮后，低 溫凍干，即為EP。
[0012] 2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的稱苔多糖的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟：在 第5)步之后對(duì)其進(jìn)行乙醇分級(jí)純化：將EP溶液加入無水乙醇，使其乙醇終濃度為40%， 4°C過夜沉淀多糖，30(K)r/min離屯、15min后，分離上清液和沉淀，低溫凍干沉淀即為EPl; 再向上清液中加入無水乙醇，使其終濃度達(dá)到60 %后，4°C過夜沉淀多糖，600化/min離屯、 15min，再次分離上清液和沉淀，低溫凍干沉淀即為EP2;再向剩余的糖液中加入無水乙醇， 待乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，4°C過夜收集沉淀，低溫凍干即為EP3。
[0013] 3、根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的稱苔多糖的應(yīng)用。
[0014] 經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明的分離、純化的稱苔多糖EP2含糖醒酸22. 60%，硫酸根20. 49%。 單糖組成為鼠李糖76. 7mg/kg，半乳糖21. 5mg/kg，葡萄糖10. 3mg/kg，木糖9. 5mg/kg。本發(fā) 明提供一種方法簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、成本低廉、藥用價(jià)值大，能提高免疫力等特點(diǎn)的一種稱苔 多糖其制備方法。尤其是采用提取、純化的制備方法，W及體外免疫活性篩選和免疫抑制動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)，獲得稱苔多糖及其提煉方法，闡明了此種稱苔多糖可增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫功 能的作用，為有效地開發(fā)了稱苔的藥用價(jià)值和用途，治理環(huán)境污染，降低清理成本，提高社 會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益提供了新方法。
【附圖說明】
[001引圖1 :稱苔多糖組分對(duì)T、B淋己細(xì)胞增殖影響
[0016] 其中：A、多糖組分對(duì)T淋己細(xì)胞增殖的影響；B、多糖組分+ConA對(duì)T淋己細(xì)胞增 殖的影響C、多糖組分對(duì)B淋己細(xì)胞增殖的影響；D、多糖組分+ConA對(duì)B淋己細(xì)胞增殖的影 響。其中：A、C組中刺激組與空白組比較#郵< 0. 01，多糖組與空白組比較*p< 0. 05，**p < 0.0 l ;而B、D組中刺激組與空白組比較#郵<0.0 l ;協(xié)同組與刺激組比較*p<0. 05， **p< 0.0 l
[0017] 圖2:稱苔多糖組分對(duì)Mcp細(xì)胞增殖影響
[0018] 其中：A、多糖組分對(duì)Mcp細(xì)胞增殖的影響；B、多糖組分+LI^對(duì)Mcp細(xì)胞細(xì)胞增殖 的影響，其中：A組中刺激組與空白組比較#郵< 0. 01，多糖組與空白組比較*p< 0. 05，**p < 0.Ol;而B組中刺激組與空白組比較#郵< 0.Ol;協(xié)同組與刺激組比較*p< 0. 05,**p < 0.Ol
[0019] 圖3:稱苔多糖組分對(duì)M(p細(xì)胞分泌NO的影響作用
[0020] 其中：A、多糖組分對(duì)Md)細(xì)胞分泌NO的影響；B、多糖組分+LI^對(duì)Md)細(xì)胞分泌NO 的影響。其中：A組中刺激組與空白組比較#郵< 0.01，多糖組與空白組比較*p< 0.05， **p< 0.Ol;而B組中刺激組與空白組比較#郵< 0.Ol;協(xié)同組與刺激組比較*p< 0. 05， 和咕< 0.Ol
[0021] 圖4 :稱苔多糖在T淋己細(xì)胞中的分布（IOOX)
[0022] 其中：A空白對(duì)照組，BEP2處理組，CConA處理組，DEP化ConA處理組。 陽02引圖5 :稱苔多糖在B淋己細(xì)胞中的分布（IOOX)
[0024] 其中：A.空白對(duì)照組；B.EP2處理組；C.LPS處理組；D.EP化LPS處理組 陽02引圖6 :稱苔多糖在Md)細(xì)胞中的分布（40X)，
[0026] 其中：A.空白對(duì)照組；B.EP2處理組；C.LPS處理組；D.EP化LPS處理組組
[0027] 圖7 :稱苔多糖對(duì)T淋己細(xì)胞RNA合成的影響（IOOX)。
[0028] 其中：A.空白對(duì)照組；B.EP2處理組；C.ConA處理組；D.ConA巧P2處理組
【具