具有促進(jìn)海參生長(zhǎng)和抗逆作用的卡拉膠寡糖及其制法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種具有促進(jìn)海參生長(zhǎng)和抗逆作用的卡拉膠寡糖及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]卡拉膠是紅藻中提取的一種海洋多糖，被主要用于藻膠產(chǎn)業(yè)，其具有較高的生物活性，如抗凝、抗病毒、降低膽固醇和抗氧化等作用，但多糖的溶解性不好，較難吸收，使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用上受到限制。目前降解多糖的方法主要有物理降解、化學(xué)降解和生物降解法?；瘜W(xué)降解和物理降解均為隨機(jī)降解，所得寡糖的分子片段不均一。微生物能夠產(chǎn)生具有獨(dú)特生理活性的酶系，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)大量可以產(chǎn)生卡拉膠降解酶的微生物，以酶法制備的寡糖，產(chǎn)物均一且硫酸基團(tuán)未被破壞，分子量相對(duì)較小，溶解度提高，易于吸收，且操作簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定性好等。
[0003]我國(guó)海參有140余種，約20種可以食用，其中以分布于黃、渤海域的海參食用價(jià)值最大，品質(zhì)最好。近年來由于需求的增加導(dǎo)致海參過度捕撈，海參的人工養(yǎng)殖業(yè)隨之興起，但人工養(yǎng)殖環(huán)境、種質(zhì)退化等因素使海參感染病害的幾率增大。在疾病防治過程中抗生素的使用，產(chǎn)生了新的致病菌，從而導(dǎo)致腸道菌群的紊亂產(chǎn)生耐藥性等等?？股氐闹T多副作用使人們開始尋找新的代替物，應(yīng)用天然活性成分代替抗生素是抑制病原微生物生長(zhǎng)的一個(gè)有效途徑。
[0004]近年來的研究顯示，卡拉膠寡糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抑制血管生成等多種生物活性。但尚未有關(guān)于利用酶法制備具有促生長(zhǎng)和抗逆性作用的卡拉膠寡糖及其應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有促進(jìn)海參生長(zhǎng)和抗逆作用的卡拉膠寡糖的制備方法及其本身。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述卡拉膠寡糖在飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:具有促進(jìn)海參生長(zhǎng)和抗逆作用的卡拉膠寡糖的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)粗酶液的制備
[0008]將卡拉膠寡糖降解菌(Cellulophaga lytica:M9)接種到液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)16-20h后以2%接種量進(jìn)行傳代，于35°C氣浴搖床上震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min，待菌株穩(wěn)定后，取發(fā)酵液于4°C條件下4000r/min離心20min，取上清液即為粗酶液；
[0009](2)卡拉膠寡糖的制備
[0010]將濃度為0.5%的卡拉膠與粗酶液和蒸餾水按照體積比為2:1:1混合，于35°C氣浴搖床上震蕩，降解36-48h，降解卡拉膠寡糖溶解在溶液中，經(jīng)透析、干燥獲得卡拉膠寡糖粉末。
[0011]優(yōu)選的，所述的步驟⑴中液體培養(yǎng)基為(w/v):k_卡拉膠0.1 %，蛋白胨0.4%，
硫酸亞鐵0.001 %，陳海水適量。
[0012]所述的卡拉膠寡糖降解菌，該菌株保藏號(hào)為=CGMCC No: 10829。
[0013]所述的卡拉膠寡糖降解菌株M9分離自中國(guó)遼寧省大連市開發(fā)區(qū)海貝廣場(chǎng)海域的浮游海藻樣品，經(jīng)生理生化及16SrDNA鑒定，該菌株分類名為Cellulophaga lytica:M9。
[0014]所述的卡拉膠寡糖降解菌株M9已于2015年6月16日提交保藏，具體保藏信息如下:
[0015]保藏單位名稱:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；
[0016]保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；
[0017]保藏日期:2015年6月16日；
[0018]保藏編號(hào):CGMCCN0.10829o
[0019]所述的卡拉膠寡糖降解菌株M9生理化特性為:革蘭氏陰性桿菌，黃色菌落，表面有不規(guī)則凸起，桿狀菌。氧化酶陽性，最適生長(zhǎng)溫度25°C _35°C，最適氯化鈉濃度0.5% -3%。
[0020]利用本發(fā)明制備方法獲得的卡拉膠寡糖的平均相對(duì)分子量為1600 ;平均聚合度為9。
[0021]本發(fā)明還要求保護(hù)卡拉膠寡糖在飼料添加劑中的應(yīng)用:將制得的卡拉膠寡糖作為添加劑伺喂海參，能夠促進(jìn)海參生長(zhǎng)和提尚海參的抗逆能力。
[0022]本發(fā)明的有益效果是:通過本發(fā)明酶解法得到的卡拉膠寡糖，其平均聚合度為9，平均分子質(zhì)量為1600，該產(chǎn)品可用于食品、飼料添加劑、保健品和生物農(nóng)藥等，用途廣泛。以該卡拉膠寡糖作為飼料添加劑飼喂海參，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)情況較好，刺堅(jiān)挺，活動(dòng)自如，攝食力強(qiáng)，該卡拉膠寡糖不但對(duì)海參生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，能夠提高海參的增長(zhǎng)率，使海參體重增加75.41%，還能夠提高海參的抗逆作用，增加其抗逆性和免疫機(jī)能，為開發(fā)新型飼料添加劑和免疫增強(qiáng)劑奠定基礎(chǔ)，是理想的海參餌料添加劑。
【附圖說明】
[0023]圖1為薄層層析分析卡拉膠寡糖降解情況圖；
[0024]圖2為卡拉膠寡糖對(duì)海參抗逆生長(zhǎng)作用的影響結(jié)果圖；
[0025]圖3為卡拉膠寡糖對(duì)海參促生長(zhǎng)作用的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例內(nèi)容。實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0027]實(shí)施例1卡拉膠寡糖降解菌(Cellulophaga lytica:M9)的選育
[0028]1、菌種的篩選:
[0029]從遼寧省大連市開發(fā)區(qū)海貝廣場(chǎng)海域取適量海藻，用無菌的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后將10 2?10 6的稀釋液進(jìn)行平板涂布，將涂布好的平板置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-60h后觀察平板，挑取周圍有凹陷或者暈圈的單菌落進(jìn)行條件優(yōu)化，最后確定實(shí)驗(yàn)菌株。
[0030]2.卡拉膠寡糖的制備
[0031](I)粗酶液制備
[0032]將菌株M9接種到液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)16_20h后以2%接種量進(jìn)行傳代，于35°C氣浴搖床上震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min，待菌株穩(wěn)定后，取發(fā)酵液于4°C條件下4000r/min離心20min，取上清液即為粗酶液；液體培養(yǎng)基為(w/v): κ -卡拉膠:0.1 % ;蛋白胨0.4%,硫酸亞鐵0.001 %，陳海水適量，pH自然。
[0033](2)卡拉膠寡糖制備
[0034]將濃度為0.5%的卡拉膠與粗酶液和蒸餾水按照2:1:1的體積比混合，于35°C氣浴搖床上震蕩降解36-48h，降解卡拉膠寡糖溶解在溶液中，經(jīng)透析、干燥獲得卡拉膠寡糖粉末。
[0035]對(duì)卡拉膠寡糖進(jìn)行總糖和還原糖含量測(cè)定，總糖測(cè)定方法采用硫酸-苯酚法，還原糖含量測(cè)定采用3，5- 二硝基水楊酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)薄層層析鑒定，結(jié)果如圖1。
[0036]經(jīng)薄層層析鑒定結(jié)果如圖1所示:左側(cè)點(diǎn)I為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，右側(cè)點(diǎn)2為卡拉膠寡糖，從圖1可得出卡拉膠寡糖分子量分布情況，所降解卡拉膠寡糖可見兩個(gè)清晰的寡糖聚合點(diǎn)，分子量大小不等，分離清晰，無拖尾現(xiàn)象；經(jīng)測(cè)定總糖和還原糖含量得出寡糖平均聚合度為9，平均分子量為1600。
[0037]實(shí)施例2卡拉膠寡糖對(duì)海參生長(zhǎng)情況的影響
[0038]1.將制得的卡拉膠寡糖粉末配合海參基礎(chǔ)飼料來飼喂海參，對(duì)海參進(jìn)行為期8周的飼養(yǎng)。早喂食，晚?yè)Q水，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水溫和室溫，24h打氧。實(shí)驗(yàn)分五組，按