一種類風(fēng)濕因子吸附劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫領(lǐng)域，特別是用于針對(duì)人血清IgG抗原的一種多克隆抗體及類風(fēng)濕因子吸附劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)是一種抗變性IgG的自身抗體，能特異地與IgGFC片段上抗原表位結(jié)合，可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型，其中IgM約占80%左右。
[0003]隨著臨床診斷的需要，IgM型試劑盒需求量大增。在檢測(cè)過程中，由于類風(fēng)濕因子屬于IgM型抗體，在不同程度上對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)起到干擾作用，特別是在弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、人幽門螺旋桿菌IgM抗體檢測(cè)中，由于存在較多類風(fēng)濕因子，IgM的檢測(cè)更易受到干擾。
[0004]目前國內(nèi)檢測(cè)IgM型抗體的試劑盒普遍使用的是捕獲法ELISA，血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM經(jīng)常和非特異性IgM以及特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM的測(cè)定。捕獲法原理是先用抗人IgM抗體包被固相載體，使血清中所有IgM均固定在固相上，經(jīng)洗滌去除IgG后，再測(cè)定特異性IgM。此方法操作復(fù)雜，靈敏度較低。
[0005]添加類風(fēng)濕因子吸附劑能夠很好地解決檢測(cè)準(zhǔn)確性低、操作復(fù)雜及靈敏度低的問題?，F(xiàn)有技術(shù)中有采用蛋白A吸附劑、戊二醛交聯(lián)IgG、熱聚IgG、疏水氨基酸免疫吸附劑等方法消除類風(fēng)濕因子等的非特異性干擾。其中，蛋白A對(duì)IgG的FC區(qū)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一大類自身抗體的清除，然而蛋白A與IgM型抗體的結(jié)合能力要顯著弱于與IgG型抗體的結(jié)合能力，特異性差，同時(shí)在其固定化和保存過程中不穩(wěn)定，易失活；熱聚IgG作為吸附劑雖然可以對(duì)RF吸附，然而其吸附能力較差；采用疏水氨基酸(如以色氨酸或苯丙氨酸)分子為配基的吸附材料，其能夠?qū)υS多自身抗體具有普遍的去除效果，然而使用該種材料作為吸附劑同樣會(huì)對(duì)特異性IgM產(chǎn)生吸附。
[0006]因此，在臨床檢測(cè)中，迫切需要制備出一種制備工藝簡便、效價(jià)高、特異性好的類風(fēng)濕因子吸附材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種抗人IgG抗原的多克隆抗體及其制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)制備工藝復(fù)雜，抗體效價(jià)低，特異性差的缺陷，能夠用于類風(fēng)濕因子吸附劑的制備。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種類風(fēng)濕因子吸附劑，能夠高效、特異性地吸附類風(fēng)濕因子，排除其對(duì)血清中IgM測(cè)定的干擾。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供了一種抗人IgG抗原的多克隆抗體，其通過如下制備方法得到:
[0010](I)制備人IgG抗原；
[0011](2)用人IgG抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫；
[0012](3)從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血；
[0013](4)依次用飽和硫酸銨鹽析法和親和層析法對(duì)血清純化，得到多克隆抗體。
[0014]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(I)中通過鹽析沉淀法、親和層析法、電泳法、等電點(diǎn)沉淀法或離子交換法(如DEAE-纖維素、CM-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-葡聚糖凝膠)中的一種或多種制備人IgG抗原；優(yōu)選的，通過鹽析沉淀法或親和層析法制備。其中，鹽析沉淀法中鹽選自硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉，優(yōu)選的，選自飽和硫酸銨，PH為4.5-5.5，抽提溫度為0-10°C。在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、PH值、離子強(qiáng)度、抽提溫度等是提取成敗的重要因素，需要經(jīng)過篩選選擇能夠得到高純度抗原的方法。
[0015]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提取人IgG抗原后，可通過透析或葡聚糖凝膠進(jìn)行脫鹽。
[0016]在本發(fā)明中，制備人IgG抗原的細(xì)胞可來自人血液，細(xì)胞的破碎按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行，例如反復(fù)凍融法、超聲破碎法、自溶法、酶處理法或表面活性劑處理法，可以根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行選取，本發(fā)明對(duì)此不作限定。
[0017]本發(fā)明所述的步驟(2)中，所述的動(dòng)物可以為本領(lǐng)域使用的制備多克隆抗體的動(dòng)物，選自:小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬、驢中的一種或兩種以上，優(yōu)選為兔、羊、豚鼠。所述免疫的方法選自皮下注射法、脾內(nèi)注射法、靜脈注射法、腹腔注射法等。步驟(2)免疫步驟中的免疫劑量可視具體動(dòng)物種類而定，優(yōu)選的免疫劑量為10-800 μ g/只/次。
[0018]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的步驟(2)包括:將步驟⑴得到的人IgG抗原的免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只動(dòng)物每次10-800 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次數(shù)多3次。優(yōu)選的，所述的初次免疫后每2周免疫I次，免疫次數(shù)為3-5次，更優(yōu)選的免疫次數(shù)為3次。
[0019]在本發(fā)明中，弗氏完全佐劑為油劑(如石蠟油或花生油)和乳化劑(如無水羊毛脂或吐溫80)及分支桿菌(如死的結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位)按比例混合而成。
[0020]本發(fā)明所述的步驟(3)中，優(yōu)選的，從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血前，還包括測(cè)定免疫后動(dòng)物的血清效價(jià)的步驟，更優(yōu)選的，所述的測(cè)定免疫后動(dòng)物的血清效價(jià)步驟在免疫后每隔1-7天進(jìn)行一次。所述的步驟(3)中從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血為處死后采血，也可以不處死。更優(yōu)選的，所述的從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血步驟包括:用頸動(dòng)脈放血的方法采血，待血液凝固，血清分離出后，離心，取上清。
[0021]本發(fā)明所述的步驟(4)中，所述的純化方法為先用飽和硫酸銨鹽析沉淀法進(jìn)行初步純化，再用親和層析法進(jìn)一步純化?，F(xiàn)有的抗體純化方法存在多種，例如硫酸銨沉淀法、辛酸沉淀法、DEAE離子交換層析法、輕基磷灰石層析法、凝膠層析法、親和層析法。不同性質(zhì)的抗體適用的純化方法不同，需要篩選出工藝簡單、能夠得到高效價(jià)抗體的方法。
[0022]本發(fā)明所述的飽和硫酸銨鹽析沉淀法包括:取步驟(3)得到的血清，加等體積的生理鹽水，再加入飽和硫酸銨溶液，0-10°C沉淀過夜，優(yōu)選為4°C沉淀過夜；10000G離心5-20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，0-10°C靜置0.5-2h，優(yōu)選4°C靜置Ih ; 10000G離心5_20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖液O-1OtC透析過夜，優(yōu)選4°C透析過夜。
[0023]本發(fā)明所述的親和層析法包括:用5-10倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；用5-10倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；將用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；用5-10倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；用2-5倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫，得到抗人IgG抗原的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述的洗脫緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(PH4.2)、檸檬酸緩沖液(pH4.5)等中的一種，所述的偶聯(lián)緩沖液為0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)、檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)等中的一種，所述的親和色譜柱為用葡萄球菌A蛋白或者鏈球菌G蛋白交聯(lián)的固相載體作為柱填料。
[0024]本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，用人IgG抗原包被，間接法ELISA檢測(cè)顯示其效價(jià)不低于1:5X105。
[0025]本發(fā)明另一方面提供一種抗人IgG抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括:
[0026](I)制備人IgG抗原；
[0027](2)用人IgG抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫；
[0028](3)從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血；
[0029](4)依次用飽和硫酸銨鹽析法和親和層析法對(duì)血清純化，得到多克隆抗體。
[0030]優(yōu)選的，所述步驟(I)中通過鹽析沉淀法、親和層析法、電泳法、等電點(diǎn)沉淀法或離子交換法中的一種或多種制備人IgG抗原；優(yōu)選的，通過鹽析沉淀法或親和層析法制備。其中，鹽析沉淀法中鹽選自硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉，優(yōu)選的，選自40% -60%飽和度的硫酸銨，pH為4.5-5.5，抽提溫度為0_10°C。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提取人IgG抗原后，可通過透析或葡聚糖凝膠進(jìn)行脫鹽。
[0031]優(yōu)選的，所述的步驟(2)包括:將步驟⑴得到的人IgG抗原的免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只動(dòng)物10-800 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次數(shù)多3次。
[0032]優(yōu)選的，所述的步驟(3)包括:測(cè)定免疫后動(dòng)物的血清效價(jià)后，用頸動(dòng)脈放血的方法采血，待血液凝固，血清分離出后，離心，取上清。
[0033]優(yōu)選的，所述的步驟(4)包括:所述的純化方法為先用飽和硫酸銨鹽析沉淀法進(jìn)行初步純化，再用親和層析法進(jìn)一步純化。所述的飽和硫酸銨鹽析沉淀法包括:取步驟(3)得到的血清，加等體積的生理鹽水，再加入飽和硫酸銨溶液，0-10°C沉淀過夜，優(yōu)選為4°C沉淀過夜；10000G離心5-20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，0-10°C靜置0.5-2h，優(yōu)選4°C靜置Ih ； 10000G離心5_20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸