一種以廢棄海綿為載體的固定化芽胞漆酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶的固定化領(lǐng)域，具體涉及一種固定化芽胞漆酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(Iaccase)是一種含銅多酚氧化酶，可以氧化酚類物質(zhì)和非酚類物質(zhì)而不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，是一種理想的生物催化劑。漆酶的用途非常廣泛，在染料脫色、飲料處理，制漿漂白以及生物傳感器等方面尤顯優(yōu)勢(shì)。漆酶廣泛存在于真菌、細(xì)菌、植物和昆蟲(chóng)中。漆酶的特點(diǎn)因來(lái)源不同而略有不同。細(xì)菌漆酶的研究還不多，已有的研究表明其是一種耐熱耐堿的漆酶，在高溫堿性的環(huán)境中比其他來(lái)源的漆酶更具優(yōu)勢(shì)。芽胞桿菌屬所產(chǎn)的芽胞漆酶是最具代表性的細(xì)菌漆酶，目前仍鮮有芽胞漆酶固定化的經(jīng)驗(yàn)。因?yàn)檠堪炔皇羌?xì)胞，不是菌絲體，也不是單個(gè)蛋白質(zhì)，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞和酶的固定化技術(shù)并不完全適用于芽胞的固定化。選擇一個(gè)合適的固定化載體是芽胞固定化的第一步，然而，這個(gè)過(guò)程需要投入大量的精力。
[0003]海綿用作菌體固定化的載體仍是一種較新的嘗試。聚乙烯醇海綿，也稱為PVA吸水海綿，通常采用縮醛化、發(fā)泡成型和接枝聚合的方法制成，是眾多種海綿中的一類，在醫(yī)療、美容和清潔領(lǐng)域有廣泛運(yùn)用。然而這種材料在廢棄后通常成為了垃圾，既污染環(huán)境，也造成了資源浪費(fèi)。聚乙烯醇海綿孔徑小，吸水量大，切割制成顆粒后在水中分散性良好，將其用作固定化載體不僅解決了廢棄聚乙烯醇海綿的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)的問(wèn)題，還為酶的固定化提供了一種獨(dú)特的載體，從而使得該固定化酶在特定的應(yīng)用中顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
[0004]將芽胞固定化在廢棄海綿上，無(wú)論于海綿的廢物處理還是這種新興的耐堿耐熱的漆酶來(lái)說(shuō)，都是一種新的發(fā)明。這種固定化在廢棄海綿上的芽胞漆酶將是一種非常經(jīng)濟(jì)、極具應(yīng)用價(jià)值的固定化芽胞漆酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種固定化芽胞漆酶及其制備方法。
[0006]所述固定化芽胞漆酶通過(guò)以下步驟來(lái)制備:
[0007](I)制備芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)的芽胞；
[0008](2)海綿的預(yù)處理:將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；
[0009](3)聚乙稀亞胺涂敷與芽胞固定化:將預(yù)處理好的海綿按10 — 50mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(0.1 - 2.0mg/ml)處理3 — 12h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；
[0010](4)加入芽胞懸液使終濃度為1.0 — 10.0mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4 — 4% )，并在4 - 400C，pH 5.0 — 9.0的緩沖液，50 一 250r/min條件下固定 8 — 24h ；
[0011](5)回收:芽胞與聚乙烯亞胺接枝的海綿經(jīng)混合固定化處理后，過(guò)濾，用緩沖液沖洗I 一 5次，分別收集上清液和固定化芽胞，保藏于O — 40°C。
[0012]①將產(chǎn)漆酶的芽孢桿菌屬菌株在37°C條件下在生孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 — 7d ;
[0013]②以離心轉(zhuǎn)速為6000 - 12000r/min,離心時(shí)間為5 — 30min的條件對(duì)上述培養(yǎng)物進(jìn)行離心，收集芽孢；
[0014]③水洗芽孢O — 3次；
[0015]④水洗所得的芽孢加入溶菌酶使其終濃度為0.1 — 2.0mg/ml，在37°C條件下保溫0.5 — 3h。
[0016]⑤溶菌酶處理后，離心，先后經(jīng)IM NaCl和IM KCl洗，6000 — 12000r/min離心5 —30min收集芽孢。
[0017]⑥對(duì)芽孢進(jìn)行濕重稱量，用去離子水重懸芽孢，濃度為10mg/ml — 100mg/ml。
[0018]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(I)所述的芽孢制備方法，菌株培養(yǎng)時(shí)間為2d，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時(shí)間為lOmin，水洗芽孢I次，所加溶菌酶終濃度為lmg/ml，在37°C條件下保溫的時(shí)間為2h。
[0019]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(2)也可以不經(jīng)乙醇浸泡。
[0020]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(3)所述聚乙烯亞胺水溶液終濃度為lmg/ml，處理時(shí)間為6h。
[0021]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(4)聚乙烯亞胺涂敷的海綿、芽胞以及戊二醛的含量分別為30mg/ml，5mg/ml (濕重)以及2% (體積濃度)。
[0022]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(4)加入交聯(lián)劑后，在37°C，0.1M檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，200r/min條件下固定12h。
[0023]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(4)中可用水代替固定化過(guò)程中使用的緩沖液。
[0024]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(4)加入的交聯(lián)劑可以是碳二亞胺鹽酸鹽，其處理方法為加入碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度為0.2 — 2.0mg/ml，并使用超聲波振蕩5 —30min，使其充分散；加入芽胞懸液使終濃度為1.0 — 10.0mg/ml (濕重)，再使用超聲波處理 10 — 60min，并在 4 一 40°C,pH 5.0 - 9.0 緩沖液，50 一 250r/min 條件下固定 8 — 24h。
[0025]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，碳二亞胺鹽酸鹽的終濃度為0.4mg/ml，前后兩次超聲波處理的時(shí)間分別為1min和30min。
[0026]所述的海綿包括但不限于聚乙烯醇海綿。
[0027]所述芽胞漆酶是指芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)的具漆酶活性的芽胞，芽胞的產(chǎn)生菌株包括但不限于 Bacillus pumilus W30
[0028]所述的固定化芽胞漆酶可以應(yīng)用于染料脫色。
[0029]本發(fā)明的有益效果在于:(1)本發(fā)明提供了一種結(jié)合牢固的固定化芽胞漆酶，這種固定化芽胞漆酶在水中分散性和親水性好，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，而且體積較大，易于分離，可重復(fù)使用多次；(2)本發(fā)明提供了一種有效的芽胞漆酶固定化方法，該方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)操作條件要求不高，易于生產(chǎn)；(3)本發(fā)明提供的固定化方法可以有效解決廢棄海綿的回收再利用的問(wèn)題；(4)本發(fā)明所提供的固定化芽胞漆酶可反復(fù)應(yīng)用于染料脫色，并保持較高的脫色能力。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1:以戊二醛為交聯(lián)劑時(shí)聚乙烯亞胺的最適添加量；
[0031]圖2:以戊二醛為交聯(lián)劑時(shí)最適固定化pH ；
[0032]圖3:固定化芽胞漆酶的操作穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0033]漆酶酶活測(cè)定方法:稱取0.1g固定化芽胞漆酶置于3.5ml檸檬酸磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH 6.8)中，在37°C保溫15min，添加丁香醛連氮(0.05mM)反應(yīng)5min，然后冰水浴1min以終止反應(yīng)，取上清液在525nm處檢測(cè)吸光值。
[0034]活力按每g濕重芽胞固定后的回收活力計(jì)算，公式如下:
[0035]回收活力(U/g)= Δ A.16.V體 / ( Δ t.ε.b.m酶)
[0036]其中，ΔΑ表示反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的差；V#表示反應(yīng)體系的體積⑴表示反應(yīng)時(shí)間；ε表示摩爾消光系數(shù)，ε 525 = 6.5Χ 10 4I.πιοΓ1.cnfSb表示光程長(zhǎng)度，b =Icm ;m||為參與反應(yīng)的固定化芽胞漆酶的重量(g)。
[0037]脫色率用分光光度法在各染料的最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，各染料的最大吸收波長(zhǎng)分別為λ = 630nm(甲基綠)，λ = 435nm(甲基紅)和λ = 53Inm (酸性紅I)。
[0038]脫色率=(對(duì)照組吸光值一實(shí)驗(yàn)組吸光值)/對(duì)照組吸光值X 100%
[0039]實(shí)施例1芽胞漆酶的制備
[0040]將產(chǎn)漆酶的芽孢桿菌屬菌株在37°C條件下在生孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，以SOOOr/min的轉(zhuǎn)速對(duì)上述培養(yǎng)物離心lOmin，收集芽孢；水洗芽孢I次；水洗所得的芽孢加入溶菌酶使其終濃度為lmg/ml，在37°C條件下保溫2h ;然后離心并棄去上清，沉淀先后經(jīng)IM NaCl和IM KCl洗，8000r/min離心lOmin，對(duì)芽孢進(jìn)行濕重稱量，用去離子水重懸芽孢，濃度為100mg/ml。
[0041]實(shí)施例2固定化方法I
[0042]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為0.lmg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液于水中，使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為0.77U/g°
[0043]實(shí)施例3固定化方法2