內(nèi)切型β瓊膠酶AgaA的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及瓊膠酶，尤其是涉及一種內(nèi)切型e瓊膠酶AgaA的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊膠酶是一類微生物獲取外界碳源的工具酶，能夠?qū)⒋蠓肿拥沫傊墙到獬尚》?子的瓊膠寡糖。由于其降解瓊脂糖的屬性，因此經(jīng)常被用于DNA回收，藻類原生質(zhì)體制備等 領(lǐng)域。隨著海藻寡糖研究的興起與深入，越來越多的研究證明，瓊膠寡糖具有多種生理功 能，例如抗癌、抗炎、抗氧化、美白、增加腸道益生菌等。與傳統(tǒng)的酸堿制備法相比，瓊膠酶酶 解法高效、溫和、低耗、產(chǎn)物穩(wěn)定，是制備瓊膠寡糖的首選方法。因此，瓊膠酶具有一定的科 研與醫(yī)療保健應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切型0瓊膠酶AgaA的制備方法。
[0004] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0005] 1)瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92 的發(fā)酵；
[0006] 2)瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92發(fā)酵液的硫酸銨鹽析；
[0007] 3)AgaA粗酶液經(jīng)DEAE瓊脂糖離子層析純化；
[0008] 4)AgaA次級酶液經(jīng)CM瓊脂糖離子層析純化。
[0009] 所述Flammeovirgasp.SJP920 -瓊膠酶已于2014年11月27日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo. 10071。
[0010] 本發(fā)明從Flammeovirgasp.SJP92的發(fā)酵液中分離純化獲得內(nèi)切型0瓊膠酶，建 立了其分離純化工藝。純化后的酶純度高、活力好，為該酶能廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥等 研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011] 圖1為AgaA的SDS-PAGE與酶活染色圖。M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1 :AgaA的 SDS-PAGE;2:AgaA的酶活染色。
[0012] 圖2為pH值對AgaA活力的影響。橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為相對活力。
[0013] 圖3為溫度對AgaA活力的影響。橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為相對活力。
[0014] 圖4為AgaA的溫度穩(wěn)定性。橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為相對活力。
[0015] 圖5為薄層層析法分析AgaA的酶解產(chǎn)物。DP4 :瓊膠四糖；DP6 :瓊膠六糖；DP8 :瓊 膠八糖。
[0016] 圖6為核磁共振法分析AgaA的酶解產(chǎn)物。A為3、6_內(nèi)醚-a-L-半乳糖；B為 0 -D-半乳糖；r為還原端；nr為非還原端；a為a異頭碳；0為0異頭碳。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是：
[0019] 1、內(nèi)切型e瓊膠酶AgaA的制備與酶學(xué)性質(zhì)分析
[0020] 1. 1、瓊膠酶菌株Flammeovirga sp.SJP92 的發(fā)酵
[0021] 挑取Flammeovirgasp.SJP92單菌落于2216E培養(yǎng)基中（成分為2 %氯化鈉， 0. 3 %六水氯化鎂，0. 6 %七水硫酸鎂，0. 1 %硫酸銨，0. 02 %碳酸氫鈉，0. 03 %二水氯化?丐， 0. 05 %氯化鉀，0. 042 %磷酸二氫鉀，0. 005 %溴化鈉，0. 002 %六水氯化硒，0. 001 %檸檬酸 銨鐵，0. 1%酵母粉和0. 5%蛋白胨，pH為7. 6)，32°C下200r/min培養(yǎng)12h，即為種子液。添 加1%的種子液于含〇.2%瓊膠粉的2216￡培養(yǎng)基中（此培養(yǎng)基由2216￡液體培養(yǎng)基加入 〇.2%瓊膠粉配制而成）中，32°(：下20(^/ 1^11發(fā)酵培養(yǎng)4211，即為發(fā)酵液。
[0022] 1. 2、瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92發(fā)酵液的硫酸銨鹽析
[0023]Flammeovirgasp.SJP92的發(fā)酵液13000r/min離心收集上清。在冰浴條件下， 往發(fā)酵液上清添加硫酸銨固體粉末至飽和度為40% (硫酸銨粉末添加過程中邊添加邊攪 拌）。硫酸銨粉末溶解完全后，4°C靜置2h，13000r/min離心30min，收集上清，繼續(xù)往發(fā)酵 液上清添加硫酸銨固體粉末至飽和度為80%。待硫酸銨粉末溶解完全后，4°C靜置過夜， 13000r/min離心30min，收集沉淀。沉淀用少量20mM，pH值為7. 8的Tris'HCl緩沖液溶解， 并置于同樣的緩沖液中透析，共透析3次，每次3h。透析后的酶液即為AgaA的粗酶液。
[0024] 1. 3、AgaA粗酶液經(jīng)DEAE瓊脂糖離子層析純化
[0025] 去除DEAE瓊脂糖離子填料的保存液，加入雙蒸水，混勻成膠漿，靜置至填料沉淀， 去除上清，以此方法用雙蒸水漂洗填料5遍，完全去除填料的保存液。往填料中加入20mM， pH值為7. 8的Tris'HCl緩沖液，混勻成膠衆(zhòng)，重新靜置至填料沉淀，去除上清，以此方法用 20mM，pH值為7. 8的Tris'HCl緩沖液平衡填料5遍，充分平衡DEAE瓊脂糖離子填料。將平 衡好的DEAE瓊脂糖離子填料加入AgaA粗酶液，顛倒混勻lh，3000r/min離心，取上清，此上 清即為AgaA的次級酶液。
[0026] 1. 4、AgaA次級酶液經(jīng)CM瓊脂糖離子層析純化
[0027] 去除CM瓊脂糖離子層析填料的保存液，加入雙蒸水，混勻成膠漿，靜置至填料沉 淀，去除上清，以此方法用雙蒸水洗填料5遍，完全去除填料的保存液。往填料中加入20mM， pH值為7. 8的Tris'HCl緩沖液，混勻成膠衆(zhòng)，重新靜置至填料沉淀，去除上清，以此方法用 20mM，pH值為7. 8的Tris'HCl緩沖液平衡填料5遍，充分平衡CM瓊脂糖離子填料。將平衡 好的CM瓊脂糖離子層析填料加入AgaA次級酶液，顛倒混勾lh，3000r/min離心，取沉淀。沉 淀用少量的20mM，pH值為7. 8的Tris.HC1緩沖液混勻成膠漿裝柱。用氯化鈉濃度為0~ 〇. 3M的梯度洗脫液線性梯度洗脫，洗脫速度為1. 47mL/min，每管收集5mL。測定各管收集液 的瓊膠酶活力，并繪制酶活曲線。根據(jù)酶活曲線，將具有瓊膠酶活力的各管收集液合并，置 于3KDa超濾管中6000r/min離心濃縮，濃縮液即為AgaA的純酶液。
[0028] 1. 5、AgaA的酶學(xué)性質(zhì)
[0029] 1. 5. 1、AgaA酶活力的測定
[0030] 取1yLAgaA的純酶液與399