利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗條紋花葉病甘蔗的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育甘鹿（Saccharum sp. hybrid)抗病品種的方法，具體涉及 一種利用RNAi沉默SceIF4El基因培育抗甘鹿條紋花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)的甘蔗品種的方法，即利用RNAi技術干擾甘蔗中真核翻譯起始因子基因 SceIF4El培育抗SCSMV轉基因甘蔗的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 甘鹿（Saccharum sp. hybrid)是我國乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物， 甘蔗糖占我國食糖總量的92%，占世界食糖總量的74%，甘蔗乙醇占世界生物質燃料乙醇 的60%。甘蔗花葉病是嚴重危害甘蔗生產(chǎn)的病毒性病害之一，在我國廣西、云南、廣東、海 南等地蔗區(qū)普遍發(fā)生（李文鳳等，2007 ;許東林等，2008)。甘蔗感染花葉病后，葉片出現(xiàn) 黃綠相間、大小不一的條紋，種苗萌芽率下降，分蘗減少，植株矮小，生長緩慢，品質變劣，蔗 糖結晶率下降（Joyce et al.，1998 ;Wu et al.，2012 ;Li et al.，2013)。甘鹿花葉病的病 原主要有3種，即SCSMV，甘蔗花葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus, SCMV)和高粱花葉病毒 (Sorghum mosaic virus, SrMV)，均屬于馬鈴薯 Y 病毒科（Potyviridae)(李文鳳等，2007 ; 許東林等，2008;Xu et al.，2008;熊果如等，2011)。SCMV和SrMV屬于馬鈴薯Y病毒屬 (Potyvirus)。SCSMV于1978年在美國首次發(fā)現(xiàn)并報道，1998年確定其屬于Potyviridae， 2012年國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) 將其立為該科新屬，即禾病毒屬（Poacevirus) (http://www. ictvonline. org)。SCSMV 主要 分布在中國、孟加拉、印度、日本、印度尼西亞、巴基斯坦等地，在中國甘蔗主產(chǎn)區(qū)廣西、云南 呈現(xiàn)爆發(fā)式流行，在廣東、浙江和福建等地普遍發(fā)生并廣泛傳播（Li et al.，2011)，田間發(fā) 病率達到50%時，產(chǎn)量損失高達20% (Putra et al.，2013)。
[0003] SCSMV為單鏈正義RNA病毒，基因組結構簡單，長度約為10Kb，編碼一個大的多聚 蛋白（ployprotein)，經(jīng)酶解后形成10個成熟蛋白，從N端到C端依次為：第一蛋白（P1)、 輔助成分 -蛋白酶（helper component proteinase, HC-Pro)、第三蛋白（P3)、第一個 6K 蛋 白（6K1)、柱狀內含體蛋白（cylindrical inclusion protein, CI)、第二個 6K 蛋白（6K2)、 病毒基因組末端結合蛋白（Viral Protein Genome-linked, VPg)、核內含體a蛋白（Nuclear Inclusion a protein, NIa)、核內含體 b 蛋白（Nuclear Inclusion b protein, Nib)和外 殼蛋白（Coat Protein, CP) (Riechmann et al. , 1992 ；Urcuqui-Inchima et al. , 2001) 〇另 外，在P3基因內部，在G2A7保守結構域發(fā)生移碼，編碼一個新的蛋白，為P3NPIP0(Chung et al. , 2008 ；ffei et al. , 2010 ；Vijayapalani et al. , 2012)〇
[0004] 植物病毒作為一種細胞內專性寄生物，必須借助寄主的某些特異因子，才能在寄 主體內建立侵染，完成翻譯、復制、運動等基本生命活動（Charron et al.，2008)。植物病毒 在寄主體內的翻譯是病毒完成系統(tǒng)性侵染的關鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯Y病毒科病毒 翻譯的過程中，VPg起到關鍵作用。由于該科病毒基因組的端沒有帽子結構m7GpppN(N 為任意核酸），病毒必須通過其編碼的VPg充當帽子結構與真核翻譯起始因子（Eukaryotic translation initiation factor, elF)互作，形成四聚體并招募其他因子，才能啟動病毒 RNA 的翻譯（Murphy et al.，1991，1996)。
[0005] 翻譯起始因子eIF4E是馬鈴薯Y病毒科病毒在寄主體內啟動翻譯的必須寄主因 子，長期被病毒選擇利用，在病毒生命活動中的功能具有相對的保守性和穩(wěn)定性，是病毒與 植物協(xié)同進化的產(chǎn)物（Charron et al.，2008)，這類寄主因子基因突變產(chǎn)生的隱性抗病基 因具有廣譜性和持久性（Pavan et al.，2010)。隱性抗病基因在抗病毒植物中普遍存在， 因其對病毒的廣譜抗性，被廣泛應用于作物抗病育種。最近10年，隨著病毒與寄主的互作 研究的深入，發(fā)現(xiàn)這些隱性抗病基因在生物學本質上都是與病毒互作的寄主因子基因的突 變體，如辣椒中抗馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和煙草蝕刻病毒（Tobacco etch virus, TEV)的 pvr2、抗辣椒葉脈斑駁病毒（Pepper vein mottle virus, PVMY)的 pvr6,碗 豆中抗豌豆種傳花葉病毒（Pea seed-born mosaic virus, PSbMV)的sbml等，都是與病毒 互作的寄主翻譯起始因子基因eIF4El或eIF4E2的突變體。這種抗性非常持久，辣椒的抗 PVMY的pvr6使用了 50多年，依然有效。已經(jīng)報道的12個的對馬鈴薯Y病毒具有抗性的 隱性抗病基因，其中7個自然突變產(chǎn)生的，5個是通過T-DNA基因敲除等方法產(chǎn)生的，都是 翻譯起始因子基因的突變體（Robaglia&Caranta, 2006 ;Maule et al.，2007 ;Truniger et al. , 2009) 〇
[0006] 寄主隱性抗病基因的這種因失去與病毒互作能力而產(chǎn)生對病毒廣譜抗性的功能， 為利用RNAi技術開展廣譜抗病轉基因研究奠定了生物學基礎。利用RNAi技術，已經(jīng)成功 的沉默了擬南芥、西紅柿等植物的翻譯起始因子基因，獲得了具有廣譜抗性的突變體。擬南 芥AteIF4El基因突變時，產(chǎn)生了對苜蓿黃脈病毒（Clover yellow vein virus, C1YVV)的 抗性；AteIF4E2基因突變時，突變株產(chǎn)生了對蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV)、 萬苣花葉病毒（Lettuce mosaic virus, LMV)和李痕病毒（Plum pox virus, PPV)的抗性 (Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006)。在西紅柿中，沉默SleIF4El基 因，突變株同時免疫馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和辣椒斑駁病毒（P印per mottle virus，P印MoV)兩種病毒（Piron et al.，2010)，同時沉默番茄的 SleIF4El 和 SleIF4E2 基因，突變株產(chǎn)生的對PVY、TEV、辣椒斑駁病毒（P印per mottle virus，P印MoV)、彩葉 椒病毒（Ecuadorian rocotto virus, ERV)、辣椒重型花葉病毒（Pepper severe mosaic virus, PepSMV)、辣椒黃花葉病毒（Pepper yellow mosaic virus, PepYMV)及馬鈴薯 V 病毒 (Potato virus V，PVV)共7種病毒的抗性（Mazier et al.，2011)。特別值得注意的是，在 這些具有廣譜抗性的突變體中，都出現(xiàn)了表型沒有或基本沒有發(fā)生變化，能夠正常生長發(fā) 育、完成生命周期的株系（Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006 ;Piron et al. , 2010 ；Mazier et al.,2011)〇
[0007] 甘蔗花葉病病原主要由蚜蟲以非持續(xù)性方式傳播，通過常規(guī)手段難以防止?？够?葉病一直是甘蔗育種目標之一，通過傳統(tǒng)的雜交方式，可以選育出抗花葉病的甘蔗品種。但 是，因為花期不遇、優(yōu)良基因型難以聚合、周期長等原因，很難獲得高產(chǎn)高糖等農(nóng)藝性狀與 抗花葉病聚合的基因型。由病毒自身基因介導的轉基因植株抗病性（pathogen-derived resistance，PDR) (Abel et al.，1986)的發(fā)現(xiàn)和轉基因技術的發(fā)展，使利用生物工程手 段培育抗花葉病轉基因甘蔗成為可能。PDR的原理是RNAi，RNAi技術是在真核生物體內 發(fā)生的、基于核酸序列同源性的一種基因表達調控機制。即雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)被Dicer降解為21-26nt的小干擾RNA，而后者指導同源RNA進行識別和切 害J，導致靶標mRNA的降解，從而造成基因沉默。RNAi技術已經(jīng)應用與抗花葉病轉基因甘 蔗材料的培育，但是其干擾對象主要是病毒的CP基因，由于CP基因多態(tài)性非常高，獲得 的轉基因材料僅對CP基因來源病毒株系免疫，對同一病毒的其他株系抗性不足或失去抗 性。J 〇yce(1998)將SCMV-E的外殼蛋白基因（CP)轉入甘蔗，隨機取田間發(fā)病甘蔗葉片 汁液（未明確病毒種類和株系）對突變體摩擦接種，突變體產(chǎn)生由抗到感一系列類型。 Ingelbrecht(1999)將 SrMV-H 株系的 CP 基因導入甘蔗，以 SrMV-H、