用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3tc和ftc耐藥突變位點(diǎn)的引物對(duì)和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐 藥突變位點(diǎn)的引物對(duì)和探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病是一種由HIV感染引起的免疫缺陷綜合癥。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒 屬。目前發(fā)現(xiàn)的HIV病毒有HIV-I和HIV-2兩型，但世界上流行的艾滋病大多數(shù)是由HIV-I 引起的。HIV-I基因組約為9. 7kb，由兩條單鏈RNA鏈組形成二聚體?；蚪M包含gag、pol 和env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因和tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6個(gè)調(diào)芐基因，在5'末端和3'末端 為長(zhǎng)重復(fù)序列（LTR)。Gag最初表達(dá)成55Kd的蛋白前體，然后由病毒蛋白酶切割成17Kd (P17)的基質(zhì)蛋白（MA)、24Kd (p24)的衣殼蛋白（CA)、7Kd (p7)的核衣殼蛋白（NC)及pi、 p2和p6蛋白用于構(gòu)成病毒的核心結(jié)構(gòu)。Pol基因編碼蛋白酶、整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶三個(gè)病毒 主要蛋白酶用于蛋白前體的成熟、病毒基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄和病毒cDNA在宿主基因組DNA 上的整合。Env基因編碼糖基化的160Kd (gpl60)的膜蛋白，然后切割成表面糖蛋白gpl20 和跨膜糖蛋白gp41用于宿主細(xì)胞的識(shí)別和病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，同時(shí)HIV-I基因組還 編碼tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6個(gè)非結(jié)構(gòu)基因用于調(diào)控HIV-I病毒的感染、增殖與釋放 等過(guò)程。
[0003] 在HIV-I廣泛傳播，迅速蔓延而又沒(méi)有有效疫苗預(yù)防的情況下，化療藥物成為抗 HIV-I感染最有力的工具。1985年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了第一種HIV-I治療藥物齊多夫定（AZT)， 并在1987年通過(guò)了美國(guó)食品藥品管理局（FDA)的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療，到目前為止已經(jīng)有 30余種抗HIV-I藥物用于艾滋病的臨床治療。雖然抗HIV-I治療藥物的使用尤其是HAART 療法的推廣大大地降低了 HIV-I感染的死亡率，提高了 AIDS患者的生活質(zhì)量，但是HIV-I 耐藥突變的產(chǎn)生和蔓延也給HIV-I的藥物治療帶了很大挑戰(zhàn)，在很大程度上降低了 HIV-I 的治療效果。由于HIV-I的逆轉(zhuǎn)錄酶在復(fù)制過(guò)程中沒(méi)有校正功能，而且HV-I復(fù)制迅速，從 而使得HIV-I易于進(jìn)化、遺傳多樣性廣泛，為HIV-I的耐藥突變迅速產(chǎn)生提供了先決條件。 目前，對(duì)應(yīng)于每種臨床使用的HIV-I治療藥物都有其相應(yīng)的耐藥突變的產(chǎn)生。
[0004] 拉米夫定（3TC)和恩曲他濱（FTC)是目前常用的兩種HIV核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (NRTIs )，但是由于耐藥突變的產(chǎn)生大大降低了這兩種藥物的有效性。過(guò)去的研究已經(jīng)證 明引起3TC和FTC耐藥產(chǎn)生的主要耐藥突變是pol結(jié)構(gòu)基因的M184V、M184I、Q151M和K65R 四種突變。
[0005] 目前應(yīng)用于檢測(cè)HIV-I耐藥突變的方法主要是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法。該方法存在 以下缺點(diǎn)：檢測(cè)周期較長(zhǎng)，花費(fèi)昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高，由于DNA 直接測(cè)序存在的靈敏度較低(靈敏度只能達(dá)到10%)，雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)等問(wèn)題， 使得很難通過(guò)一次測(cè)序獲得精確的數(shù)據(jù)，需要多次重復(fù)測(cè)序才可能避免假陽(yáng)性等問(wèn)題，因 此直接測(cè)序方法很難適用于臨床檢測(cè)。因此，到目前為止HIV-I耐藥突變情況檢測(cè)還一直 停留在科研水平，主要用于流行病調(diào)查研究，還沒(méi)有用于臨床艾滋病患者指導(dǎo)用藥的耐藥 突變檢測(cè)的報(bào)道。
[0006] 隨著艾滋病治療過(guò)程中耐藥情況的日益加重，臨床上迫切需要開(kāi)發(fā)一種快速、準(zhǔn) 確、操作簡(jiǎn)便和避免交叉污染的HIV-I耐藥突變檢測(cè)方法，用以滿足臨床用藥和檢測(cè)診斷 方面的時(shí)效性及個(gè)體化醫(yī)療方面的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的方法 存在的靈敏度低、特異性差、操作繁瑣、檢測(cè)成本高、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種 靈敏度高、特異性好、檢測(cè)成本低、快速、簡(jiǎn)單的艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的 引物對(duì)和探針，還提供了一種包括上述引物對(duì)和探針的檢測(cè)試劑盒。
[0008] 技術(shù)方案：本發(fā)明提供的用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的 引物對(duì)和探針，包括檢測(cè)HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突變位點(diǎn) M184V、M184I、Q151M 和 K65R 的 ARMS 引物對(duì)和 Taqman 探針； M184V的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； M184I的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； Q151M的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； K65R的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示的 核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記5'端 和3'立而； 本發(fā)明還提供了另一種用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的引物對(duì)和 探針，包括檢測(cè)HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位突變位點(diǎn)M184V、M184I的ARMS引物 對(duì)和Taqman探針； M184V的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； M184I的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； 本發(fā)明還提供了另一種用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的引物對(duì) 和探針，包括檢測(cè)HIV-I病毒RNA的pol基因的第151位突變位點(diǎn)Q151M的ARMS引物和 Taqman 探針； Q151M的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記 5'端和3'端； 本發(fā)明還提供了另一種用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的引物對(duì)和 探針，包括檢測(cè)HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位突變位點(diǎn)K65R的ARMS引物和Taqman 探針； K65R的ARMS引物對(duì)的上游引物和下游引物分別SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示的 核苷酸序列，Taqman探針為SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記5'端 和3'立而； 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒，其 特征在于：包括上述的ARMS引物對(duì)和探針。
[0009] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括RT-PCR緩沖液（20mM Tris-Hcl，50mM KCL PH8. 3)、dNTPs、MgCl2、M_MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶。
[0010] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選，所述試劑盒還包括模板RNA、試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)和試劑盒質(zhì) 控品的Taqman探針，試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)的上游序列和下游序列分別為SEQ ID No. 11和 SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；試劑盒質(zhì)控品的Taqman探針為SEQ ID No. 13所示的核 苷酸序列，分別用FAM和BHQl標(biāo)記5'端和3'端。
[0011] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選，各組分含量分別為： RT-PCR緩沖液終濃度0. 5X~2X ; dNTPs 終濃度 0· 6 ~I. 2mM ; ARMS引物對(duì)的上、下游引物以及試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)的上、下游引物的終濃度均為 100 ~600nM ; M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶終濃度0. 4~2. 4U/ μ L ; TaqDNA聚合酶終濃度0· 01~0· 06U/ μ L ; MgCl2終濃度為L(zhǎng) 5~3. 5mM ; ARMS引物對(duì)的Taqman以及試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)的Taqman探針終濃度均為100~ 600nM ； 模板RNA終濃度0· 01~IOOng/ μ L。
[0012] 最優(yōu)選地，各組分含量分別為： RT-PCR緩沖液終濃度I X ; dNTPs 終濃度 0. 8mM ; ARMS引物對(duì)的上、下游引物以及試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)的上、下游引物的終濃度均為 200nM ； M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶終濃度I. 6U/ μ L ; TaqDNA聚合酶終濃度(λ 04U/ μ L ; MgCl2終濃度為2mM ; ARMS引物對(duì)的Taqman以及試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)的Taqman探針終濃度均為IOOnM ; 模板RNA終濃度0· 1~IOng/ μ L。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述ARMS引物對(duì)、Taqman探針的設(shè)計(jì)方法如下： (1)根據(jù)目的基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)ARMS引物對(duì)； (2)根據(jù)步驟（1)所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)ARMS弓丨物對(duì)的Taqman探針。
[0014] 步驟（1)中，ARMS引物對(duì)的上游引物或下游引物的3'末端為突變位點(diǎn)，并將位于 突變位點(diǎn)上游第1-2位進(jìn)行錯(cuò)義突變。
[0015] 步驟（2)中，ARMS引物對(duì)的Taqman探針為特異識(shí)別ARMS引物擴(kuò)增產(chǎn)物正義鏈的 Taqman 探針。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述ARMS引物對(duì)和探針在檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥 突變位點(diǎn)中的應(yīng)用，基于RT-Real-time PCR技術(shù)鑒定耐藥性突變位點(diǎn)，具體為： (1) 根據(jù)HIV-I病毒RNA的pol基因序列比對(duì)結(jié)果，選擇保守區(qū)域，利用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)和探針，提取模板RNA ; (2) 利用ARMS引物對(duì)和ARMS引物對(duì)的Taqman探針對(duì)提取的模板RNA進(jìn)行RT-Taqman qPCR檢測(cè)，并以試劑盒質(zhì)控品引物對(duì)和探針的擴(kuò)增結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0017] 優(yōu)選地，檢測(cè)試劑盒檢測(cè)艾滋病治療藥物3TC和FTC耐藥突變位點(diǎn)的反應(yīng)條件 為：
[0018] 該技術(shù)基于RT-Real-time PCR平臺(tái)，結(jié)合ARMS突變富集技術(shù)。利用ARMS引 物對(duì)突變靶序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，Taqman探針對(duì)