一種防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治楊樹(shù)潰瘍病的生防菌菌株及其應(yīng) 用，具體地說(shuō)涉及一種高效防治楊樹(shù)潰瘍病生防菌株木賊鐮孢CGMCC8795及應(yīng)用。 技術(shù)背景：
[0002] 楊樹(shù)及其雜交品種在世界范圍內(nèi)都有廣泛的分布，它不僅可作為人造板及纖維用 材的重要加工原料，而且對(duì)植樹(shù)造林、生態(tài)恢復(fù)、風(fēng)景綠化和防風(fēng)固沙都有著重要的作用。 楊樹(shù)潰瘍病（有性型病原菌Botryosphaeria dothidia，無(wú)性型聚生小穴殼菌DothiorelIa grearia)是中國(guó)楊樹(shù)干部病害中的主要類型，在中國(guó)華北、西北及南方楊樹(shù)栽培區(qū)均有分 布，在楊樹(shù)幼林上發(fā)生較多，危害嚴(yán)重，一般在感病品種上發(fā)病率商達(dá)80%~100%，死亡 率達(dá)30 %~50 %。楊樹(shù)潰瘍病是中國(guó)楊樹(shù)人工林重大生物災(zāi)害之一，嚴(yán)重制約了楊樹(shù)人工 林的發(fā)展。
[0003] 目前對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治主要通過(guò)調(diào)整楊樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)空間結(jié)構(gòu)及物理和化學(xué) 方法來(lái)完成。但生態(tài)系統(tǒng)空間結(jié)構(gòu)調(diào)控是一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的過(guò)程，而化學(xué)防治對(duì)于環(huán)境的污 染和破壞已成為不容忽視的問(wèn)題。在人們愈來(lái)愈關(guān)注環(huán)境安全的情況下，對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的 防治也提出了越來(lái)越高的安全要求。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)以及 生物防治技術(shù)的愈加成熟，用生物防治的方法來(lái)可持續(xù)治理?xiàng)顦?shù)潰瘍病變得更加可行。
[0004] 從楊樹(shù)林土壤中分離篩選獲得對(duì)楊樹(shù)潰瘍病病菌具有拮抗作用的生防菌株，并研 制菌株相關(guān)活菌劑，對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高效防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢，該菌株于2014年3月 4日保存在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，菌種編號(hào)為CGMCC8795。木賊鐮孢CGMCC8795是一種從楊樹(shù)林土壤中分離篩選獲得對(duì)楊 樹(shù)潰瘍病病菌具有拮抗作用的生防菌株，對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治具有重要的意義。
[0006] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述高效防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢CGMCC8795在防 治楊樹(shù)潰瘍病方面的多種應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種高效防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢CGMCC8795,在 PDA培養(yǎng)基上，CGMCC8795菌株菌落呈圓形或橢圓形，氣生菌絲初期為白色，絨毛絮狀，質(zhì)地 較為疏松，和培養(yǎng)基結(jié)合不是很緊密，易挑取，生長(zhǎng)率為6. 89mm/d，培養(yǎng)后期表面具有淺橙 黃色孢子堆。菌絲有隔，少分支。分生孢子梗分枝或在菌絲上直接形成產(chǎn)孢細(xì)胞，小型分生 孢子極少。大型分生孢子略彎，頂細(xì)胞延長(zhǎng)成鉤狀，多為3~6個(gè)分隔，大小約為（21. 57~ 44. 62) μ mX (3. 21~5. 04) μ m，但孢子堆內(nèi)的大型分生孢子多為5~7個(gè)分隔，大小為 (52. 38 ~62. 15) μ mX (3. 85 ~5. 43) μ m。對(duì)菌株 CGMCC8795 的 ITS 基因序列進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，產(chǎn)物純化后測(cè)序。測(cè)得菌株CGMCC8795的序列長(zhǎng)度為563bp。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)CGMCC8795 菌株與編號(hào)為AB425996. 1的木賊鐮孢相似度高達(dá)100%，親緣關(guān)系最近，同源性很高。 綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征以及分子鑒定結(jié)果，確定CGMCC8795菌株為木賊鐮孢（Fusarium equiseti)。本發(fā)明所述高效防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢CGMCC8795通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)、發(fā) 酵液復(fù)篩及離體組織試驗(yàn)篩選獲得。
[0008] 本發(fā)明還提供了所述高效防治楊樹(shù)潰瘍病的木賊鐮孢CGMCC8795在防治楊樹(shù)潰 瘍病上的應(yīng)用，并且可以用于制備防治植物病害的制劑。
[0009] 所述的防治楊樹(shù)潰瘍病的制劑的制備過(guò)程如下：
[0010] (1)先將菌株液體發(fā)酵：發(fā)酵條件為：接種量為4%，裝液量100mL/250mL，初始pH 值7. 0,溫度32°C，轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時(shí)間96h ;發(fā)酵培養(yǎng)基為：土豆浸汁200g/1000mL，果 糖 1%，牛肉浸粉 1. 4%，KC10. 1%。
[0011] (2)固體發(fā)酵：選用50%玉米粉與50%麥麩混合作為固體發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵條件為 10%接種量，50%的含水量，培養(yǎng)溫度為30°C。
[0012] (3)菌劑制備：將固體發(fā)酵物自然風(fēng)干后碾碎制成原粉；添加42wt%原粉，36wt% 高嶺土，12wt%吐溫20,8wt%拉開(kāi)粉，2wt%抗壞血酸制成菌劑。
[0013] 所述的菌劑還可以經(jīng)過(guò)稀釋后，直接以噴灑和灌根的方式用于防治楊樹(shù)潰瘍病。 所述的菌劑稀釋100-1000倍。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：
[0015] (1)木賊鐮孢CGMCC8795對(duì)楊樹(shù)潰瘍病病原菌具有拮抗作用，而且具有對(duì)病原菌 的作用方式多種多樣、繁殖速度快、作用效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在楊樹(shù)潰瘍病生物防治中所起到 的作用非常重要；
[0016] (2)該種菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前 旦 -5^ 〇
【附圖說(shuō)明】：
[0017] 圖1為木賊鐮孢CGMCC8795菌株菌落形態(tài)圖
[0018] 圖2為木賊鐮孢CGMCC8795菌株菌絲形態(tài)及分生孢子形態(tài)圖
[0019] 圖3為木賊鐮孢CGMCC8795菌株對(duì)楊樹(shù)潰瘍病病原菌葡萄座腔菌的平板對(duì)峙拮抗 作用圖
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 本發(fā)明提供木賊鐮孢CGMCC8795新菌株，其展現(xiàn)出對(duì)楊樹(shù)潰瘍病病原菌具有較強(qiáng) 的拮抗活性。
[0021] 本發(fā)明的新菌株分離自楊樹(shù)林土壤中。
[0022] 本發(fā)明的木賊鐮孢CGMCC8795在PDA培養(yǎng)基上，CGMCC8795菌株菌落呈圓形或橢 圓形，氣生菌絲初期為白色，絨毛絮狀，質(zhì)地較為疏松，和培養(yǎng)基結(jié)合不是很緊密，易挑取， 生長(zhǎng)率為6. 89mm/d，培養(yǎng)后期表面具有淺橙黃色孢子堆。菌絲有隔，少分支。分生孢子梗分 枝或在菌絲上直接形成產(chǎn)孢細(xì)胞，小型分生孢子極少。大型分生孢子略彎，頂細(xì)胞延長(zhǎng)成鉤 狀，多為3~6個(gè)分隔，大小約為（21. 57~44. 62) μ mX (3. 21~5. 04) μ m，但孢子堆內(nèi)的 大型分生孢子多為5~7個(gè)分隔，大小為（52. 38~62. 15) μ mX (3. 85~5. 43) μ m。對(duì)菌 株CGMCC8795的ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后測(cè)序。測(cè)得菌株CGMCC8795的序 列長(zhǎng)度為563bp。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)CGMCC8795菌株與編號(hào)為AB425996. 1的木賊鐮孢相似度 高達(dá)100%，親緣關(guān)系最近，同源性很高。綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征以及分子鑒定結(jié)果，確定 CGMCC8795菌株為木賊鐮孢（Fusarium equiseti)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的 詳細(xì)說(shuō)明，而不會(huì)限制本發(fā)明。
[0023] 實(shí)施例1 土壤中楊樹(shù)潰瘍病生防菌的分離、篩選及鑒定
[0024] 采用稀釋平板涂布法分離土壤微生物。將Ig 土壤置于裝有IOOmL無(wú)菌水的250mL 三角瓶中制成土壤懸浮液母液。將母液置于28°C搖床中震蕩lh。無(wú)菌條件下對(duì)土壤母液 進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為KT2~ΚΓ7,細(xì)菌選用10-5~10-7稀釋梯度的土壤懸濁 液進(jìn)行分離，放線菌選用10-3~10-5稀釋梯度的土壤懸濁液進(jìn)行分離，真菌選用10-2~ 10-4稀釋梯度的土壤懸濁液進(jìn)行分離。通過(guò)培養(yǎng)特性和菌落特征，判定從上中下層土壤中 中共分離微生物菌株122株，通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，從122株菌中共分離得到有抑菌效果的 菌株69株，其中細(xì)菌和放線菌36株，真菌33株。綜合"三明治"法和改良瓊脂擴(kuò)散法對(duì) 初篩菌株的發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩，篩選出的拮抗菌株有8株，分別為細(xì)菌TYZ1B3和YX5B1，真菌 LSlOFl、LX5F1、LZlOFl、LS6F1、CGMCC8795和TLZ2F2。進(jìn)行離體組織復(fù)篩后最終確定生防 菌株CGMCC8795的拮抗作用最強(qiáng)。
[0025] 篩選到的菌株經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)鑒定，最終確定該 菌為木賊鐮孢。
[0026] 本發(fā)明木賊鐮孢CGMCC8795菌株菌落和菌絲形態(tài)圖見(jiàn)圖1和圖2。
[0027] 實(shí)施例2木賊鐮孢CGMCC8795菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性
[0028] 經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析，最終確定CGMCC8795的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng) 基和條件為：土豆浸汁200g/1000mL，果糖1%，牛肉浸粉1.4%，KC10. 1%，起始pH值7. 0， 溫度32°C，轉(zhuǎn)速180r/min，接種量4%，裝液量100mL/250mL。優(yōu)化后菌株CGMCC8795的抑 菌率可達(dá)75. 88%，提高了生防菌株的抑菌活性，為菌株的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供了保障。
[0029] 木賊鐮孢CGMCC8795對(duì)酸堿處理有一定的耐受性，在pH為1的條件下，抑菌率為 47. 28%，在pH為12條件下，仍可保41. 57%的抑菌率，由此證明，木賊鐮孢CGMCC8795在酸 堿條件下均有一定穩(wěn)定性，而對(duì)高溫條件的穩(wěn)定性較弱。實(shí)驗(yàn)證明，該菌株對(duì)紫外線不具穩(wěn) 定性。經(jīng)傳代10次后，該菌株的抑菌活性仍可達(dá)68. 62%，說(shuō)明其遺傳穩(wěn)定。
[0030] 實(shí)施例3木賊鐮孢CGMCC8795生防菌劑原粉的制備
[0031] 采用固體發(fā)酵方式制備菌劑原粉。設(shè)置3種不同固體發(fā)酵基質(zhì)配方：I.固料400g， 其中碎米50%，麥麩50%，且固料與水的比例為I : 1(W/V)，II.固料400g，其中碎米50%， 玉米粉50%，且固料與水的比例為I : 1(W/V)，III.固料400g，其中麥麩50%，玉米面 50%，且固料與水的比例為I : I (W/V)。結(jié)果表明選用50%玉米粉與50%麥麩混合作為固 體發(fā)酵基質(zhì)最為適宜，抑菌率為90. 59 %，活孢子數(shù)達(dá)4. 69 X 10ncfu/g。
[003