一種同步檢測(cè)豬羊牛動(dòng)物源性成分的微滴pcr引物體系及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種同步檢測(cè)豬羊牛動(dòng)物源性成分的微滴 PCR引物體系及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界動(dòng)物源性食品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。2013年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公 報(bào)顯示，全年豬牛羊禽肉產(chǎn)量8373萬(wàn)噸，比上年增長(zhǎng)1.8%，其中豬肉產(chǎn)量5493萬(wàn)噸。我 國(guó)作為豬肉生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó)，豬肉產(chǎn)品卻難W進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。為確保食品成分的真實(shí)性，質(zhì)檢 "十二五"規(guī)劃綱要明確指出，需重點(diǎn)加強(qiáng)開展食品滲假鑒別技術(shù)研究。其中豬肉的滲假不 僅侵害消費(fèi)者利益，還可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起糾紛，不利于維護(hù)社會(huì) 安定。如果問(wèn)題產(chǎn)品出口到國(guó)外更會(huì)損害我國(guó)食品企業(yè)的整體形象。
[0003] 目前，為了確定肉及肉制品的真實(shí)性，已經(jīng)研發(fā)出了包括基于核酸的分子生物學(xué) 技術(shù)，如PCR、實(shí)時(shí)定量PCR和分子指紋技術(shù)，基于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的免疫分析技術(shù)，紅外光 譜技術(shù)W及質(zhì)譜技術(shù)等動(dòng)物源性成分鑒別方法?；趧?dòng)物種屬間遺傳信息的差異從核酸分 子水平上動(dòng)物進(jìn)行肉種鑒定W及對(duì)動(dòng)物源性食品進(jìn)行檢驗(yàn)研究，是目前動(dòng)物源性成分研究 的最有效手段。作為鑒別的檢測(cè)祀點(diǎn)而被廣泛使用。目前，W檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的方法主要 有：核酸探針雜交、PCR-RFLP分析、DNA指紋分析、PCR特異擴(kuò)增。其中，PCR特異擴(kuò)增法最 為簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛，其它分析法由于操作難度大，在實(shí)際檢測(cè) 中較少應(yīng)用。
[0004] 針對(duì)動(dòng)物源性食品中存在的問(wèn)題，我國(guó)近些年也加強(qiáng)了肉類安全性的認(rèn)識(shí)，制定 了《傳染病防治法》、《動(dòng)物防疫法》、《食品衛(wèi)生法》、《進(jìn)出口商品檢驗(yàn)法》等相關(guān)的法律法規(guī)。 2007年W來(lái)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)頒布了關(guān)于動(dòng)物源飼料中動(dòng)物成分（牛、綿羊、山羊、 豬、兔、鹿、馬、驢、狗、駱駝）定性檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)些檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)目前主要集中在利用傳統(tǒng)的 常規(guī)PCR技術(shù)，而且只能對(duì)動(dòng)物源性肉及肉制品進(jìn)行單一種的定性檢測(cè)。在肉類食品樣本 實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)于成分不明確或混合的加工制品，需要通過(guò)多次檢測(cè)試驗(yàn)才能確定，其 周期長(zhǎng)、工作量大、成本高。在未來(lái)的動(dòng)物源性肉及肉制品的檢測(cè)中，運(yùn)類檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)越 來(lái)越不能勝任一次處理幾種甚至十幾種動(dòng)物源制品的特殊需要，尤其是大數(shù)量的加工產(chǎn)品 進(jìn)入商品化生產(chǎn)時(shí)，需要更有效的、快速的檢測(cè)方法。
[0005] 在肉類食品樣本實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)于成分不明確或混合加工制品，需要通過(guò)多 次檢測(cè)或多重檢測(cè)試驗(yàn)才能確定。多重PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)基因，微滴PCR 就是PCR技術(shù)和乳化技術(shù)相結(jié)合的最先進(jìn)的PCR技術(shù)，是將PCR反應(yīng)體系分隔成1〇9個(gè)獨(dú) 立的微滴，每個(gè)微滴含有一個(gè)或兩個(gè)模板和引物，同時(shí)平行地進(jìn)行擴(kuò)增，消除了多重PCR的 固有缺陷，提高了目標(biāo)擴(kuò)增的通量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種同步檢測(cè)豬羊牛動(dòng)物源性成分的微滴PCR引物體系 及檢測(cè)方法，快速且高特異性檢測(cè)豬羊牛肉制品的真?zhèn)渭捌涫欠裼袧B假，大大提高效率，節(jié) 約時(shí)間，而且節(jié)省檢測(cè)成本，特別適用于豬羊牛制品的快速防偽鑒定。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種同步檢測(cè)豬羊牛動(dòng)物源性成分的微滴PCR引物體系，包括如下豬特異性引物 對(duì)I、羊特異性引物對(duì)II、牛特異性引物對(duì)III:
[0009] (1)對(duì)豬12SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增生成豬特異性擴(kuò)增片段的豬特異性引物對(duì)I:
[0010]正向引物：5 ' -CTACATAAGATATCCACCACA-3 ' ；
[0011]反向引物：5'-ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3'；
[0012] (2)對(duì)羊細(xì)胞色素C氧化酶亞基III(巧toe虹omeCoxidasesubunitIII)基因 進(jìn)行擴(kuò)增生成羊特異性擴(kuò)增片段的羊特異性引物對(duì)II:
[001 引 正向引物：5，-TACACTGTACAGGCATCAG-3，；
[0014]反向引物：5 ' -CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3 ' ；
[0015] (3)對(duì)牛TNFRSF10A基因進(jìn)行擴(kuò)增生成羊特異性擴(kuò)增片段的牛特異性引物對(duì) III:
[0016]正向引物：5 ' -CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3 ' ；
[0017]反向引物：5'-CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3'。
[0018] 本發(fā)明所述的一種同步檢測(cè)豬羊牛動(dòng)物源性成分的微滴PCR檢測(cè)方法，其包括如 下步驟：
[001引1)W待檢樣品總DNA為模板，配制含有豬特異性引物對(duì)I、羊特異性引物對(duì)II和 牛特異性引物對(duì)III組成的引物體系的PCR水相體系和PCR油乳化劑體系，PCR水相體系 和PCR油乳化劑體系混合制備水包油的微滴PCR體系，進(jìn)行微滴PCR擴(kuò)增；其中，所述待檢 樣品總DNA模板來(lái)自豬、羊、牛物種肉產(chǎn)品中的一種或多種。
[0020]。反應(yīng)結(jié)束后，將微滴PCR產(chǎn)物高速離心水相油相分離，取下層水相的擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判定。
[0021] 3)結(jié)果判定：待檢樣品擴(kuò)增出290bp條帶的，判定待檢樣品為豬源性成分陽(yáng)性；待 檢樣品擴(kuò)增出370bp條帶的，判定待檢樣品為羊源性成分陽(yáng)性；待檢樣品擴(kuò)增出190bp條帶 的，判定待檢樣品為牛源性成分陽(yáng)性。
[0022] 進(jìn)一步，所述PCR水相體系包括：
[0023] 滅茜雙蒸水 5.0-6.0體積份； 10*PC民反應(yīng)緩沖液 1.0體積份; lOmg/mL牛血清蛋白（BSA) 0.8-1.2體積份; 2.5mM的dN胖S 0.8-1.2 體積份; 2.5υ/μ1的熱啟動(dòng)Taq酶 0.2-0.6體積份； 總DNA模板 0.1-0.3體積份； ΙΟμΜ所述微滴PC民引物體系各化1-0,3體積份； 中的正向引物（豬、羊和牛） ΙΟμΜ微滴PC民引物體系反向奮化1-0,3體積份。 引物（豬、羊和牛）
[0024] 優(yōu)選的，所述PCR水相體系包括：
[00 巧] 滅菌雙蒸水 5.4體積份； 10*PC民反應(yīng)緩沖液 1.0體積份; lOmg/mL牛血清蛋白（BSA) 1.0體積份； 2.5mM的dNTPs 0.8 體積份；
[0026] 2.5υ/μ1的熱后動(dòng)Taq酶 0.4體積份; 總DNA模板 0.2體積份； l'0'μΜ微滴PC技引物體系中的各0.2體積份； 正向引物（豬、羊和牛） ΙΟμΜ微滴PC民引物體系中的各化2體積份。 反向引物（豬、羊和牛）
[0027] 所述PCR油乳化劑體系包括：
[0028] 山梨糖醇酌油酸醋 4.0-5.0體積份； 聚氧乙稀脫水山梨醇單油酸醋 0.4-0 乂體積份； 聚乙二醇辛基苯基趟 0.04-0.06體積份； 硅油 94.34-95.56體積份。
[0029] 優(yōu)選的，所述PCR油乳化劑體系包括：
[0030] 山梨糖醇酌油酸醋 4.5體積份； 聚氧乙婦脫水山梨醇單油酸醋 0.5體積份； 聚乙二醇辛基苯基離 0.05體積份； 桂油 94.95體積份。
[0031] 所述水包油的微滴PCR體系的制備方法：所述水包油的微滴PCR體系的制備方法： 在磁力旋轉(zhuǎn)下，將PCR水相體系W20-35μ1/s的速度加入到PCR油乳化劑體系中，混勻，靜 置，形成均勻的水油乳化劑，其中，PCR油乳化劑體系與PCR水相體系的體積比為1. 5-2. 5 : 1。具體制備方法為：室溫下，將200-600ylPCR油乳化劑體系添加到西林瓶中，磁力旋轉(zhuǎn) 下；取100-300μ1PCR水相體系W20-35μ1/s加入到PCR油乳化劑體系中，混勻5min，靜 置2min，形成均勻的水油乳化劑，W50μ1/管分裝入PCR管，進(jìn)行微滴PCR擴(kuò)增。
[0032]所述水包油的微滴PCR體系反應(yīng)程序?yàn)椋阂来芜M(jìn)行90-100°C下預(yù)變性5-20min， 90-100 °C變性20-60S，50-60 °C退火30-60S，71-73 °C延伸60-120S，進(jìn)行30-50次循環(huán)， 71-73°C下延伸5-20min，最后在4-20°C下保持> Imin后結(jié)束。
[0033] 優(yōu)選的，所述水包油的微滴PCR體系反應(yīng)程序?yàn)椋阂来芜M(jìn)行95°C下預(yù)變性lOmin， 94°C變性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，進(jìn)行35次循環(huán)，72°C下延伸lOmin，最后在4°C 下保持Imin后結(jié)束。
[0034] 所述微滴PCR產(chǎn)物高速離屯、、水相油相分離具體步驟為：微滴PCR結(jié)束后，將微滴 PCR產(chǎn)物離屯、，使水相油相分離，棄上部油相，取下層水相的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。
[003引更優(yōu)選的，所述PCR水相體系包括：
[0036] 滅菌雙蒸水 1〇8μΙ; 10巧C民反應(yīng)緩沖液 20μΙ; lOmg/mL牛血清蛋白（BSA) 餅扣; 2.5mM的dNTPs 16μ1； 2.5υ/μ1的熱啟動(dòng)Taq酶 8μΙ; 總DNA模板 4μΙ; ΙΟμΜ正向引物（豬、羊、牛） 各4μ1; ΙΟμΜ反向引物（豬、羊、牛） 各4μ1; 總體積 200μ1。
[0037] 更優(yōu)選的，所述PCR油乳化劑體系包括：
[0038] 山梨糖醇酢油酸醋 18μ; 聚氧乙矯脫水山梨醇單油酸醋 2μ1; 聚乙二醇辛基苯基醜 0.2μ1; 珪油 379.8μ1； 總體秩 400μ1。
[0039]本發(fā)明通過(guò)分析豬、羊和牛3種動(dòng)物線粒體DM中的遺傳不保守區(qū)域基因（包括 12SrRNA，c}ftoc虹omeCoxidasesubunitIII和TNFRSF10A)，進(jìn)行序列測(cè)定及比對(duì)后，根 據(jù)各序列上的特異堿基位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了各物種的特異性PCR引物對(duì)，其僅對(duì)相應(yīng)的物種總 DNA模板有擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)其他物種沒有目的擴(kuò)增信號(hào)，本發(fā)明各