一種通過過量表達hac1基因提高酒精生產(chǎn)效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種通過過量表達HAC1基因提高酒精生產(chǎn)效率的方法，尤其是一種 應用轉(zhuǎn)錄因子單基因缺失及過量表達的釀酒酵母提高酒精對菌體得率的方法，屬于生物能 源開發(fā)技術領域。
【背景技術】
[0002] 化石能源（煤、石油、天然氣等）是當前世界上最主要的能源，隨著世界各國經(jīng)濟 社會的發(fā)展，人類對能源的需求量日益遞增，但化石能源的儲量是有限的；同時，化石能源 燃燒產(chǎn)生的溫室氣體造成的全球氣候變暖及所帶來的問題，一直困擾著人們。因此，尋找和 發(fā)展可再生的新能源已成為全世界關注的熱點。燃料酒精具有清潔、安全、環(huán)境友好、及原 料可再生等優(yōu)點，被認為是石油資源的理想替代品，市場潛力巨大。目前，已在歐洲、美國及 己西等國較為廣泛地使用。
[0003] 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)燃料酒精是當前研究的熱點，釀酒酵母是理想的酒精發(fā)酵生產(chǎn) 菌株，具有：在簡單的培養(yǎng)基上能夠快速地生長及生產(chǎn)乙醇；對非生宜環(huán)境（如高滲透壓、 高溫及乙醇毒害）具有較強的適應性；遺傳改造操作方便；能夠利用廉價的底物，發(fā)酵成本 較低等特性。利用濃膠發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的技術在過去10年獲得了很大的進步，但和美國等發(fā) 達國家相比仍然存在很大的差距，存在的主要問題在于：發(fā)酵前期的高濃度底物造成的高 滲透壓抑制；發(fā)酵后期的高濃度乙醇造成的毒害抑制；發(fā)酵過程中不易控制的高溫度造成 的抑制作用。運些問題的存在成為限制濃膠發(fā)酵技術生產(chǎn)效率提高的主要因素。
[0004] 目前，對于釀酒酵母（Saccharomycescerevisae)耐受高滲透壓、高濃度酒精和高 溫的研究已取得了很多的進展，但相關耐受機制尚未研究清楚。因此，要想通過理性的改造 手段來提高S.cerevisiae對逆境的耐受性十分困難。盡管傳統(tǒng)的菌種選育手段（如自然 篩選、誘變育種）在提高菌株對逆境耐受性方面已取得了一定的效果，但存在工作量大、存 在隨機性等缺點。近年來，隨著分子生物學和組學技術的快速發(fā)展，為大規(guī)模研究釀酒酵母 基因和乙醇發(fā)酵的關系提供了條件。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種提高酒精生產(chǎn)效率的方法，所述方法 是在ace2基因缺失株里過量表達HAC1基因提高酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)酒精的效率。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述工程菌是釀酒酵母工程菌。 陽007]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ACE2基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述HAC1基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ACE2基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO. 3所 /J、-〇
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是在ace2單基因缺失的釀酒酵母中過表 達HAC1基因。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ace2單基因缺失的釀酒酵母購自Invotrogen 公司，編號為Sc04146899_sl。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過表達是將HAC1基因片段克隆到表達質(zhì)粒 PHAC181(JiangL，2004)上得到重組高表達質(zhì)粒PHAC181-HAC1，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ace2 單基因缺失株中進行表達。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達質(zhì)粒PHAC181是在YCplaclSl的SphI和 EcoRV位點插入3個組氨酸標簽得到的，詳見文獻：Analyses of the effects of Rck2p mut曰nts on Pbs2p°°-induced toxicity in S曰cch曰romyces cervisi曰e identify曰MAP kinase docking motif, and unexpected functional inactivation due to acidic substitution of T379, Mol Gen Genomics, 2004, 271:208 - 219.
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是將酵母工程菌活化后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培 養(yǎng)基，使得接種種子菌液后發(fā)酵培養(yǎng)基的ODe。。為0. 4-0. 5,于28-30°C、200-220r/min培養(yǎng) 7-8小時后轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)50-5化。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是將酵母工程菌活化后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培 養(yǎng)基，使得接種種子菌液后發(fā)酵培養(yǎng)基的ODe。。為0. 5,于30°C、220r/min培養(yǎng)8小時后轉(zhuǎn)為 靜置培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)52h。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖lOOg/L、硫酸錠7. 5g/ ^憐酸二氨鐘3. 5g/L、屯水硫酸儀0. 75g/l、酵母提取物0. 2g/L、組氨酸0. 02g/l、尿喀晚 0.02g/l、亮氨酸0.1 g/L。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述活化優(yōu)選Yro培養(yǎng)基。在YPD固體培養(yǎng)基上劃 線，于30°C培養(yǎng)2dW初步活化菌種，再轉(zhuǎn)接至YTO液體培養(yǎng)基中，30°C、220r/min搖床培養(yǎng) 2化至飽和。
[0018] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種酒精生產(chǎn)效率提高的釀酒酵母工程 菌，所述釀酒酵母工程菌缺失了編碼氨基酸序列如SEQIDNO. 3的ace2基因且過表達核巧 酸序列如沈QIDNO. 2的HAC1基因。
[0019] 所述釀酒酵母工程菌是在ace2單基因缺失的釀酒酵母中過表達HAC1基因。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 本發(fā)明利用在ace2單基因缺失的釀酒酵母菌株中過量表達HAC1基因而獲得的工 程酵母菌株發(fā)酵生產(chǎn)酒精，相比于野生型空載對照菌株，發(fā)酵進行到5化時，乙醇產(chǎn)量提高 了 200.8%，酒精對菌體得率提高了 138.9%;相比于僅發(fā)生ace2單基因缺失的菌株，乙醇 產(chǎn)量提高了 13. 1%。本發(fā)明具有很好的工業(yè)應用價值和前景，同時為構(gòu)建高產(chǎn)酒精的優(yōu)良 釀酒酵母基因工程菌株提供了重要的信息。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :菌體生物量比較圖；其中ace2+HACl代表在ace2單基因缺失菌株中過量表 達HAC1而獲得的工程菌株，WT+V代表含有空載的野生型對照菌株；
[0023] 圖2 :乙醇產(chǎn)量比較圖；其中ace2+HACl代表在ace2單基因缺失菌株中過量表達 HAC1而獲得的工程菌株，WT+V代表含有空載的野生型對照菌株；
[0024] 圖3 :乙醇得率比較圖；其中ace2+HACl代表在ace2單基因缺失菌株中過量表達 HACl而獲得的工程菌株，WT+V代表含有空載的野生型對照菌株。
【具體實施方式】
[0025] 高效液相色譜測定乙醇含量的方法：發(fā)酵液中乙醇含量的測定采用高效液相色譜 儀（冊LC)檢測。發(fā)酵液經(jīng)處理且上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，利用RID(示差折光 檢測器）進行檢測，液相色譜方法如下：色譜柱：Shodex甜1011糖柱有機酸柱；柱溫：50°C; 流動相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，經(jīng)0. 22μπι濾膜過濾并除氣；流速：1血/min;檢測時間： 17min;進樣量：20yL。
[0026] 乙醇對菌體得率