對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中反硝化微生物的定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中的反硝化微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)的方法，屬于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該技術(shù)用于測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖沉積物中反硝化 微生物的數(shù)量。 技術(shù)背景：
[0002] 我國(guó)是世界第一的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)和水產(chǎn)品貿(mào)易大國(guó)，2012年水產(chǎn)品總量就達(dá)到了 5907. 68萬噸，約占全球總量的38%，連續(xù)24年位居世界首位。為了提高單位產(chǎn)量，養(yǎng)殖 過程中往往過量投入肥料、餌料等，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中殘餌、動(dòng)物排泄物及尸體不斷堆積，碳、 氮、磷的含量超標(biāo)，富營(yíng)養(yǎng)化程度嚴(yán)重，養(yǎng)殖生物頻繁發(fā)生病害或死亡。這不但降低了養(yǎng)殖 業(yè)的產(chǎn)量和質(zhì)量，還污染了養(yǎng)殖環(huán)境，并隨著養(yǎng)殖環(huán)境廢水的排放影響到周邊環(huán)境。對(duì)養(yǎng)殖 生物和環(huán)境的危害最大的物質(zhì)是含氮化合物，如氨氮、亞硝酸根、硝酸根等，有效去除含氮 污染物是保證水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提。
[0003] 在氮素循環(huán)中，消除氮污染、降低富營(yíng)養(yǎng)化主要依賴反硝化過程。反硝化過程大 致可分為四步：N0 3 - N0 2 - N0 - NO 2- N 2，這四步都由反硝化微生物進(jìn)行。反硝化微生 物是一類能夠把硝態(tài)氮（N03-N)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮（N 2)的微生物群落，地理分布比較廣泛，在 土壤、海洋、河口、湖泊等自然環(huán)境和廢水處理廠、堆肥、生物反應(yīng)器等人工環(huán)境中都有發(fā) 現(xiàn)。在系統(tǒng)發(fā)育上，具有很高的多樣性，分屬于假單胞菌屬（P seudomonaceae)、芽孢桿菌屬 (Bacillu s)、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligene s)等多個(gè)屬；在營(yíng)養(yǎng)方式上，分為異養(yǎng)型和自養(yǎng)型， 大部分屬于異養(yǎng)型，有一些只利用一種碳源，還有一些能夠利用氫氣（H2)、二氧化碳（C0 2) 或其他物質(zhì)進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)；在需氧情況上，分為好氧型和厭氧型，之前一直認(rèn)為反硝化微生 物參與反硝化作用需要在厭氧的條件下，隨著研究的進(jìn)一步開展，好氧反硝化微生物也不 斷被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)階段對(duì)反硝化微生物的數(shù)量測(cè)定技術(shù)水平有限，傳統(tǒng)的富集培養(yǎng)方法僅能得 到環(huán)境中小于1 %的微生物，無法用于對(duì)反硝化微生物的研究和定量。分子生態(tài)學(xué)上常用的 16S rRNA基因，由于反硝化微生物系統(tǒng)發(fā)育廣泛的多樣性，也無法設(shè)計(jì)特異性引物，用來研 究和檢測(cè)其群落組成、分布和數(shù)量。
[0004] 在反硝化過程的四個(gè)步驟中，由亞硝酸鹽（N02)轉(zhuǎn)化為一氧化氮（N0)的過程，是 反硝化作用有別于其它硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng)，是反硝化過程中最重要的限速步驟，亞 硝酸鹽還原型反硝化微生物也被作為代表性種類，被廣泛用于反硝化微生物種群組成和數(shù) 量的研究。亞硝酸鹽還原酶（Nir)是催化此反應(yīng)的限速酶，可作為分子標(biāo)記對(duì)反硝化微生 物進(jìn)行定量研究。亞硝酸鹽還原酶存在于細(xì)胞周質(zhì)中，有兩種類型，一種是可溶性含銅酶 (Cu-Nir)，含有Cu催化中心，稱為Cu型亞硝酸鹽還原酶，由nirK基因編碼；另一種是細(xì)胞 色素還原酶（cdl-Nir)，含有細(xì)胞色素c和dl，稱為Cyt cdl型亞硝酸鹽還原酶，由nirS基 因編碼。兩種酶功能相同，但結(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)不同，而且不能共存于同種細(xì)胞中。在同一環(huán) 境中，含有兩種Nir酶的微生物同時(shí)存在。
[0005] 現(xiàn)有的研究和報(bào)道多集中于對(duì)nirS基因的研究，也有少量對(duì)nirK基因的報(bào)道。 在李敬源等[1]對(duì)典型對(duì)蝦水體中參與硝化與反硝化過程的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，使 用PCR-DGGE的方法，對(duì)蝦塘的8個(gè)站位構(gòu)建nirS基因文庫，并通過RFLP對(duì)克隆文庫進(jìn)行 酶切分析；研究結(jié)果顯示，典型蝦塘養(yǎng)殖水體中nirS基因文庫群落結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，多樣性 豐富。在宋亞娜等 [2]對(duì)稻田土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落對(duì)氮肥水平響應(yīng)的研究中，使用 PCR-DGGE結(jié)合DNA克隆測(cè)序和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)反硝化細(xì)菌nirS基因進(jìn)行檢測(cè)，分析 田間定位試驗(yàn)第4年不同氮肥水平下，稻田nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化；結(jié) 果表明，稻田表層土壤的nirS型反硝化細(xì)菌群落對(duì)氮肥水平提高的響應(yīng)程度更為明顯。在 程占冰等 [3]對(duì)淡水富營(yíng)養(yǎng)型湖泊沉積物nirS基因的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育的研究中，構(gòu)建了 nirS基因文庫，并使用RFLP技術(shù)對(duì)基因文庫進(jìn)行分析，測(cè)定序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；結(jié)果 顯示，武漢東湖淡水富營(yíng)養(yǎng)型湖泊沉積物中nirS基因多樣性較為豐富，且TN、NH 4+和N03的 濃度可能是影響nirS類反硝化微生物多樣性和空間分布的重要因素之一。在曾希柏等 [4] 對(duì)設(shè)施菜地nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度受施肥影響的研究中，使用T-RFLP和實(shí)時(shí) 熒光定量PCR的方法，對(duì)不同施肥條件不同土層下nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的變 化進(jìn)行研究；結(jié)果表明，施肥對(duì)土壤中nirK型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)具有明顯的影響，土 壤pH值、有機(jī)質(zhì)及硝酸鹽含量均影響nirK型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度。但是，單獨(dú)對(duì) 某一種類型Nir基因的檢測(cè)必然會(huì)損失另一種類型微生物的信息，不能全面反映反硝化微 生物的種群組成和數(shù)量。只有同時(shí)檢測(cè)nirK和nirS基因的數(shù)量，才能得到反硝化微生物 全面而準(zhǔn)確的數(shù)量信息。
[0006] 本發(fā)明使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中的反硝化微生物。 qPCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過檢測(cè)整個(gè)過程中熒光信號(hào)的累積來實(shí)時(shí) 監(jiān)測(cè)PCR過程。qPCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、全封閉不易污染、特異性強(qiáng)、重復(fù) 性好、靈敏度高、通用性好等優(yōu)點(diǎn)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)反硝化微生物功能基因 nirK和nirS進(jìn)行定量研究，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確的對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中兩種不同類型反硝 化微生物的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，全面分析養(yǎng)殖環(huán)境中反硝化微生物的數(shù)量，對(duì)解決水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán) 境氮素污染及富營(yíng)養(yǎng)化問題具有重大意義。
[0007] 參考文獻(xiàn)
[0008] [1]李敬源，林煒鐵，羅劍飛，田國(guó)梁.典型對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中參與硝化與反硝化過 程的微生物群落結(jié)構(gòu).微生物學(xué)報(bào)，2012, 52(4) :478-488.
[0009] [2]宋亞娜，吳明基，林艷.稻田土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落對(duì)氮肥水平的響 應(yīng)?中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,46(9) :1818-1826.
[0010] [3]程占冰，楊江科，李鶴，朱兵，陳相軍，閆云君.淡水富營(yíng)養(yǎng)型湖泊沉積物亞硝 酸還原酶基因（nirS)的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育.微生物學(xué)報(bào)，2011，51 (5) :667-675.
[0011] [4]曾希柏，王亞男，王玉忠，白玲玉，李蓮芳，段然，蘇世鳴，吳翠霞.施肥對(duì)設(shè)施 菜地nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)2014, 25(2) :505-514.

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反硝化微生物的方法。使用實(shí) 時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)反硝化微生物編碼亞硝酸鹽還原酶的功能基因nirK和nirS進(jìn)行 定量研究，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中反硝化微生物快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量研究。實(shí)現(xiàn)本 發(fā)明的過程主要包括以下步驟：
[0013] 1、宏基因組DNA的提取
[0014] 沉積物樣品宏基因組DNA使用土壤DNA快速提取試劑盒，在核酸提取儀上提取，操 作方法如下：稱取0. 3g樣品，加入到裂解反應(yīng)管中，向管中加入1100 y 1裂解緩沖液。裂解 反應(yīng)管放入核酸提取儀中，設(shè)定速度4. 5,時(shí)間30s，進(jìn)行裂解。結(jié)束后在4°C，13000rpm離心 15min，上清移入新的離心管，加250 y 1蛋白沉淀緩沖液，混勾；4°C，13000rpm離心5min，上 清移入新的離心管中，加入1000 y 1已經(jīng)搖勻的懸浮液，顛倒混勻2min，放于管架上4°C靜 置3min。吸出600 y 1上清丟棄，混勻后液移入純化柱中，4°C，llOOOrpm離心lmin，倒掉廢 液。向純化柱中加500 y 1加入無水乙醇的洗滌緩沖液，4°C，llOOOrpm離心lmin，倒掉廢液， 重復(fù)三次，4°C，llOOOrpm離心2min。將純化柱放入新的1. 5ml離心管中，室溫干燥5min。 純化柱加入溶解緩沖液，55°C水浴6min，4°C，llOOOrpm離心lmin，即得到待測(cè)樣品的宏基 因組DNA。使用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，存于-80°C備用。
[0015] 2、特異性引物的確定
[0016] 目前，針對(duì)nirK和nirS基因設(shè)計(jì)的特異性引物有很多，如nirK基因特異性引 物：FlaCu/R3Cu、FlaCu/nirK3R、FlaCu/nirK5R、nirKlF/R3Cu、nirKlF/nirK3R、nirKlF/ nirK5R 等；nirS 基因特異性引物：cd3aF/R3cd、cd3aF/R4cd、cd3aF/nirS4R、cd3aF/nirS6R、 nirSlF/R3cd、nirSlF/nirS6R、nirSlF/nirS4R、nirS3F/nirS6R 等，這些引物分別匹配基因 的不同保守位點(diǎn)，并且擴(kuò)增出來的基因片段大小不同。在選擇引物時(shí)，考慮到所研究的水產(chǎn) 養(yǎng)殖環(huán)境中硝酸根、亞硝酸根等含量偏高的特點(diǎn)，并且已報(bào)道的反硝化微生物絕大部分屬 于變形細(xì)菌、假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、微球菌等菌屬。我們經(jīng)過試驗(yàn)后，最終確定了擴(kuò)增nirK 基因的引物為FlaCu/R3Cu，擴(kuò)增nirS基因的引物為cd3aF/R3cd。
[0017] 3、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
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