一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的通用型引物與探針以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條檢 測(cè)技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA_LFD) 鑒定布魯氏菌的通用型引物與探針以及檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布魯氏菌屬細(xì)菌（牛種、羊種、豬種和犬種布 魯氏菌等）引起的人畜共患傳染病，也是我國(guó)法定檢疫和凈化的重要病原。近年來(lái)發(fā)病 率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，尤其是對(duì)奶畜危害極大，流產(chǎn)率高達(dá)50% -80%，乳、肉產(chǎn)量減少 10% -20%。人感染布病主要是通過(guò)接觸污染的環(huán)境、患病動(dòng)物的分泌物、體液、尸體或食 入污染動(dòng)物的產(chǎn)品引起，人感染布病后完全喪失勞動(dòng)能力，治療極其困難。根據(jù)中國(guó)CDC的 布病疫情公布，2012年布病發(fā)病人數(shù)為39515人，比2011年增長(zhǎng)3. 08%，為歷年新高。因 此，布魯氏菌病給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與穩(wěn)定、國(guó)家公共衛(wèi)生安全等構(gòu)成嚴(yán)重威脅，進(jìn)行布病的防 控與凈化是國(guó)家和人類共同的目標(biāo)。
[0003] 要進(jìn)行動(dòng)物布病防控與凈化，必須檢疫和淘汰陽(yáng)性感染動(dòng)物，所以布魯氏菌病原 學(xué)診斷就顯得非常重要。目前，對(duì)布魯氏菌病原學(xué)的診斷方法主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)、布魯氏 菌核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)等。由于細(xì)菌的分離培養(yǎng)要求在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并且耗時(shí)費(fèi) 力，成功率低。以常規(guī)PCR、熒光定量PCR等的分子生物學(xué)方法近年來(lái)受到人們的青睞，但是 其對(duì)儀器設(shè)備和條件要求較高，并且易造成氣溶膠交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性。雖然恒等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)（LAMP)可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但是其反應(yīng)時(shí)間一般在Ih左右，對(duì)結(jié)果的判定仍然存在人肉 眼的判定誤差等問(wèn)題。因此，亟需建立一種可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)、簡(jiǎn)易、快速的布魯氏菌檢測(cè)技術(shù)。
[0004] RPA技術(shù)通過(guò)三種酶的混合物，即能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單 鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)和鏈置換DNA聚合酶，在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左 右，整個(gè)過(guò)程一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能 夠?qū)⒑哿考?jí)（trace levels)的核酸（尤其是DNA)模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模 板分子得到大約1〇12擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸 的實(shí)地檢測(cè)。目前，RPA反應(yīng)可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴(kuò)增曲線和LFD試紙條三種不 同方式檢測(cè)結(jié)果，這三種方式的引物與探針?lè)磻?yīng)原理是不同的。凝膠電泳和熒光擴(kuò)增曲線 法仍然依賴實(shí)驗(yàn)室和特殊儀器設(shè)備，而LFD是一種無(wú)需特殊儀器可用于現(xiàn)場(chǎng)的方法。
[0005] 在RPA-nfo正反向引物的擴(kuò)增革巴序列中設(shè)id條帶FAM標(biāo)記的特異探針，同時(shí)反 向引物用生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記的RPA產(chǎn)物與FAM標(biāo)記的特異探針雜交、FAM標(biāo)記的特異 探針與抗FAM抗體的金標(biāo)物結(jié)合后，將該免疫復(fù)合物滴加到試紙條上，免疫復(fù)合物通過(guò)層 析膜擴(kuò)散，擴(kuò)散到檢測(cè)線時(shí)，生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢 測(cè)線，即檢測(cè)條帶。不被捕獲的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散到質(zhì)控線被特異性抗體所捕獲，形成具 有顏色的質(zhì)控線，即對(duì)照條帶。這樣RPA技術(shù)與側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合，即RPA-LFD技術(shù)，可以 通過(guò)側(cè)流層析試紙條（LFD)讀取結(jié)果，本方法既不要求特殊儀器設(shè)備，也無(wú)需復(fù)雜的樣品 處理，僅僅使用普通的加熱裝置如水浴鍋和側(cè)流層析試紙條就可以通過(guò)肉眼觀察結(jié)果。因 此，RPA-LFD技術(shù)在布魯氏菌病的現(xiàn)場(chǎng)診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種特異、靈敏、簡(jiǎn)易、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)布魯氏菌的RPA-LFD 通用型引物與探針以及含有該引物與探針的試劑盒。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明用于快速檢測(cè)布魯氏菌的RPA-LFD通用型引物與探 針，包括：
[0008] 正向引物：Brucella-RPA-LFD-F :
[0009] 5'-CAAGGTGTTGCTCTTTCTCTTTGTCGTGGGC-3'
[0010] 反向引物：Brucella-RPA-LFD-R :
[0011] 5'-(Biotin)-CGGAACTGTGCTGGTCTGCACCATCGTCTTG-3'
[0012] 探針：BrucelIa-RPA-LFD-LF :
[0013] 5' FAM-CTTTGTCGTGGGCTTCATCGTCGTGCTGCTG (dSpacer)
[0014] TGCTGCTCGTGTTTC-C3-Spacer3'
[0015] 本發(fā)明還提供含有上述引物與探針組合的用于檢測(cè)布魯氏菌的試劑盒。該試劑 盒中還包括大腸桿菌來(lái)源的recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)、 rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液、側(cè)流層析試紙條（特異性檢測(cè)生物素與 FAM標(biāo)記基因擴(kuò)增產(chǎn)物）、PBST試紙條檢測(cè)緩沖液（I X PBS+0. 1 %吐溫20)、滅菌去離子雙 蒸水（ddH20)，TE緩沖液、10%(W/ V)SDS、2%(W/V)蛋白酶K、布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板等。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的方法，具體包括以下步驟：
[0017] (1)檢測(cè)樣本DNA的提取或檢測(cè)樣本裂解處理；
[0018] (2)以步驟⑴中處理的樣本為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增；
[0019] (3)用側(cè)流層析試紙條檢測(cè)上述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣本中是否含 有布魯氏囷。
[0020] 其中，RPA反應(yīng)體系為50 yL:
[0021]
[0022] 待測(cè)樣本基因組DNA或粗裂解產(chǎn)物DNA和CldH2O共13. 2 μ L
[0023] 將上述47. 5 yL混合物加入Twi stAmp nf 〇反應(yīng)管，充分混勻、溶解，再加入2. 5 yL 醋酸鎂溶液，將反應(yīng)管置于38°C水浴中，處理25min。
[0024] 反應(yīng)結(jié)束后取2 μ L與98 μ L LFD檢測(cè)緩沖液混合，將LFD浸入上述混合液，5分 鐘內(nèi)觀察結(jié)果，若同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶，則該樣品布魯氏菌感染陽(yáng)性，僅出現(xiàn)對(duì)照 條帶則說(shuō)明該樣品中不含布魯氏菌，僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶或者無(wú)條帶則說(shuō)明RPA-LFD檢測(cè)不成 立。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0026] (1)本發(fā)明提供的RPA-LFD引物與探針組合或試劑盒靈敏性高、特異性強(qiáng)。最低 可以檢測(cè)6. OX 10°cfu的布魯氏菌，與大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙門(mén)氏 菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)。
[0027] (2)本發(fā)明提供的RPA-LFD引物與探針組合或試劑盒不僅可用于布魯氏菌菌株檢 測(cè)，還可用于臨床樣本的檢測(cè)。臨床樣本主要包括血液、奶樣、氣溶膠樣本、組織樣本等。
[0028] (3)本發(fā)明提供的RPA-LFD檢測(cè)方法使用方便，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，僅僅在38°C 下，25min就能對(duì)待測(cè)樣本的粗裂解產(chǎn)物進(jìn)行布魯氏菌的靈敏、特異、快速地檢測(cè)，適合現(xiàn)場(chǎng) 或基層布病檢疫工作。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1布魯氏菌RPA-LFD引物與探針的篩選結(jié)果，Control Primer/Probe Mix擴(kuò)增 組為T(mén)wistAmp nfo kit提供的引物、探針與模板的RPA擴(kuò)增結(jié)果對(duì)照；Brucella-RPA-LFD 組為本發(fā)明篩選出的特異性檢測(cè)布魯氏菌的通用型引物與探針的擴(kuò)增結(jié)果；NTC是以CldH2O 代替模板的陰性對(duì)照。
[0030] 圖2布魯氏菌RPA-LFD靈敏性檢測(cè)，模板分別為6 X 108cfu-6 X KT1Cfu牛種布魯 氏菌A19疫苗株基因組DNA，NTC是以CldH2O代替模板的陰性對(duì)照組。
[0031] 圖 3 布魯氏菌 RPA-LFD 特異性檢測(cè)，B. abortus、B. melitensis、B. suis、B. ovis、 B. canis、E. coli 0157:Η7、Υ· enterocolitica 0:9、Salmonella、S. aureus 的模板分別為牛 種布魯氏菌疫苗株A19株、羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株、豬種布魯氏菌株疫苗株S2株、綿 羊種布魯氏菌63/290株、犬布魯氏菌RM6/66株、大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 0:9、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA ;NTC是以CldH2O代替模板的陰性對(duì)照組。
[0032] 圖4臨床樣本布魯氏菌的RPA-LFD檢測(cè)，+ :模板為牛種布魯氏菌A19疫苗株基因 組DNA，一：以CldH2O代替模板的陰性對(duì)照組，1-12 :布魯氏菌核酸陽(yáng)性血液樣本，13-22 :布 魯氏菌核酸陽(yáng)性奶樣樣本，23 :布魯氏菌核酸陽(yáng)性流產(chǎn)胎兒樣本，24 :布魯氏菌核酸陽(yáng)性氣 溶膠樣本，25-26 :布魯氏菌核酸陰性血液樣本，27-28 :布魯氏菌核酸陰性奶樣樣本。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下述實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0034] 以下實(shí)施例均按照常規(guī)試驗(yàn)條件與方法進(jìn)行，或者按照制造廠商所建議的試驗(yàn)條 件。
[0035] 1.試驗(yàn)材料
[0036] 牛種布魯氏菌疫苗株A19株（B. abortus A19)，羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株 (B.melitensis M5-90)，豬種布魯氏菌株疫苗株S2株（B.suis S2)，綿羊種布魯氏菌 63/290 株（B. ovis 63/290)，犬布魯氏菌 RM6/66 株（B.canis RM6/66)，大腸桿菌 0157:H7、 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌0:9、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌（CMCC26003)均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 奶牛研宄中心疾病研宄室保存。
[0037] 引物與探針由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplif