一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST-CPSIT_p7的制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白 GST-CPSIT_p7的制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 衣原體科（Chlamydiaceae)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性細(xì)菌，可引起人類 和動物多種疾病。隨著對衣原體的深入研宄，1999年根據(jù)16S rRNA和23S rRNA將其劃分 為衣原體屬（Chlamydia)和嗜衣原體屬（Chlamydophila)。衣原體屬可分為沙眼衣原體 (C. trachomatis)、鼠衣原體（C.muridarum)、豬衣原體（C. suis) 3個種；嗜衣原體屬可分為 嬰鳥鵡熱嗜衣原體（C. psittaci)、流產(chǎn)嗜衣原體（C. abortus)、豚鼠嗜衣原體（C. caviae)、貓 嗜衣原體（C. felis)、獸類嗜衣原體（C. pecorum)、肺炎嗜衣原體（C. pneumoniae)6個種。 對人類影響較大的有引起沙眼衣原體（Ct)、肺炎嗜衣原體（Cpn)和鸚鵡熱嗜衣原體（Cps)。 Cps可引起禽鳥類的呼吸道疾病如鶴鵡熱（Psittacosis)，偶然可通過密切接觸傳播給人 類，發(fā)病嚴(yán)重，病死率高。其他哺乳動物如牛、羊、馬等也分離出Cps。Cps發(fā)生感染時，根據(jù) 感染部位的不同，引起不同的癥狀，如心包炎、氣囊炎、肺炎、腹膜炎、肝炎和脾炎，表現(xiàn)為發(fā) 熱、厭食、倦怠、腹瀉，偶爾可引起多器官功能衰竭和死亡。由于胞內(nèi)寄生，疾病可呈隱匿持 續(xù)性發(fā)展，如結(jié)膜炎、眼瞼炎和鼻炎。
[0003] 嬰鳥鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps)是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生、多宿 主性的人獸共患病病原體，能引起人、哺乳動物、鳥類呼吸道感染等多種疾病。Cps在宿主 細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，有獨(dú)特的發(fā)育周期，該周期包括兩個不同的發(fā)育階段：一種是細(xì)胞外的 具感染性但代謝不活躍的小而致密的顆粒結(jié)構(gòu)，稱為原體（Elementary bodys，EBs);另一 種是細(xì)胞內(nèi)的不具感染性但代謝活躍且有分裂能力的大而疏松的顆粒結(jié)構(gòu)，稱為網(wǎng)狀體 (Reticulate bodys，RBs)。由于Cps的細(xì)胞內(nèi)寄生性常引起隱性、持續(xù)性的感染，使得感染 反復(fù)迀延，造成進(jìn)行性、不可逆的病理損傷。到目前為主，Cps的致病機(jī)制尚不清楚。衣原 體產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用是衣原體致病過程中必不可少的。由此可見能否 發(fā)明一種制備鸚鵡熱嗜衣原體抗原重組蛋白的方法，并使制得的重組蛋白具有較好的免疫 原性，可用于探索Cps的致病機(jī)制的技術(shù)領(lǐng)域，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST_CPSIT_p7 的制備方法，該方法成功克隆表達(dá)了重組蛋白GST-CPSIT_p7,該蛋白具有較好的免疫原性， 用于探索Cps的致病機(jī)制的技術(shù)領(lǐng)域。
[0005] 為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0006] -種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST_CPSIT_p7的制備方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟一：構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7 :設(shè)計CPSIT_p7的特異性引物， 以Cps6BC菌株DNA為模板，PCR擴(kuò)增CPSIT_p7編碼基因，純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后酶切連接到 載體 PGEX-6P-1 上；
[0008] 步驟二：誘導(dǎo)重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7 :將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/ CPSIT_p7轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌中，并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0009] 步驟三：制備重組蛋白GST-CPSIT_p7 :將表達(dá)產(chǎn)物PCR檢測后經(jīng)GST樹脂純化得 到GST-CPSIT_p7重組蛋白。
[0010] 所述步驟一構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7,設(shè)計CPSIT_p7的特異性引 物：
[0011] 上游引物：5' -CGCGGATCCATGGGTAATTCTGGTTTTTACTT-3' ；
[0012] 下游引物：5' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAACCATTTGTTTGTTGTTTTAC-3' ；
[0013] 對CPSIT_p7區(qū)進(jìn)行預(yù)變性、變性、退火、延伸、30次循環(huán)，最后再延伸完成聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳分離聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化 后經(jīng)BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶于22°C連接3h后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-6P-l/CPSIT_p7〇
[0014] 所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件是：對CPSIT_p7區(qū)進(jìn)行94°C預(yù)變性5min后， 進(jìn)入94°C變性30s，52°C退火45s，72°C延伸120s，30次循環(huán)，末次循環(huán)后72°C再延伸2min， 終止反應(yīng)。
[0015] 所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，包括以下步驟：
[0016] a.平衡制備管：向制備管中加入200 yL GPS平衡液，2~5min后12000rpm離心 lmin，待用；
[0017] b.向PCR產(chǎn)物中加入4~5倍體積的CP Buffer，混勻后全部轉(zhuǎn)移到平衡后的制 備管中，將所述制備管置于2ml離心管中，12000rpm離心lmin，棄清液；
[0018] c.將制備管放回 2ml 離心管，加 700 μ L DNA washing Buffer，12000rpm 離心 Imin，棄清液；
[0019] d.重復(fù)步驟c;
[0020] e.將制備管放回2ml離心管，12000rpm離心2min，棄清液；
[0021] f.將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備管中央加入20-30 μ L Elution buffer或ddH20,靜置2min，12000rpm離心Imin洗脫DNA，得到純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022] 所述的步驟二中重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌中，包括 以下步驟：
[0023] a·取10μL重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7加入200 μLE·coliBL21感受態(tài) 細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合內(nèi)容物，冰浴30min ;
[0024] b. 42°C熱休克90s，立即冰浴2~3min ;
[0025] c.加入SOC培養(yǎng)基800 μ L，37°C溫和振蕩Ih ;
[0026] d. 1000 rpm離心5min，吸走600 μ L上清液，將菌液混勾后加入到含Ampicillin LB 固體培養(yǎng)基上，用接種環(huán)均勻涂布菌液，待水分充分吸收后37°C倒置培養(yǎng)并過夜，篩選陽性 克隆菌落。
[0027] 所述的步驟二中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，包括以下步驟：
[0028] 取篩選的所述陽性克隆菌落10 μ L，，接種到Ampicillin的LB固體培養(yǎng)基上，37°C 過夜培養(yǎng)，挑取單個陽性菌落于2mL含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，37°C水浴條件下， 振搖培養(yǎng)14h，同時設(shè)置空菌組和空質(zhì)粒組作為對照組，并轉(zhuǎn)種于4mL含Ampicillin LB液 體培養(yǎng)基，OD值為0. 5~0. 7時，加入IPTG誘導(dǎo)物至最終濃度為0. 2mM，30°C誘導(dǎo)表達(dá)4h， 同時設(shè)未誘導(dǎo)組作為對照組；取菌液1.0 mL 13000rpm離心30s，收集菌體沉淀，用PBS洗3 次，分別加入SDS凝膠加樣緩沖液重懸，然后100°C水浴中溫育5min，13000rpm離心5min。
[0029] 所述的步驟三中GST樹脂純化，包括以下步驟：
[0030] a.輕柔搖勻MERCK GST ^Bind樹脂懸濁液吸取3ml樹脂裝柱，待樹脂沉降后，將儲 存20%乙醇緩沖液液面降到柱床上沿以下時，用5倍體積PBS洗樹脂3遍；
[0031] b.待PBS流到柱床上沿以下，加入所述步驟二制備的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白抽提液，室 溫放置2h讓樹脂與蛋白充分結(jié)合，緩慢放掉未結(jié)合的蛋白；
[0032] c.以10倍體積PBS洗柱，收集洗滌液；
[0033] d.以 3 倍體積 IXGST Elution Buffer 洗脫得到重組蛋白 GST-CPSIT_p7〇
[0034] 一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST-CPSIT_p7的用途，所述的重組蛋白 GST-CPSIT_p7可應(yīng)用于檢測鸚鵡熱嗜衣原體感染的試劑盒中。
[0035] 所述重組蛋白GST-CPSIT_p7用作檢測鸚鵡熱嗜衣原體感染的試劑盒組分中的抗 原。
[0036] 所述抗原以膠體金或彩色膠乳標(biāo)記。
[0037] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0038] 1、本發(fā)明的一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST-CPSIT_p7的制備方法使用的引 物，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)和研宄表明其敏感性高，擴(kuò)增出現(xiàn)的目的基因片段濃度大，其靈敏性明顯高 于進(jìn)行類似設(shè)計所得出的其他引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。
[0039] 2、本發(fā)明的一種鸚鵡熱嗜衣原體重組蛋白GST-CPSIT_p