一種桑黃素d的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種桑黃素D的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃是我國傳統(tǒng)藥用真菌，味甘、辛、無毒，是針層孔屬真菌火木層孔菌 (Phellinus igniarius)的子實體。桑黃寄生于楊、柳、枠及棟等樹的樹干上，為多年生。桑 黃除了具有傳統(tǒng)的治療淋病、崩漏、帶下、排毒、和胃止瀉等功效外，還具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、 保肝、抗肝硬化、抗脂質(zhì)過氧化和抗誘變等藥用功能。近年來，由于桑黃所特有的藥理活性， 使其成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，并被譽為目前國際公認的抗癌療效最好的藥用真菌之 一，在生物治癌領(lǐng)域中有效率排在第一位。
[0003] 桑黃素D是從野生桑黃子實體中分離得到的具有苯己締基化喃酬 (styrylpyrones)母核結(jié)構(gòu)的真菌代謝產(chǎn)物，該類型化合物具有較強的腫瘤細胞毒活性，對 A549和Bel7402兩種細胞的ICg。值分別為0. 010和0. 008yM。然而，野生桑黃資源極其潰 乏，人工栽培存在困難，極大的限制了資源的開發(fā)利用。因此，盡快尋找可替代資源，并進行 深入的基礎(chǔ)研究尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有桑黃資源匿乏的現(xiàn)狀，目的在于提供一種桑黃素D的制備方法， 具體針對桑黃的基源菌種進行亞硝酸誘導(dǎo)改造，從誘導(dǎo)菌株的次生代謝產(chǎn)物中得到桑黃 素D的方法。
[0005] 本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 一種桑黃素D的制備方法，包括W下步驟：
[0007] 1)菌懸液制備
[0008] 火木層孔菌菌株活化后，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選菌落形態(tài)較大、生長狀態(tài) 良好的菌株，挑取菌絲置于盛有無菌玻璃珠與生理鹽水的錐形瓶中，充分震蕩制備菌絲懸 液；
[000引。亞硝酸誘變
[0010] 取菌絲懸液2血加入到1血0. 005mol/L亞硝酸鋼溶液和2血、pH4. 4的醋酸緩沖 液混合液中，28°C水浴誘變處理60min后，終止誘變；
[0011] 扣涂平板培養(yǎng)
[0012] 取終止液均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上，置于28°C培養(yǎng)箱中暗處培養(yǎng)；
[0013] 4)挑選再生菌接種至斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)挑取優(yōu)勢菌株培養(yǎng)=代至菌體 穩(wěn)定增殖；
[0014] 5)將誘變后的優(yōu)勢菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180rpm震蕩培養(yǎng)21 天，收集發(fā)酵液，用=層紗布濾除菌絲體，發(fā)酵液過大孔樹脂柱，經(jīng)水洗、95%己醇洗脫并收 集醇提部分，旋蒸、干燥。
[0015] 本發(fā)明所述的終止誘變的具體過程為：取誘變液0. 5mL加入到ImUpH8. 6的磯酸 氨二鋼溶液中，使混合液的抑呈中性，終止誘變。
[0016] 本發(fā)明所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為；葡萄糖20g/L、蛋白腺+酵母粉7g/L、磯酸氨二 鐘Ig/L、無水硫酸儀0. 5g/L，抑自然。
[0017] 本發(fā)明所述的固體培養(yǎng)基為；液體發(fā)酵培養(yǎng)基添加2%瓊脂。
[0018] 本發(fā)明所述的火木層孔菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中屯、。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過對桑黃的基源菌種進行亞硝酸誘導(dǎo)改造，從誘 導(dǎo)菌株次生代謝產(chǎn)物中得到桑黃素D，解決了由于野生桑黃資源潰乏帶來的桑黃素D不能 得到開發(fā)利用的問題，開辟了新的桑黃素來源的替代物，為桑黃素D在抗腫瘤藥物中推廣 使用提供了技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0020] 圖1為桑黃素D對照品的液相色譜圖；
[0021] 圖2為火木層孔菌原始菌的液相色譜圖；
[0022] 圖3為火木層孔菌亞硝酸誘導(dǎo)菌的液相色譜圖；
[002引 圖4是原始菌株代謝產(chǎn)物的HPLC-MS-MS圖；
[0024] 圖5是誘導(dǎo)菌株代謝產(chǎn)物的HPLC-MS-MS圖；
[00巧]圖6是誘導(dǎo)菌株代謝產(chǎn)物5. 30min的二級圖譜。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0027] 實施例1
[0028] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對桑黃的基源菌種進行亞硝酸誘導(dǎo)改造，從誘導(dǎo) 菌株的次生代謝產(chǎn)物中得到桑黃素D的方法。
[002引 1材料與方法
[0030] 1. 1 材料
[0031] 1. 1. 1供試菌株；火木層孔菌（Phellinusigniarius)購自中國普通微生物菌種 保藏管理中屯、（CGMCC)。
[0032] 1. 1. 2 培養(yǎng)基
[0033]液體發(fā)酵培養(yǎng)基（商用馬了培養(yǎng)基）；葡萄糖（20g/L)、蛋白腺+酵母粉（7g/L)、 磯酸氨二鐘（Ig/L)、無水硫酸儀（0. 5g/L)，pH自然；
[0034] 固體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基添加2%瓊脂。
[00巧]1.2方法
[0036] 1. 2. 1亞硝酸誘變
[0037]菌懸液制備；火木層孔菌菌株活化后，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)較 大、生長狀態(tài)良好的菌株，挑取菌絲置于盛有無菌玻璃珠與生理鹽水的錐形瓶中，充分震蕩 制備菌絲懸液。
[0038] 亞硝酸誘變；取上述菌絲懸液2血加入到1血0. 005mol/L亞硝酸鋼溶液和2血、 pH4. 4的醋酸緩沖液混合液中，28°C水浴誘變處理60min。
[003引終止誘變；取上述誘變液0. 5血加入到1血、pH8. 6的磯酸氨二鋼溶液中，使混合 液的抑呈中性，終止誘變。
[0040] 涂平板培養(yǎng)；取上述終止液0. 4血均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上，將其置于28°C 培養(yǎng)箱中暗處培養(yǎng)。
[0041] 1. 2. 2菌種初篩
[0042] 挑選實驗平板上再生菌斑數(shù)占對照菌斑數(shù)量小于百分之一（平板上菌斑小于5最 適宜），接種至斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再生菌株與原始菌株在菌落生長活力和代謝顏色方 面有較大差異，連續(xù)挑曲優(yōu)勢菌株培養(yǎng)=代至菌體穩(wěn)定增殖，保存待用。
[0043] 1. 3代謝產(chǎn)物提取
[0044] 將亞硝酸誘變后的優(yōu)勢菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180巧m震蕩培養(yǎng) 21天。收集發(fā)酵液，用=層紗布濾除菌絲體，發(fā)酵液過大孔樹脂柱，經(jīng)水洗、95 %己醇洗脫并 收集醇提部分，旋蒸、干燥備用。
[0045] 1. 4代謝產(chǎn)物鑒定
[0046] 采用HPLC對優(yōu)勢菌株與火木層孔菌的代謝產(chǎn)物進行測試，實驗儀器其條件為：
[0047] Agilent1220 型液相色譜儀，EclipseXDB-C18 柱（250mmX4. 6mm，5ym)，色譜 柱流動相為甲醇-水-甲酸梯度洗脫（見下表），流速；ImL/min，柱溫30°C，檢測波長為 380nm，進樣量lOyL。
[0048]
[0049] 如圖1~3所示，W桑黃素D作對照，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前380nm(桑黃素類成分最大吸收波 長）處，色譜峰較少，而誘導(dǎo)后峰明顯增多，在保留時間12.2'的位置有桑黃素D的峰。
[0050] 儀器信息及液相條件
[0051]根據(jù)前期對桑黃素類質(zhì)譜結(jié)構(gòu)特征分析發(fā)現(xiàn)，多個化合物的質(zhì)譜裂解碎片中有m/ zl63的片斷出現(xiàn)，應(yīng)該是結(jié)構(gòu)中類咖啡酷基片段產(chǎn)生。因此在對火木層孔菌和誘變后優(yōu)勢 菌株的代謝產(chǎn)物進行HPLC-MS-MS時，手動提取能產(chǎn)生m/z163. 1子離子的成分（見圖4和 圖5, 一般認為大于llmin峰為干擾成分），明顯看出誘導(dǎo)前代謝產(chǎn)物中幾乎沒有能夠產(chǎn)生 m/z163的質(zhì)譜信息，而誘導(dǎo)后則有多個可W產(chǎn)生m/z163的信息，繼續(xù)追蹤5. 30min處的 二級質(zhì)譜（見圖6)發(fā)現(xiàn)其分子量為380,與桑黃素D的質(zhì)譜圖對照，基本一致，因此判定誘 導(dǎo)后菌株中含有桑黃素D。
【主權(quán)項】
1. 一種桑黃素D的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 菌懸液制備 火木層孔菌菌株活化后，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選菌落形態(tài)較大、生長狀態(tài)良好的 菌株，挑取菌絲置于盛有無菌玻璃珠與生理鹽水的錐形瓶中，充分震蕩制備菌絲懸液； 2) 亞硝酸誘變 取菌絲懸液2mL加入到ImL 0. 005mol/L亞硝酸鈉溶液和2mL、pH 4. 4的醋酸緩沖液混 合液中，28 °C水浴誘變處理60min后，終止誘變； 3) 涂平板培養(yǎng) 取終止液均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上，置于28°C培養(yǎng)箱中暗處培養(yǎng)； 4) 挑選菌斑數(shù)小于5的再生菌接種至斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)挑取優(yōu)勢菌株培養(yǎng) 三代至菌體穩(wěn)定增殖； 5) 將誘變后的優(yōu)勢菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180rpm震蕩培養(yǎng)21天，收 集發(fā)酵液，用三層紗布濾除菌絲體，發(fā)酵液過大孔樹脂柱，經(jīng)水洗、95%乙醇洗脫并收集醇 提部分，旋蒸、干燥。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑黃素D的制備方法，其特征在于：所述的終止誘變的 具體過程為：取誘變液0. 5mL加入到ImUpH 8. 6的磷酸氫二鈉溶液中，使混合液的pH呈中 性，終止誘變。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑黃素D的制備方法，其特征在于：所述的液體發(fā)酵培 養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、蛋白胨+酵母粉7g/L、磷酸氫二鉀lg/L、無水硫酸鎂0. 5g/L，pH自 然。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑黃素D的制備方法，其特征在于：所述的固體培養(yǎng)基 為：液體發(fā)酵培養(yǎng)基添加2%瓊脂。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑黃素D的制備方法，其特征在于：所述的火木層孔菌 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑黃素D的制備方法，利用火木層孔菌制備菌絲懸液，加入到亞硝酸鈉溶液和醋酸緩沖液的混合液中進行誘變，將誘變液在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取優(yōu)勢菌株種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，收集發(fā)酵液，經(jīng)過濾后水洗、95％乙醇洗脫并收集醇提部分，旋蒸、干燥既得。本發(fā)明方法操作簡單，副產(chǎn)物少，為桑黃素D的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12P17/06, C12R1/645, C12N15/01
【公開號】CN104988192
【申請?zhí)枴緾N201510291698
【發(fā)明人】吳秀麗, 陳靖, 汪靜, 劉成, 余建強, 付雪艷, 張新慧, 高曉娟, 趙云生, 劉河濤
【申請人】寧夏醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月1日