TycnbR (檢測(cè)中國(guó)番茄黃化 曲葉病毒衛(wèi)星），實(shí)現(xiàn)了這兩種病毒組分的快速同步檢測(cè)。該方法克服了常規(guī)的生物學(xué)方 法、電鏡觀察法、血清學(xué)方法及傳統(tǒng)的PCR方法在這兩種病毒組分檢測(cè)上的缺陷，只用相當(dāng) 于一次普通PCR的時(shí)間和試劑，就實(shí)現(xiàn)了番茄黃化曲葉病毒和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星 的快速同步檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 附圖是番茄黃化曲葉病毒和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的電泳檢測(cè)結(jié)果（CK :健 康番茄對(duì)照；M :標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 :番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星； 2 :番茄黃化曲葉病毒）
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)例一：
[0028] 以已知的感染番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的番茄樣 品和單獨(dú)感染番茄黃化曲葉病毒的番茄樣品為檢測(cè)對(duì)象，以健康番茄樣品為陰性對(duì)照。
[0029] 1、引物設(shè)計(jì)：
[0030] (1)根據(jù) NCBI (http : //www. ncbi. nlm. nih. R〇v/sites/entrez ? db = nucleotide)上已報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒核酸序列（GU111505)和中國(guó)番茄黃化曲葉病 毒衛(wèi)星核酸序列（AM980512)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0031] TYmF :5' -TAGTATGAGCAGCCACAGTCTA-3'
[0032] TYmR : 5'-GCAGAGAACTCCACGAGAATG-3'
[0033] TycnbF ：5'-AATGCTGGTGACTTTGffTGATG-3'
[0034] TycnbR :5'-CTCAGACACAGGGATAAGGGTA-3'
[0035] (2)引物配對(duì)及擴(kuò)增目的核酸條帶的大小如下：
[0036]
[0037] 2、總 DNA 提取：
[0038] 取IOmg番前病葉于I. 5mL離心管，加100 μ L 0· 5mol/L NaOH，勾衆(zhòng)后5000rpm離 心5min，上清液用0. lmol/L Tris-HCl (pH8. 0)稀釋100倍，取1 μ L作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。
[0039] 3、PCR 擴(kuò)增：
[0040] PCR反應(yīng)體系包括：
[0041]
[0042] 反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 45sec、53°C退火 45sec、72°C延伸 lmin， 35次循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0043] 4、電泳檢測(cè)：
[0044] 取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠在0. 5 X TBE緩沖液和120V電壓條件下電泳 40min，在0. 5 μ g/mL的溴化乙錠（EB)中染色lOmin，染色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。
[0045] 5、結(jié)果分析：
[0046] 在僅感染番茄黃化曲葉病毒的樣品中可以觀察到一條974bp的核酸條帶，在感 染番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的樣品中可以觀察到697bp和 974bp兩條核酸條帶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速同步檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的方法， 包括以下步驟： (1) 引物設(shè)計(jì)： ① 根據(jù)NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)上 已報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒核酸序列（GU111505)和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星核酸序列 (AM980512)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下： TYmF：5'-TAGTATGAGCAGCCACAGTCTA-3' TYmR：5'-GCAGAGAACTCCACGAGAATG-3' TycnbF:5'-AATGCTGGTGACTTTGWTGATG-3' TycnbR:5'-CTCAGACACAGGGATAAGGGTA-3' ② 引物配對(duì)及擴(kuò)增目的核酸條帶的大小如下： 引物組合 檢測(cè)病毒名稱 目的片段大小 TYmF/TYmR 番茄黃化曲葉病毒 974bp TycnbF/TycnbR中國(guó)番前黃化曲葉病毒衛(wèi)星 697bp (2) 總DNA提?。? 取10mg番前病葉于1.5mL離心管，加lOOyL0. 5mol/LNaOH，勾衆(zhòng)后5000rpm離心 5min，上清液用0.lmol/LTris-HCl(pH8. 0)稀釋100倍，取1yL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 (3) PCR擴(kuò)增： PCR反應(yīng)體系包括：反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min;95°C變性45sec、50-58°C退火45sec、72°C延伸lmin， 30-40次循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。 (4) 電泳檢測(cè)： 取10yLPCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠在0. 5XTBE緩沖液和120V電壓條件下電泳 40min，在0. 5yg/mL的溴化乙錠（EB)中染色10min，染色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在僅感 染番茄黃化曲葉病毒的樣品中可以觀察到一條974bp的核酸條帶，在感染番茄黃化曲葉病 毒和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星的樣品中可以觀察到697bp和974bp兩條核酸條帶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速同步檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲 葉病毒衛(wèi)星的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增中的退火溫度為52-55°C。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速同步檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲 葉病毒衛(wèi)星的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為32-35次。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速同步檢測(cè)番茄上兩種病毒組分(番茄黃化曲葉病毒及其伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星)的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。根據(jù)番茄黃化曲葉病毒和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星核苷酸序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，TYmF/TYmR，TycnbF/TycnbR，其中TYmF/TYmR組合檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒，TycnbF/TycnbR組合檢測(cè)中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星。樣品提取總DNA后，只需一次PCR，即可實(shí)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒及其伴隨的中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星兩種組分的檢測(cè)。該方法克服了傳統(tǒng)的生物學(xué)、血清學(xué)、電鏡觀察等方法上存在的問(wèn)題，與傳統(tǒng)的一次PCR檢測(cè)一種病毒的方法相比，又減少了成本，節(jié)約了時(shí)間，是一種特異、靈敏、經(jīng)濟(jì)而又方便的檢測(cè)方法。
【IPC分類】C12Q1/70, C12R1/94, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105018649
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510510760
【發(fā)明人】季英華, 胡婕, 朱葉芹, 于淦軍, 鄧金花, 趙文浩, 周益軍
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 江蘇省植物保護(hù)站
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月19日