一種用于對蝦細(xì)胞的病毒啟動子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)重組表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于對郵細(xì)胞的啟動 子。
【背景技術(shù)】
[0002] 對郵病毒病的頻繁爆發(fā)一直是困擾對郵養(yǎng)殖業(yè)并亟待解決的一個難題，而對郵永 生性細(xì)胞系是分離和純化對郵病毒、研究病毒的致病機(jī)理、發(fā)展有效的診斷試劑和防控技 術(shù)W及生產(chǎn)高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。盡管國內(nèi)外專家學(xué)者在對郵細(xì)胞的 體外培養(yǎng)和建系上進(jìn)行了大量的探索和不懈的努力，但目前對郵的細(xì)胞培養(yǎng)仍然處于原代 培養(yǎng)水平，永生性的細(xì)胞系一直未能成功建立。
[0003] 對郵細(xì)胞建系失敗的主要原因是體外培養(yǎng)對郵細(xì)胞的有絲分裂相極低，甚至不分 裂。已有人嘗試電離福射和化學(xué)誘變劑處理，W及將對郵細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，向培養(yǎng)基 中添加各種生長因子，等等，試圖誘導(dǎo)對郵細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化，但都沒有成功。由于在哺乳動 物細(xì)胞中，人們可W通過過表達(dá)癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因，成功誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生永生 性轉(zhuǎn)化。因此，1995年，Tapay等首次嘗試將猿猴病毒40 (SV40)大T抗原基因（SV40T)轉(zhuǎn) 染到南美藍(lán)對郵（Penaeusstylirostris)原代培養(yǎng)類淋己細(xì)胞中，雖然觀察到細(xì)胞變圓， 貼壁不緊，生長速度變快等轉(zhuǎn)化特征，但未能成功得到永生性對郵細(xì)胞系。隨后，Claydon 和0wens(2008)又嘗試將病毒（papillomavirus,HPV)癌基因E6andE7轉(zhuǎn)染到小龍郵 K虹taxqua化icarinatus)血細(xì)胞中，也未獲成功?；龋?008,2010)又利用逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體介導(dǎo)SV40T基因在中國對郵原代培養(yǎng)類淋己細(xì)胞和卵巢細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染。Shike等 (2000)又檢測了 4種哺乳動物來源啟動子在驅(qū)動巧光素酶報告基因在對郵細(xì)胞中表達(dá)上 的活性，運4個啟動子包括熱休克蛋白70化sp70)、桿狀病毒早期基因啟動子（IE-I)、莫洛 尼鼠白血病病毒（MMLV)和鳥勞氏肉瘤病毒巧SV)長末端重復(fù)序列化TR)啟動子。
[0004] 遺憾的是，W上研究最后都沒有成功實現(xiàn)對郵細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化。失敗的主要原 因可能與其采用哺乳動物來源基因和啟動子，導(dǎo)致在對郵細(xì)胞中不親和W及表達(dá)效率低有 關(guān)。體外培養(yǎng)對郵細(xì)胞難W被轉(zhuǎn)染，外源基因的整合與表達(dá)效率低，是與其細(xì)胞分裂不活躍 有關(guān)值ean等，2005)。運可能也是導(dǎo)致哺乳動物來源的許多強(qiáng)啟動子在對郵細(xì)胞中活性低 甚至無活性的主要原因。由此，有必要提供一種有效的適用于對郵細(xì)胞的啟動子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于對郵細(xì)胞的啟動子，用于對郵細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，從而彌 補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種啟動子，該啟動子的核巧酸序列為SEQIDN0:2。
[0007] 上述的啟動子用于構(gòu)建真核表達(dá)載體，該表達(dá)載體可使外源目的基因在對郵細(xì)胞 中高效表達(dá)。
[000引本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在對郵細(xì)胞中表達(dá)外源基因的方法，是用上述表達(dá)載體 將外源目的基因?qū)雽︵]細(xì)胞中。
[0009] 因為對郵細(xì)胞不分裂，難W轉(zhuǎn)染，故驗證所構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒是否能正確表達(dá)存在困 難。應(yīng)用本發(fā)明所設(shè)計的啟動子的表達(dá)載體則可W很好地解決此問題。當(dāng)此載體的外源基 因是報告基因或含有報告基因的融合蛋白時，該載體可通過在哺乳動物細(xì)胞中的報告基因 表達(dá)來驗證其質(zhì)粒構(gòu)建的成功與否，然后將構(gòu)建成功的質(zhì)粒用于對郵細(xì)胞轉(zhuǎn)染，提高對郵 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功率，減少對郵細(xì)胞原代培養(yǎng)物的浪費，節(jié)約時間和成本，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的 不足。
【附圖說明】
[0010] 圖1 :啟動子Piei/2。。。的PCR擴(kuò)增和3種表達(dá)載體的構(gòu)建。A，PW/2。。。啟動子的PCR 擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)測序驗證，結(jié)果正確。B，pcDNA-Pc"-eGFP質(zhì)粒圖譜。C，pcDNA-Pc"-Pw/2DDD-eGFP 的質(zhì)粒圖譜。D，pcDNA-APemv-Piel/2000-eGFP(無Pemv啟動子）的質(zhì)粒圖譜。
[00川圖 2 :3 種表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2<Me-eGFP(C和Cl)轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞Plat-GP的巧光表達(dá)結(jié)果。A、B和 C為轉(zhuǎn)染后4她的光鏡照片。AUBl和Cl為轉(zhuǎn)染后4她的巧光照片。
[001引圖3 :3種表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APe"-Pw/2DDD-eGFP(C和Cl)轉(zhuǎn)染哺乳動物神經(jīng)瘤細(xì)胞化uro2A的巧光表達(dá)結(jié)果。 A、B和C為轉(zhuǎn)染后4她的光鏡照片。AU Bl和Cl為轉(zhuǎn)染后4她的巧光照片。
[001 引 圖 4 :3 種表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2e<M-eGFP(C和Cl)轉(zhuǎn)染魚類細(xì)胞FG的巧光表達(dá)結(jié)果。A、B和C為轉(zhuǎn)染 后4她的光鏡照片。AUBl和Cl為轉(zhuǎn)染后4她的巧光照片。
[0014]圖 5 :表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-Piei/2000-eGFP (A和Al)和pcDNA- A Pcmv-Piel/2000-eGFP度 和BI)轉(zhuǎn)染對郵類淋己組織原代培養(yǎng)細(xì)胞后，未見明顯巧光信號。A和B為轉(zhuǎn)染后4她的光 鏡照片。Al和Bl為轉(zhuǎn)染后48h的巧光照片。
[001引圖：6 :對郵WSSV病毒iel基因啟動子Pw/2。。。的序列及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析， 長度2000bp。
[001引圖7康達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pemv-mCherry的圖譜。
[0017]圖8 :PCR擴(kuò)增mCher巧基因編碼區(qū)和突變啟動子Piei/519的電泳結(jié)果。M，DNAmarker。泳道1為mCherry基因擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2為啟動子Pw/519擴(kuò)增產(chǎn)物。
[001 引圖 9:表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pemv-Piei/519-mCher巧的圖譜。
[001 引 圖 10 :表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-Piei/sig-mOierry(A和Al)和pcDNA-Pcmv-mOierry度和BI)轉(zhuǎn)染哺乳動物神經(jīng)瘤細(xì)胞，可觀察到強(qiáng)紅色巧光表達(dá)，且前者（Al)巧光比后者度1)弱。 A和B為光鏡照片。Al和Bl為巧光照片。
[0020]圖11:表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Pcmv-mCher巧(A和Al)和pcDNA-Pcmv-Piei/519-mCher巧度和BI)轉(zhuǎn)染對郵原代培養(yǎng)類淋己細(xì)胞后，前者無紅色巧光表達(dá)，后者有紅色巧光表達(dá)。A和B 為光鏡照片。Al和Bl為巧光照片。
【具體實施方式】
[002。 申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，對郵WSSV病毒的iel基因啟動子片段（核巧酸序列SEQID NO:I)不能驅(qū)動外源基因在對郵細(xì)胞中有效表達(dá)，因此，申請人對該啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點進(jìn)行了詳盡的分析，并選擇性地對其進(jìn)行了截短。改進(jìn)后的對郵WSSV病毒iel基因啟 動子片段（核巧酸序列S