一種提高肝胰腺糖原累積的Esflol基因序列及其應(yīng)用
【專利說明】
[0001] 本研究受到國家自然科學(xué)基金青年基金（31302168);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù) 研究計劃（一般項目）（14JCYBJC30700);天津師范大學(xué)博士基金（52XB1303)的支持。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種提高肝胰腺糖原累積的Esflol基因序列 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 甲殼動物高血糖激素（CHH)，是神經(jīng)多肽激素家族的成員之一。該蛋白僅存在于 節(jié)肢動物中，在血淋巴葡萄糖水平調(diào)節(jié)、蛻皮以及應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵作用。雖然細(xì)胞膜上 的鳥苷酸環(huán)化酶（GC)已被公認(rèn)為Y器官的CHH受體，但在肝胰臟中的受體仍然沒有確定。 在本研究中，我們通過對河蟹轉(zhuǎn)錄組分析，篩選克隆到了一個在去眼柄后表達量提高了 2. 8 倍的基因一中華絨螯蟹flotilin類似蛋白（Esflol)作為目標(biāo)分子去研究。在對河蟹的 Esflol基因進行RNA干擾后，機體的葡萄糖水平下降，促使糖原累積到了肝臟。中華絨螯蟹 簡稱河蟹，每100克河蟹食用部分中含蛋白質(zhì)14%，脂肪5. 9%，碳水化合物7%，此外，還含有 維生素A、核黃素、煙酸，其發(fā)熱量超過一般魚類的營養(yǎng)水平。其中富含的維生素A更是人體 不可或缺的一種微量元素，行使著促進兒童生長發(fā)育，預(yù)防夜盲癥與保持上皮組織的健康 狀態(tài)等重要生理作用。
[0004] 河蟹自身所擁有的這些特點使其具有可觀的市場經(jīng)濟價值，也推動了其養(yǎng)殖業(yè)的 發(fā)展。目前，河蟹的養(yǎng)殖已經(jīng)打破了傳統(tǒng)的地域界限，河蟹的養(yǎng)殖已出現(xiàn)在江蘇、安徽、河 北、廣東、福建等多個省份；養(yǎng)殖方式也由傳統(tǒng)的資源放流型養(yǎng)殖發(fā)展為當(dāng)下的集約化高密 度養(yǎng)殖。近年，河蟹的出口量也在不斷攀升，所以為了滿足不斷攀升的市場需求，發(fā)展河蟹 的養(yǎng)殖業(yè)成為關(guān)鍵所在，而如何縮短中華絨螯蟹的生長期，加快其生長發(fā)育，提高產(chǎn)品的質(zhì) 量與產(chǎn)量成為了這一行業(yè)發(fā)展中的重中之重。
[0005] 肝胰腺是河蟹重要的組織器官，肩負(fù)著許多生理功能，其中包括合成并分泌消化 酶、吸收營養(yǎng)物質(zhì)、存儲無機物，代謝糖類物質(zhì)，除此之外肝胰腺還參與排泄與蛻皮等生理 活動。河蟹的肝胰腺主要由多種細(xì)胞構(gòu)成，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和功能可以分為四種，即胚細(xì)胞（E 細(xì)胞)、分泌細(xì)胞（B細(xì)胞)、吸收細(xì)胞（F細(xì)胞)、儲存細(xì)胞（R細(xì)胞)。其中R細(xì)胞主要形式儲 存功能，R細(xì)胞的胞質(zhì)中具有圓形的小液泡，近圓形的細(xì)胞核靠近細(xì)胞基部，部分細(xì)胞具有 大小不一的雙核，兩核或緊貼或分開。R細(xì)胞中具有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和噬堿性強的脂滴， 胞質(zhì)中游離核糖體的數(shù)量同樣非常之多，除此之外還分布有少量的線粒體和一些小液泡。R 細(xì)胞發(fā)達的脂肪體使其具有儲藏功能，儲存著河蟹生活必需的能量來源。
[0006] 碳水化合物是細(xì)胞生命活動最直接的能源。在河蟹生長的初期階段，飼料中的糖 分含量是決定成活率的第一限制因素。一旦河蟹在發(fā)育階段缺乏糖類營養(yǎng)物質(zhì)，就會使體 內(nèi)的脂類作為能量物質(zhì)被大量消耗，這樣就會無法滿足生殖腺發(fā)育對脂類物質(zhì)的需求，影 響河蟹個體的發(fā)育。作為食物來說，河蟹有三大可食部位：肌肉、肝胰腺和性腺，其中肝胰腺 因具有獨特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值是最受食客青睞的重要部分之一。醛類化合物是影響 熟蟹肝胰腺風(fēng)味的重要揮發(fā)性物質(zhì)，由脂質(zhì)受熱降解形成。河蟹中的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)類物質(zhì) 具有很高的營養(yǎng)價值。所以肝細(xì)胞是否可以大量儲存糖原物質(zhì)，并高效轉(zhuǎn)化為河蟹個體可 以直接利用的能源對于縮短河蟹成熟期、使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)富集有著重要意義。
[0007] 甲殼動物高血糖素（CHH)屬于CHH神經(jīng)肽家族。這個家族包含了一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的 多肽，包括蛻皮抑制激素（MIH)，卵黃/精巢抑制激素（VIH/GIH)，大腭器抑制激素（Μ0ΙΗ)以 及離子轉(zhuǎn)運多肽（ITP)。所有這些成員都只在節(jié)肢動物中發(fā)現(xiàn)。
[0008] 學(xué)界廣泛認(rèn)為，CHH是能夠調(diào)控幾種生理活性的多效分子，如血糖水平，脂類代謝， 蛻皮與應(yīng)激反應(yīng)。第一次對CHH的描述是關(guān)于其對糖代謝的調(diào)控的。肝臟和肌肉是CHH的 主要靶標(biāo)器官，肝臟在蛻皮過程中的所起到的作用是儲存能量，肌肉亦是另一個糖原的儲 存場所。學(xué)者們認(rèn)為，CHH在對下游分子的調(diào)節(jié)機理上在肝臟和肌肉這兩種器官中是明顯 不同的。肌肉的糖原只供給其自身，相比之下肝臟所合成與儲存的糖原是供給全身的。
[0009] 在外界環(huán)境的脅迫下，機體中糖原的變化和總碳水化合物的變化總是伴隨著CHH 的分泌量的變化。當(dāng)剪去斑節(jié)對蝦和羅氏沼蝦的眼柄后，糖原磷酸化酶明顯下降而糖原合 成酶的明顯上升，這預(yù)示著去除眼柄能夠促進糖原的積累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的 浸泡能夠使得葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原的比例降低。綜合這些得到的證據(jù)表明CHH確實是參與肝 臟的糖原代謝的，但CHH的受體以及信號傳導(dǎo)通路還是不明確。在甲殼動物中，已經(jīng)明確的 證實了當(dāng)減去眼柄之后，肝臟的細(xì)胞內(nèi)cGMP水平會顯著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲 殼動物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A參與到了CHH介導(dǎo)酶激活系統(tǒng)。但是細(xì)胞膜表面直 接和CHH作用的分子依然懸而未決。
[0010] flotilins被認(rèn)為是定位在細(xì)胞膜表面脂後（lipidraft)上的連接性蛋白。除此 之外，它們能分布在細(xì)胞內(nèi)體，吞體，高爾基體甚至細(xì)胞核，直到現(xiàn)在，關(guān)于flotilins是 否只在質(zhì)膜上存在還沒有定論。
[0011] 在flotilin家族中存在兩種同源異構(gòu)體，flotilinl和flotilin2。一般認(rèn)為， 這兩類蛋白會相互結(jié)合形成異源多聚體，并參與到一些細(xì)胞活動中，如軸突再生，膜蛋白更 新，以及內(nèi)吞作用等等。雖然flotilin在種間進化上十分保守，但它的確切功能依然存在 較大的爭議并需要進一步的證據(jù)來證明許多的推斷。最早，在金魚的視網(wǎng)膜細(xì)胞軸突再生 的研究中發(fā)現(xiàn)了flotilin，當(dāng)時被命名為再生reggies。敲除flotilins可顯著減弱機體對 膽固醇的吸收，這意味著它在NPC1L1介導(dǎo)的膽固醇吸收機制中起著關(guān)鍵的作用。在T細(xì)胞 中，flotilins被定位在細(xì)胞的一端，形成一個flotilin帽子結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)能夠激活PrPe 導(dǎo)致主要的T細(xì)胞受體復(fù)合體CD3的回收，而連接這一受體和一類信號分子如Vav的通路 也被人們發(fā)現(xiàn)。也就是說，flotilin形成的亞結(jié)構(gòu)能作為T細(xì)胞的信號平臺。
[0012] 據(jù)推測，在細(xì)胞某些特定位置的Flotilins能夠參與細(xì)胞膜以及膜表面蛋白的更 新。在脂肪細(xì)胞，F(xiàn)lotilins能夠從細(xì)胞深層將GLUT4回收到細(xì)胞表面。一些數(shù)據(jù)還支持 說Reggie/flotilin蛋白能在細(xì)胞相互接觸的區(qū)域參與信號過程。
[0013] 作為理解甲殼動物中Flotilin類似蛋白功能的第一步，我們找到了一個了河蟹 E.sinesisflotilin類似基因，命名為Esflol。在本研究中，我們分析了序列，表達特征， 以及在肝臟器官的組織定位，并進行了RNA干涉實驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明公開了一種河蟹E. sinesis flotilin類似基因，命名為Esflol基因序列， 其特征在于該基因序列中開放閱讀框（0RF)全長1281bp，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列。
[0015] 本發(fā)明所述Esflol基因序列，其所對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；該序 列編碼426個氨基酸，序列編碼的蛋白理論等電點為9. 150,分子量為47. 18kD。
[0016] SEQ ID Ν0· 1所示的Esflol核苷酸序列： ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCC AGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGC ACCATCACAGTCCACTCACCTGATGTGTACACGGCCCGAGGTGTTGCCATCAAGGTTACAGGAGTAGCTCAGGTCAA AATCAACACCCAGCATCCCAAGGTCCTGGCGATGGCTTG