人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞向睪丸間質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞與組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS)細(xì)胞向睪丸間質(zhì)細(xì)胞(LCs)的誘導(dǎo)分化方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells, LCs)分布于睪丸生精細(xì)胞管之間的疏松結(jié)締組織，其分泌的睪酮是成年男性體內(nèi)睪酮的主要來源。LCs移植是治療L0H等睪酮缺乏相關(guān)疾病的最佳手段，它能夠更好的模擬人體睪酮分泌的生理特點(diǎn)，使血清睪酮濃度和睪丸局部睪酮濃度都能得到有效的提高，可以獲得更好的治療效果的同時(shí)，盡量避免治療過程中產(chǎn)生的不良后果。然而，由于LC發(fā)育起源不明，而且存在取材困難、數(shù)量稀少、擴(kuò)增困難等缺陷明顯制約了其臨床應(yīng)用前景。目前睪丸間質(zhì)細(xì)胞常用的分離方法為密度梯度離心法(Ge RS，Dong Q，Sottas CM, Papadopoulos V，Zirkin BR，Hardy MP.1n search of ratstem Leydig cells:1dentificat1n, isolat1n, and lineage-specific development.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ; 103:2719-2724 ;Stanley E，Lin CY, Jin S，Liu J, SottasCM,Ge R，et al.1dentificat1n, proliferat1n, and differentiat1n of adult Leydigstem cells.Endocrinology 2012 ； 153:5002-5010.)0
[0003]誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPS細(xì)胞)具備了與胚胎干細(xì)胞相似的自我更新和多向分化潛能，同時(shí)因其可來源于自身成體細(xì)胞，克服了胚胎干細(xì)胞存在的倫理與免疫源性等諸多問題，成為研究人類疾病發(fā)病機(jī)制、開展組織細(xì)胞替代治療的重要細(xì)胞來源。個(gè)體來源的成體細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)錄因子(KLF4，S0X2，0CT4和c-MYC)導(dǎo)入重編程為多能干細(xì)胞，從而使自體移植成為可能。以iPS細(xì)胞作為“種子”細(xì)胞，可以將其在體外大量擴(kuò)增并誘導(dǎo)分化為特定的組織細(xì)胞。
[0004]LCs的可能來源包括腎上腺-性腺原基(adrenal-gonadal primordium)、神經(jīng)嵴(neural crest)、中腎(mesonephros)或者體腔上皮(coelomic epithelium)[Barsoum，1.B.and Η.H.Yao，F(xiàn)etal Leydig celIs:progenitor cell maintenance anddifferentiat1n.J Androl, 2010.31 (1):p.11-5.] 0 Davidoff 的研究發(fā)現(xiàn)，睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志Nestin和周細(xì)胞標(biāo)志NG2，進(jìn)一步證實(shí)了 LC細(xì)胞有可能是神經(jīng)嵴起源[Davidoff, M.S.，Middendorff, R.，Enikolopov, G.，Riethmacher, D.，Holstein,A.F., Mliller, D.，Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cellsrevealed.J Cell B1l，2004.167(5):p.935-44.] o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPS)在體外經(jīng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞(neural crest stem cells，NCSCs)，可以分化為成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells，LCs)。本發(fā)明的目的是提供了一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)經(jīng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞(NCSCs)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞(LCs)的體外定向誘導(dǎo)分化方法，并利用動(dòng)物模型證實(shí)來源于iPS細(xì)胞的LCs具備再生衰老或損傷LCs的能力，為性腺功能低下的病人尤其是LOH病人提供新的補(bǔ)充睪酮的方案。
[0006]本發(fā)明的方案是將人iPS細(xì)胞系誘導(dǎo)分化為神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs)，隨后進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞(LCs)。其具體步驟如下:
[0007](1)人iPS細(xì)胞系(hiPSCs)向神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs或稱iPS_hNCSCs)的誘導(dǎo)分化:
[0008]①制備細(xì)胞懸液。將人iPS細(xì)胞系(hiPSCs)消化成小團(tuán)塊狀后重懸。
[0009]其中可使用含有ROCK抑制劑的mTeSR培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
[0010]②誘導(dǎo)分化。將懸浮細(xì)胞接種在低粘附性的培養(yǎng)皿中，使用神經(jīng)分化培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)形成胚體結(jié)構(gòu)。
[0011]其中神經(jīng)分化培養(yǎng)液可以，例如，含有80% Knockout?DMEM、18% Knockout?SR、1%雙抗、ImM L-谷氨酸、和0.1mM的β-巰基乙醇。
[0012]③貼壁培養(yǎng)。將形成的胚體接種于纖連蛋白包被的培養(yǎng)板中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
[0013]其中，接種時(shí)間可為胚體形成5天后。培養(yǎng)板可用多聚賴氨酸/明膠/纖連蛋白包被。培養(yǎng)板中可加入神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)液，所述神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)液可以是按1:1比例將 DMEM/F12 培養(yǎng)基與 Neurobasal 培養(yǎng)基混合，并添加 1% (V/V)N2、2% (V/V)B27U% (V/V)青鏈霉素混合液、ImM L-谷氨酸和0.1mM的β -巰基乙醇，再加入10ng/mL的bFGF和10ng/mL 的 EGF。
[0014]④流式分選。使用流式細(xì)胞儀分選出P75+/HNK1+的細(xì)胞，S卩神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs 或稱 iPS-hNCSCs)。
[0015]所述神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)液可以是按1:1比例將DMEM/F12培養(yǎng)基與Neurobasal培養(yǎng)基混合，并添加1% (V/V)N2、2% (V/V)B27U% (V/V)青鏈霉素混合液、ImM L-谷氨酸和0.1mM的β -巰基乙醇，再加入10ng/mL的bFGF和10ng/mL的EGF。
[0016](2)使步驟⑴獲得的神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs或稱iPS-hNCSCs)向睪丸間質(zhì)細(xì)胞(iPS-hNCSCs-LCs 或稱 hNCSCs-LCs)誘導(dǎo)分化。
[0017]步驟(2)可以是擴(kuò)增步驟(1)獲得的神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs)，并在睪丸間質(zhì)細(xì)胞(LCs)分化培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化14天，獲得睪丸間質(zhì)細(xì)胞(hNCSCs-LCs)。
[0018]其中，可以在神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)液中擴(kuò)增獲得的神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hNCSCs)。進(jìn)一步，可以在hNCSCs擴(kuò)增達(dá)到60%的密度時(shí)換成LCs分化培養(yǎng)液。LCs分化培養(yǎng)液可以是在DMEM-F12 培養(yǎng)基中加入 2% FCSUOng PDGF-BB、lng/ml LH、InM 甲狀腺激素(T3)和 70ng/ml IGF-1o 所獲得的 hNCSCs-LCs 表達(dá) 3 β -HSD，P450C17，StAR，SF-1，并分泌睪酮。
[0019]將通過本發(fā)明方法獲得的睪丸間質(zhì)細(xì)胞(iPS-hNCSCs-LCs)移植到去除睪丸間質(zhì)細(xì)胞的大鼠動(dòng)物模型(應(yīng)用大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的特異性凋亡誘導(dǎo)劑二甲磺酸乙烷(EDS)建立的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡模型，即EDS模型)，評(píng)價(jià)該細(xì)胞在睪丸微環(huán)境中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞移植后可以提高血清睪酮的濃度，因此本發(fā)明的方法得到的睪丸間質(zhì)細(xì)胞(iPS-hNCSCs-LCs)可以用于制備治療睪酮水平低下相關(guān)疾病的藥物。
[0020]本發(fā)明將人iPS細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化及細(xì)胞分選獲得神經(jīng)嵴干細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化神經(jīng)嵴干細(xì)胞，獲得睪丸間質(zhì)細(xì)胞并分泌睪酮。將本發(fā)明的睪丸間質(zhì)細(xì)胞(iPS-hNCSCs-LCs)移植到用EDS消除了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的大鼠模型中，可提高模型動(dòng)物的血清睪酮水平。
【附圖說明】
[0021]圖1是hiPSCs向hNCSCs的誘導(dǎo)分化過程中形成胚體和懸浮培養(yǎng)后的白光照片和分化后的NCSCs標(biāo)志物的免疫熒光染色圖。其中A-C為白光照片，A.擴(kuò)增培養(yǎng)的hiPSCs ;B.懸浮培養(yǎng)的胚體；C.貼壁培養(yǎng)的胚體，其形成神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)，并向外迀移；D是分化后細(xì)胞中NCSCs特異性標(biāo)志物的表達(dá)(免疫熒光染色)。其中Scale bar = 100 μm。
[0022]圖2是對(duì)hNCSCs進(jìn)行生物學(xué)特性分析的白光和熒光染色照片。A.用流式