肺癌的分類和可行性指數(shù)的制作方法
【專利說明】肺癌的分類和可行性指數(shù)
【背景技術(shù)】
[0001] 肺癌是男性和女性中癌癥死亡的主要病因。其是一種快速生長且高度致命的疾 病。接近60%診斷患有肺癌的人在診斷一年內(nèi)死亡，且約75%在2年內(nèi)死亡。肺癌有兩種 主要類型：小細胞肺癌（SCLC)和非小細胞肺癌（NSCLC)。約85 %的肺癌是NSCLC。NSCLC 有3種亞型，其大小、形狀和生物化學(xué)組成不同。全部肺癌中的約25-30%是鱗狀細胞癌。 腺癌（例如細支氣管肺泡癌）占肺癌的約40%，且通常在肺的外部區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。大細胞未 分化癌占全部肺癌的約10-15%。
[0002] SCLC和NSCLC以極其不同的方式治療。SCLC主要用單獨或與放射組合的化學(xué)療 法治療。與用于SCLC的治療相比，手術(shù)是治愈NSCLC的唯一可靠方法。淋巴結(jié)也被移出以 評估癌癥的擴散。除了手術(shù)之外，化學(xué)療法也可以用于治療NSCLC。
[0003] 數(shù)量增長的治療方案變得可用于肺腺癌。然而，在許多情況下，治療方案各自僅有 效對抗具有特定遺傳變異的肺癌。因此，可檢測許多不同特定可行的遺傳變異的測試對肺 癌患者將具有顯著價值。然而，目前可供使用的多種基因變異性分析所需的組織遠超出可 從典型腫瘤活檢或切除術(shù)獲得的組織。此外，測試不可用于許多遺傳變異，且不存在可基于 許多已知可行的遺傳變異的全面掃描來推薦治療的工具。
[0004] 所公開的組合物、試劑盒和方法提供了利用單個肺癌樣品對單個組中的肺癌進行 全面基因變異性篩選。所篩選的基因變異體具有可行的治療或已知對某些治療并不良好反 應(yīng)。這形成了本文提供的可行的治療建議框架的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供方法、組合物和試劑盒。在一個實施例中，提供一種為經(jīng)診斷患有肺 癌的受試者確定可行的治療建議的方法。所述方法包含：從所述受試者獲得生物樣品；使 用一組與以下各者雜交且擴增以下各者的探針來檢測至少一種變異體：EGFR、ALK、R0S1、 KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2KI、TP53、 STK11、CTNNBI、SMAD4、FBXW7、NOTCH I、KIT/P⑶FRA、PIK3CA、AKT1 和 HRAS 基因，從而檢測至 少一種變異體；基于所檢測的所述至少一種變異體，為所述受試者確定可行的治療建議。
[0006] 所述方法包含：接觸來自受試者的生物樣品；使用一組與以下各者雜交且擴增以 下各者的探針來檢測至少一種變異體：EGFR、ALK、R0S1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、 RET、FGFRl、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STKl I、CTNNBl、SMAD4、FBXW7、 NOTCHl、KIT/P⑶FRA、PIK3CA、AKTl、BRAF和HRAS基因，從而檢測至少一種變異體；基于所 檢測的所述至少一種變異體，為所述受試者確定可行的治療建議。
[0007] 在另一實施例中，本發(fā)明提供一種為經(jīng)診斷患有肺癌的受試者確定可行的治療建 議的方法，其包含：使用一組與以下各者雜交且擴增以下各者的探針來檢測來自受試者的 樣品中的至少一種變異體：ALK、ROSl、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFRl 和 KIT/PDGFRA， 從而檢測至少一種變異體；基于所檢測的所述至少一種變異體，為所述受試者確定可行的 治療建議。
[0008] 在其他實施例中，提供一種測定罹患肺癌的個體對治療的反應(yīng)的可能性的方法。 所述方法包含：測定從所述個體獲得的樣品中的至少一種基因變異體的存在或不存在，其 中所述至少一種變異體是在 EGFR、ALK、ROSl、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、 FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STKl I、CTNNBl、SMAD4、FBXW7、NOTCHl、KIT/ P⑶FRA、PIK3CA、AKTl和HRAS基因中，其中至少一種變異體的存在指示所述個體很可能或 不大可能對所述治療有反應(yīng)，其中所述治療是選自：克卓替尼，當(dāng)所檢測的所述變異體是 ALK融合體、ROSl融合體（EZR、SLC34A2、CD74和/或SDC4)、MET基因擴增時；EGFR酪氨酸 激酶抑制劑（TKI)，當(dāng)所檢測的所述變異體是EGFR(L858R、外顯子19缺失和/或G719X)時； 非EGFR TKI治療，當(dāng)所檢測的所述變異體是EGFR T790M時；MEK抑制劑，當(dāng)所檢測的所述 變異體是KRAS G12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和/或G12F時；維羅非尼，當(dāng)所檢測的所述 變異體是BRAF V600E時；不可逆泛erb抑制劑，當(dāng)所檢測的所述變異體是ERBB2外顯子20 插入時；和PIC3CA抑制劑，當(dāng)所檢測的所述變異體是PIK3CA (E545K、E545G、E545a、H1047R、 E542K 和 / 或 H1047L)時。
[0009] 在另一實施例中，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的核酸變異體的方法，其包含獲 得生物樣品；使用引物擴增至少一種選自以下各者的基因：EGFR、ALK、R0S1、KRAS、BRAF、 ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STKll、 CTNNB1、SMAD4、FBXW7、N0TCH1、KIT/P⑶FRA、PIK3CA、AKTl和HRAS基因，所述引物（a)擴 增至少一種選自以下各者的變異體：EGFR(L858R、外顯子19缺失、G719X和/或T790M)、 KRAS(G12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和 / 或G12F)、BRAF(L597R、D594H/N、V600E)、ERBB2 外顯子20插入、？11(30六伍5451(、￡5456、￡5453、1110471?和/或1110471) ;和〇3)檢測所述樣 品中所存在的至少一種核酸變異體。
[0010] 在另一實施例中，公開一種治療患者的肺腺癌的方法。所述方法包含：測試來自 所述患者的肺腫瘤樣品中的ALK、ROSl、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFRl和KIT/PDGFRA 基因中的至少一種中的變異體的存在，且向所述患者投與治療有效量的治療，其中所述治 療是：克卓替尼，當(dāng)所檢測的所述變異體是ALK融合體、ROSl融合體（EZR、SLC34A2、CD74 和/或SDC4)或MET基因擴增時；EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI)，當(dāng)所檢測的所述變異體是 EGFR(L858R、外顯子19缺失和/或G719X)時；MEK抑制劑，當(dāng)所檢測的所述變異體是KRAS G12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和/或G12F時；維羅非尼，當(dāng)所檢測的所述變異體是BRAF V600E時；和不可逆泛erb抑制劑，當(dāng)所檢測的所述變異體是ERBB2外顯子20插入時。
[0011] 在另一實施例中，本發(fā)明提供一種鑒別符合用克卓替尼、EGFRTKI、或不是EGFR TKI的治療、MEK抑制劑、維羅非尼或不可逆泛erb抑制劑治療的條件的患有肺癌的患者 的方法，其包含測試來自所述患者的肺腫瘤樣品的變異體的存在，所述變異體包含ALK融 合體、ROSl融合體（EZR、SLC34A2、CD74 和 / 或SDC4)、EGFR(L858R、外顯子 19 缺失和 / 或 T790M)、KRAS(G12C/V/D/A)，其中所述變異體中的至少一種的存在指示患者符合用所述療 法中的至少一種治療的條件。
[0012]在某些實施例中，本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含一組探針，其中所述組的探針 特異性地識別基因EGFR、ALK、ROSl、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、 FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STKlI、CTNNBl、SMAD4、FBXW7、NOTCHl、KIT/P⑶FRA、 PIK3CA、AKT1和HRAS，且其中所述組的探針可識別并區(qū)分所述基因EGFR、ALK、ROSUKRAS、 BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2KI、TP53、STK11、 CTNNBl、SMAD4、FBXW7、NOTCHl、KIT/P⑶FRA、PIK3CA、AKTl 和 HRAS 的一種或多種等位基因 變異體。
[0013] 本發(fā)明的某些實施例進一步提供一種組合物，其包含一組探針，其中所述組的探 針特異性地識別基因 EGFR、ALK、ROSl、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、 FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STKlI、CTNNBl、SMAD4、FBXW7、NOTCHl、KIT/P⑶FRA、 PIK3CA、AKT1和HRAS，且其中所述組的探針可識別并區(qū)分所述基因EGFR、ALK、ROSUKRAS、 BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFRl、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2KI、TP53、STK11、 CTNNBl、SMAD4、FBXW7、NOTCHl、KIT/P⑶FRA、PIK3CA、AKTl 和 HRAS 的一種或多種等位基因 變異體。
【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明提供用于檢測患有肺癌的受試者的多種基因和相關(guān)變異體的組合物、試劑 盒和方法。所述組合物、試劑盒和方法包括一組可雜交以鑒別基因變異體的寡核苷酸，所述 寡核苷酸通常是引物和/或探針。本文中所公開的方法提供待測定且隨后與可行的治療建 議相關(guān)聯(lián)的腫瘤的突變狀態(tài)。在某些實施例中，提供用于確定治療且治療患有肺癌的受試 者的方法。
[0015] 所公開的組合物、試劑盒和方法的一個優(yōu)點是能夠通過全面地篩選腫瘤樣品的多 種較高和/或任選地較流行率基因變異來為經(jīng)診斷患有肺癌的受試者推薦可行的治療，所 述基因變異最有可能對用于受試者的適當(dāng)臨床作用過程具有影響。在某些實施例中，通過 確定所公開的基因變異組合的突變狀態(tài)，所述方法為大于50%的肺腺癌受試者提供可行的 治療建議。這一全面篩選在單組中執(zhí)行，且因此可利用單個生物樣品執(zhí)行，由此保留有價值 的樣品。
[0016]
[0017] "肺癌"通常是指利用惡性細胞的大小和外觀分類的兩種主要類型的肺癌：非小細 胞（約80 %病例）和小細胞（約20 %病例）肺癌。肺腺癌是非小細胞肺癌（NSCLC)的最常 見亞型；其他亞型包括鱗狀細胞肺癌、細支氣管肺泡癌、大細胞癌、類癌瘤、腺樣囊性癌癥、 圓柱瘤和粘液表皮樣癌。在一個實施例中，肺癌根據(jù)I-IV期分級，其中I為早期且IV為最 晚期。
[0018] "預(yù)后"是指例如總體存活率、長期死亡率和無疾病存活率。在一個實施例中，長期 死亡率是指在肺癌診斷之后在5年內(nèi)的死亡。不過，在1、2或3年內(nèi)的預(yù)后也由于是超出 5年的預(yù)后而涵蓋在內(nèi)。
[0019] 其他形式的癌癥包括癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括實體和淋巴性癌 癥、頭頸癌（例如口腔癌、咽癌和舌癌）、腎癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺 癌、胰臟癌、胃癌、腦癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、睪丸癌、食道癌和肝癌（liver cancer)(包 括肝癌（hepatocarcinoma));淋巴瘤，包括非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma) (例如伯基特氏（Burkitt's)、小細胞和大細胞淋巴瘤）和霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma);白血病和多發(fā)性骨髓瘤。
[0020]術(shù)語"標記物"或"生物標記物"是指細胞中所表達的、癌細胞表面上所表達的或 與非癌細胞相比由癌細胞所分泌的分子（通常是蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或脂質(zhì)），且其 適用于診斷癌癥，用于提供預(yù)后，以及用于藥物對癌細胞的優(yōu)選靶向。時常，此類標記物是 與非癌細胞相比在肺癌或其他癌癥細胞中過度表達的分子，例如相較于正常細胞1倍過度 表達、2倍過度表達、3倍過度表達或更多。另外，標記物可以是在癌細胞中不適當(dāng)?shù)睾铣傻?分子，例如與在正常細胞上表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子?？商娲?，此類 生物標記物是與非癌細胞相比在癌細胞中表達不足的分子，例如1倍表達不足、2倍表達不 足、3倍表達不足或更多。另外，標記物可以是在癌癥中不適當(dāng)?shù)睾铣傻姆肿?，例如與在正常 細胞上表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。
[0021] 熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)了解，標記物可與其他標記物或測試組合用于本文中所公開的 用途（例如癌癥的預(yù)測、診斷或預(yù)后）中的任一個。
[0022] "生物樣品"包括組織切片，如活檢和尸檢樣品，以及為了組織學(xué)目的獲取的冷凍 切片。此類樣品包括血液和血液級分或產(chǎn)品（例如血清、血小板、紅細胞等）、痰液、支氣管 肺泡灌洗術(shù)、經(jīng)培養(yǎng)細胞（例如原代培養(yǎng)物、外植體和經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞）、糞便、尿液等。生物 樣品通常從真核生物體獲得，最優(yōu)選地是哺乳動物，如靈長類動物，例如黑猩猩或人類；牛； 犬；貓；嚙齒動物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鳥；爬行動物；或魚。
[0023] "活檢"是指移出組織樣品以便診斷或預(yù)后評估的過程，且是指組織樣本自身。所 屬領(lǐng)域中已知的任何活檢技術(shù)均可應(yīng)用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法。所應(yīng)用的活檢技術(shù)將 取決于待評估的組織類型（例如肺等）、腫瘤的大小和類型以及其他因素。代表性活檢技術(shù) 包括（但不限于）切除活檢、切取活檢、針活檢、手術(shù)活檢和骨髓活檢。"切除活檢"是指移 出整個腫瘤塊體，圍繞所述腫瘤塊體有較小邊緣的正常組織。"切取活檢"是指從腫瘤內(nèi)移 出楔形組織。通過內(nèi)窺鏡檢查或放射照相引導(dǎo)進行的診斷或預(yù)后可能需要"核心針活檢"或 "細針抽吸活檢"，其通常從目標組織內(nèi)獲得細胞懸浮液?；顧z技術(shù)例如論述在《哈里森內(nèi)科 學(xué)原理》（Harrison，s Principles of Internal Medicine),卡斯泊（Kasper)等人編，第 16版，2005,第70章，和整個第V部分中。
[0024] 術(shù)語"過度表達（overexpress/overexpression) "或"過度表達的"可互換地指與 正常細胞相比通常在癌細胞中以可檢測地更大水平翻譯或轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)或核酸（RNA)。所 述術(shù)語包括與正常細胞相比因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位（例如細胞 器、細胞質(zhì)、細胞核、細胞表面）以及RNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所致的過度表達。過度表達可以 使用檢測mRNA( 即，RT-PCR、PCR雜交）或蛋白質(zhì)（即，ELISA、免疫組織化學(xué)技術(shù)）的常規(guī) 技術(shù)檢測。過度表達可以是與正常細胞相比10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或更多。在某些情況下，過度表達是與正常細胞相比1倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的 轉(zhuǎn)錄或翻譯。
[0025] 術(shù)語"表達不足（underexpress/underexpression) "或"表達不足的"或"下調(diào)" 可互換地指與正常細胞相比在癌細胞中以可檢測地較低水平翻譯或轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)或核酸。 所述術(shù)語包括與對照相比因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位（例如細胞器、 細胞質(zhì)、細胞核、細胞表面）以及RNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所致的表達不足。表達不足可以使用 檢測mRNA( 即，RT-PCR、PCR雜交）或蛋白質(zhì)（即，ELISA、免疫組織化學(xué)技術(shù)）的常規(guī)技術(shù) 檢測。表達不足可以是與對照相比10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更 小。在某些情況下，表達不足是與對照相比1倍、2倍、3倍、4倍或更低水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯。
[0026] 術(shù)語"有差異地表達的"或"有差異地調(diào)節(jié)的"通常是指與至少一種其他樣品相比 在一種樣品中（在本發(fā)明的上下文中通常是與非癌性組織的樣品相比在癌癥患者中）過度 表達（上調(diào)）或表達不足（下調(diào)）的蛋白質(zhì)或核酸。
[0027] "治療性治療"和"癌癥療法"是指化學(xué)療法、激素療法、放射線療法、免疫療法和生 物制劑與小分子靶向療法。
[0028] 本文中"治療有效量或劑量"或"足夠量或劑量"意指投與其以便產(chǎn)生效應(yīng)的劑 量。確切劑量將取決于治療目的，且將是由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知技術(shù)可確定的 (參見例如，利伯曼（Lieberman),《醫(yī)藥學(xué)劑量形式》（Pharmaceutical Dosage Forms) (第1-3卷，1992);勞埃德（Lloyd),《醫(yī)藥學(xué)混配的藝術(shù)、科學(xué)和技術(shù)》(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) (1999);皮卡（Pickar)，《劑量計算》 (Dosage Calculations) (1999);和《雷明頓：醫(yī)藥科學(xué)和實踐》（Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第20版，2003，根納羅（Gennaro)編，利平科特?威廉姆斯 和威爾金斯公司（Lippincott, Williams&Wilkins)) 〇
[0029] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換地使用以指氨基酸殘基的聚合物。 這些術(shù)語適用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人 造化學(xué)模擬劑，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0030] 術(shù)語"氨基酸"是指天然存在和合成的氨基酸、以及以與天然存在的氨基酸類似的 方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳碼編碼的氨基 酸、以及后來被修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、y -羧基谷氨酸以及〇-磷酸絲氨酸。 氨基酸類似物是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)（即與氫、羧基、氨基以及R 基團結(jié)合的a碳）的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此類 類似物具有被修飾的R基團（例如正亮氨酸）或被修飾的肽主鏈，但保持與天然存在的氨 基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)但 以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物。
[0031] 氨基酸可在本文中以其通常已知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員 會（Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的單字母符號提及。同樣地，核苷酸 可通過其通常接受的單字母代碼提及。
[0032] 關(guān)于氨基酸序列，技術(shù)人員將認識到改變、添加或缺失編碼序列中的單個氨基酸 的或較小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個別取代、缺失或添加是"經(jīng)保 守修飾的變異體"，其中所述變化引起氨基酸經(jīng)化學(xué)上類似的氨基酸取代。提供功能上類似 的氨基酸的保守取代表在所屬領(lǐng)域中眾所周知。所述經(jīng)保守修飾的變異體另外為且不排除 本發(fā)明的多晶型變異體、種間同系物和等位基因。
[0033]以下八組各自含有彼此是保守取代的氨基酸：1)丙氨酸（A)、甘氨酸（G) ;2)天冬 氨酸（D)、谷氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴氨酸（K) ;5)異亮氨 酸⑴、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、繳氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W) ;7) 絲