一種檢測cyp3a4*1g和mdr1c1236t的基因多態(tài)性的hrm方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，涉及與藥物動力學相關(guān)的基因檢測。尤其涉及 一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多態(tài)性的HRM方法。利用本發(fā)明的方法，一次 可完成大量樣本的快速檢測，方法簡便，準確可靠省時省力，為臨床個體化合理用藥提供方 便。
【背景技術(shù)】
[0002] 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（HighResolutionMelting)，簡稱HRM，是由美國猶 他大學和愛德華科技公司合作開發(fā)的一種SNP以及突變研究的工具，能檢測人類84%的 SNP(單核苷酸多態(tài)性）。HRM基于核酸分子物理性質(zhì)的不同影響解鏈溫度，通過實時檢測升 溫過程中飽和熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況，從熒光強度和時間曲線上判斷是否存 在SNP。核苷酸雙鏈的熱穩(wěn)定性受堿基組成、長度和GC含量的影響，序列改變會引起升溫過 程DNA解鏈行為的改變。SNP位點若不匹配會使雙鏈DNA在升溫過程中解鏈，熒光染料從局 部解鏈的DNA分子上釋放，儀器獲得的熒光信號將會減弱。不同SNP位點、雜合子與純合子 等都會影響熔解曲線的峰型，進而有效區(qū)分不同基因型。應(yīng)用HRM曲線對樣品進行分析，極 高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達到單個堿基差異的區(qū)分。單個堿基引起的解鏈 溫度差異可能不到1°C，HRM具有很高的溫度分辨率，可以每步升溫0. 02~0. 1°C，每升高 一攝氏度采集熒光25次，可滿足單堿基差異的區(qū)分。HRM基于高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突 變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行HRM即可完成對樣品 突變、SNP、甲基化等的分析。
[0003] HRM技術(shù)應(yīng)用于基因突變檢測依據(jù)于飽和熒光染料，根據(jù)熒光信號強度的微妙變 化來判斷基因類別，有著很高的靈敏度和準確度。相對于非飽和染料，飽和染料具有更強的 DNA結(jié)合作用和較小的PCR抑制作用，使得DNA在解鏈過程中不會發(fā)生重排，熔解曲線有更 高的分辨率。近年來在HRM中應(yīng)用較多的飽和染料有LCGreen、LCGreenPlus、EvaGreen 和SYT0-9。
[0004] 基因指導下的個體化用藥越來越受到重視，20%~95%的藥物反應(yīng)和處置的個體 差異是由遺傳因素引起的?；蚨鄳B(tài)性的存在可能導致治療中不同患者的療效和不良反應(yīng) 的差異，許多科學家認為編碼藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運體和藥物作用。
[0005] 靶點的基因序列的不同是引起同一種藥物相似劑量在不同個體間產(chǎn)生不同反應(yīng) 的主要原因。FDA和歐洲EMEA分別于2005年和2010年頒布或起草了關(guān)于新藥臨床試驗中 提供藥物基因組學數(shù)據(jù)的指導文件。
[0006] CYP3A4是CYP3A家族中一個高表達的亞族酶系，CYP3A4*1G在亞洲人的 變異頻率較高。CYP3A4*1G位于CYP3A4內(nèi)含子10,造成82266位置G到A的取代 (20230G>A，rs2242480)，有研究報道CYP3A4*1G的表達對CNI類免疫抑制劑如環(huán)孢素和他 克莫司的藥動學有影響。
[0007] P-gp是MDR1編碼的ATP依賴的跨膜受體，通過在腸道的外排泵活性阻礙環(huán)境 毒素和藥物等外源物質(zhì)的吸收，保護敏感組織及作用底物的排泄，因此會造成藥物處置 和相互作用上的差異，進而影響到藥物的療效和不良反應(yīng)。目前已研究了 95個MDR1位 點，其中有74個位點具有多態(tài)性，研究較多的位點有MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T等。 C1236T(rsll28503)位點位于第12個外顯子，其變異屬于不引起氨基酸變化的同義突變。
[0008] SNP的主要檢測方法有以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典法和近些年來發(fā)展起來的高 通量、自動化程度較高的測序法，如限制性片段長度多態(tài)性法（RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性法、 變性梯度凝膠電泳、等位基因特異性PCR、DNA直接測序法、DNA芯片檢測、飛行質(zhì)譜儀檢測、 變性高效液相色譜法等。目前普遍應(yīng)用的基因突變檢測方法有RFLP法和DNA直接測序法。 RFLP法將PCR與限制性酶切相結(jié)合，因其實驗操作繁瑣、檢測周期較長、第一輪酶切不完全 導致假陽性結(jié)果以及只能用于已知SNP的判斷，無酶切位點的不能檢測等因素，只適合少 量樣本的檢測。變性梯度電泳法有商品化的電泳裝置，適合大樣本檢測篩選，但因為該法是 利用溫度和梯度凝膠遷移率來進行檢測的，需要進行凝膠電泳，DNA鏈二級結(jié)構(gòu)容易造成人 工假相，導致結(jié)果出現(xiàn)偏差。DNA直接測序法中PCR產(chǎn)物在全自動測序儀上電泳后進行測 序，方法先進，但是工作量大，耗時較長，價格昂貴，不適合大樣本的檢測。
[0009] 從臨床檢測效率、準確性以及病患經(jīng)濟條件出發(fā)，理想的SNP分析方法應(yīng)該具備 簡單快速、靈敏準確、經(jīng)濟實用的特點，近些年發(fā)展起來的HRM可以滿足。HRM分析技術(shù)以快 速的操作方法獲得需要的基因信息，滿足臨床個體化用藥的時效性和經(jīng)濟性要求，為臨床 合理用藥提供幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明主要目的在于提供一種檢測與藥物動力學相關(guān)的基因的檢測方法，尤其涉 及一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多態(tài)性的簡便快速方法。本發(fā)明涉及的HRM曲線 法靈敏度高、特異性好、方法簡單且能實現(xiàn)高通量篩選，操作不需要進行酶切、純化等步驟， 避免人工接觸有毒有害試劑和紫外照射等，安全性較好，并且能實現(xiàn)閉管操作，降低樣本污 染，分析不需要探針，僅在PCR反應(yīng)體系中增加微量飽和熒光染料，成本較低。
[0011] 具體的，本發(fā)明提供了一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多態(tài)性的方法，所 述的方法是在高分辨率熔解曲線分析技術(shù)基礎(chǔ)上，針對目的基因的檢測位點，篩選特異性 引物對和檢測反應(yīng)條件，完成目的基因的檢測；
[0012] 所述的目的基因的檢測位點是CYP3A4*1G和MDR1C1236T。
[0013] 所述方法包含以下步驟：
[0014] (1)查找目的基因的DNA序列；
[0015] (2)針對目的基因的突變位點設(shè)計篩選特異性引物對；
[0016] (3)提取樣本DNA，利用步驟（2)篩選的特異性引物進行基因擴增；
[0017] (4)瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增；
[0018] (5)根據(jù)高分辨率溶解曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測，選用 DNA飽和染料，參照對照樣本HRM曲線完成對樣本基因型的判斷。
[0019] 優(yōu)選的，所述引物對含有目的基因靶序列中18-27個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核 苷酸序列。
[0020] 優(yōu)選的，所述方法在PCR反應(yīng)體系中進行，所述PCR反應(yīng)體系包括引物、DNA聚合 酶、dNTPs、Mgcl2、模板DNA、PCR緩沖液和熒光染料。
[0021] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，選用的TaKaRaPremixTaq試劑盒包含Taq?HS、 PCR緩沖液（含Mg2+)、dNTPs。
[0022] 所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為：
[0023]
[0024] 所述dNTPs混合液包括 0· 4mMdATP、0. 4mMdTTP、0. 4mMdGTP、0. 4mMdCTP的混合 液。
[0025] 優(yōu)選的，所述的20μLPCR反應(yīng)體系各組分體積：
[0026]
[0027] 優(yōu)選的，所述熒光染料為DNA飽和染料SYT0-9。
[0028] 優(yōu)選的，所述PCR擴增程序中進行PCR擴增反應(yīng)的條件為95°C預變性10min，95°C 變性30s，50-65°C退火30s，72°C延伸30s，72°C繼續(xù)延伸5min，40個循環(huán)。
[0029] 優(yōu)選的，所述瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，梯度PCR選擇目 的基因擴增產(chǎn)物退火溫度分別為，CYP3A4*1G:57°C，MDR1C1236T:60°C。
[0030] 優(yōu)選的，所述HRM曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測。所述進行突 變位點檢測的產(chǎn)物熔解程序中進行產(chǎn)物熔解檢測的條件為95°C變性2min，40°C復性2min; 然后初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信 號，25-45次每秒；然后40°C進行冷卻10s。熔解曲線溫度設(shè)定范圍分別：CYP3A4*1G為79~ 88°C，MDR1C1236T為 80 ~88°C。
[0031] 優(yōu)選的，所述方法具體按照如下步驟進行：
[0032] 1)查找目的基因CYP3A4*1G和MDR1C1236T的DNA序列；
[0033] 2)針對目的基因的突變位點設(shè)計篩選合適的引物對；
[0034] 3)提取樣本DNA，利用步驟⑵篩選的引物進行基因擴增；
[0035] 4)瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增；
[0036] 5)根據(jù)高分辨率溶解曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測，選用 SYT0-9飽和熒光染料，參照對照樣本HRM曲線完成對樣本基因型的判斷。
[0037] 優(yōu)選的，所述模板DNA從健康人全血樣本中提取。<